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Manual de Prácticas Fitopatología-ESAVF
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Manual de Prácticas Fitopatología-ESAVF

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  • 1. UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SINALOA UNIDAD REGIONAL NORTE ESCUELA SUPERIOR DE AGRICULTURA DEL VALLE DEL FUERTE MANUAL DE PRÁCTICAS DEL LABORATORIO DE FITOPATOLOGÍA ELABORADO POR: Ing. Jesús G. Loredo Vega Ing. Jorge Daniel Mena Adriano JUAN JOSÉ RÍOS, SIN. ENERO DE 2009
  • 2. INTRODUCCIÓN................................................................................................................3 1.1 IMPORTANCIA DE LAS PRÁCTICAS........................................................................3 1.2 DEFINICIÓN DEL MARCO DE ACCIÓN DEL LABORATORIO................................4 1.3 MATERIAS QUE APOYA............................................................................................4 2. CONDICIONES DEL LABORATORIO..........................................................................5 2.1 INFRAESTRUCTURA..................................................................................................5 2.2 PERSONAL ADSCRITO..............................................................................................5 2.3 EQUIPO........................................................................................................................6 2.4 MATERIALES..............................................................................................................6 2.5 REACTIVOS.................................................................................................................6 2.6 MEDIDAS DE SEGURIDAD........................................................................................7 3. REGLAMENTO..............................................................................................................7 3.1 ORGANIZACIÓN.........................................................................................................7 3.2 DERECHOS Y OBLIGACIONES.................................................................................8 3.2.1 LABORATORISTAS.................................................................................................8 3.2.2 PROFESORES..........................................................................................................8 3.2.3 ESTUDIANTES.........................................................................................................9 3.2.4 TESISTAS.................................................................................................................9 3.2.5 PERSONAS EXTERNAS..........................................................................................9 3.3 PROGRAMACIÓN DE PRÁCTICAS.........................................................................10 3.4 SANCIONES..............................................................................................................10 4.- RELACIÓN DE PRÁCTICAS.....................................................................................11 4.1 Nematología VI semestre.........................................................................................11 4.1.1 PRÁCTICA 1. OBSERVACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LOS NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS EN EL LABORATORIO.....................................................................11 4.1.2 PRÁCTICA 2. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DEL SUELO (ECTOPARÁSITOS)...........................................................................................13 4.1.3 PRÁCTICA 3. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DE LA RAÍZ (ENDOPARÁSITOS)..............................................................................................16 4.1.4 PRÁCTICA 4. MANIPULACIÓN DE NEMÁTODOS..............................................18 4.1.5 PRÁCTICA 5. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMÁTODOS..............20 4.1.6 PRÁCTICA 6. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS............................................................................................................22 4.2 Bacteriología y virología, VII semestre..................................................................24 4.2.1 PRÁCTICA 1. ESTERILIZACIÓN DE EQUIPO DE LABORATORIO Y DE MEDIOS DE CULTIVO....................................................................................................24 4.2.2 PRÁCTICA 2. ELABORACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.................................26 4.2.3 PRÁCTICA 3. MÉTODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS.......................28 4.2.4 PRÁCTICA 4. TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA DETERMINAR FORMA, TAMAÑO Y AGRUPACIÓN CELULAR...........................................................................................31 4.2.5 PRÁCTICA 5. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD..................................................32 4.2.6 PRÁCTICA 6. REACCIÓN DE KOH......................................................................34 4.2.7 PRÁCTICA 7. TINCIÓN DE CÁPSULA.................................................................35 4.2.8 PRÁCTICA 8. OBSERVACIÓN DE SÍNTOMAS CAUSADOS POR FITOBACTERIAS............................................................................................................37 4.3 Fitopatología General. IV semestre........................................................................40 4.3.1 PRÁCTICA 1. PREPARACIÓN Y MANEJO DE MEDIOS DE CULTIVO..............40 4.3.2 PRÁCTICA 2. AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATÓGENOS A PARTIR DE PLANTAS ENFERMAS...................................................................................................44
  • 3. 4.3.3. PRÁCTICA 3. ELABORACIÓN DE MONTAJES MICROSCOPICOS DE HONGOS FITOPATÓGENOS.........................................................................................47 4.3.4 PRÁCTICA 4. SÍNTOMAS CAUSADOS POR HONGOS FITOPATÓGENOS.....51 4.3.5 PRÁCTICA 5. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD DE HONGOS FITOPATÓGENOS..........................................................................................................53 4.3.6 PRÁCTICA 6. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE IMPORTANCIA AGRÍCOLA DE LA CLASE PHYCOMYCETES..................................................................................56 4.3.7 PRÁCTICA 7. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE IMPORTANCIA AGRÍCOLA DE LA CLASE DEUTEROMYCETES.............................................................................58 4.3.8 PRÁCTICA 8. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE IMPORTANCIA AGRÍCOLA DE LA CLASE ASCOMYCETES....................................................................................60 4.3.9 PRÁCTICA 9. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE IMPORTANCIA AGRÍCOLA DE LA CLASE BASIDIOMYCETES................................................................................62 4.3.10 PRÁCTICA 10 ELABORACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO..............................64 4.3.11 PRÁCTICA 11. MÉTODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS...................66 4.3.12 PRÁCTICA 12. TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA DETERMINAR FORMA, TAMAÑO Y AGRUPACIÓN CELULAR..........................................................................69 4.3.13 PRÁCTICA 13. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD..............................................70 4.3.14 PRÁCTICA 14. OBSERVACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LOS NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS EN EL LABORATORIO.....................................................................72 4.3.15 PRÁCTICA 2. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DEL SUELO (ECTOPARÁSITOS)...........................................................................................73 4.3.16 PRÁCTICA 16. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DE LA RAÍZ (ENDOPARÁSITOS)..............................................................................................76 4.3.17 PRÁCTICA 17. MANIPULACIÓN DE NEMÁTODOS..........................................78 4.3.18 PRÁCTICA 18. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMÁTODOS..........80 INTRODUCCIÓN 1.1 IMPORTANCIA DE LAS PRÁCTICAS La vinculación teoría-práctica es una necesidad ineludible en el proceso de enseñanza- aprendizaje de cualquier rama de las ciencias biológicas, premisa que se reproduce para el caso particular de las asignaturas que están estrechamente relacionadas con el departamento de parasitología. El presente manual se ha elaborado con fines didácticos y aplicaciones prácticas para que los estudiantes que estén cursando las materias afines, tengan las herramientas básicas para trabajar en el manejo de microorganismos, manejo de equipo y otros materiales en el laboratorio de fitopatología. De tal manera que se incluyen los procedimientos para el análisis de muestras de vegetales en la identificación y/o detección de agentes fitopatógenos, también se incluyen los pasos a seguir en la esterilización del material a utilizar por ejemplo cristalería y medios de cultivo, así como el manejo del material vegetal para lograr aislar al agente causal, pruebas para evaluar su patogenicidad e identificación, además se incluyen las diferentes fórmulas para la elaboración de medios de cultivo para tal fin. En el presente trabajo, siempre serán bien recibidas las críticas constructivas por parte de colegas y estudiantes para mejorarlo y/o actualizarlo de manera constante. 3
  • 4. 1.2 DEFINICIÓN DEL MARCO DE ACCIÓN DEL LABORATORIO El Laboratorio de Fitopatología de la Escuela de Agricultura del Valle del Fuerte, es un espacio donde se llevan a cabo distintas actividades como trabajos de investigación de tesitas, prestadores del Servicio Social, se les brinda apoyo a investigadores que imparten cursos de áreas afines con prácticas de laboratorio, se atiende a otras instituciones educativas sobre el funcionamiento del mismo, señalando que su actividad principal es atender las necesidades de enseñanza del plan de estudios de la E.S.A.V.F., para que los alumnos puedan realizar experimentos prácticos necesarios para comprobar los conocimientos teóricos que se les imparte en el aula y proporcionarles las herramientas para realizar aplicaciones reales de los conocimientos adquiridos. En el Laboratorio de Fitopatología se imparten prácticas relacionadas con la observación e identificación de microorganismos patógenos como: hongos, bacterias, nematodos, virus, etc. También se observan e identifican microorganismos no patógenos de cultivos que forman parte de la microflora del suelo. 1.3 MATERIAS QUE APOYA Plan 2 • Bacteriología y Virología • Conservación de Granos Almacenados • Cultivos I • Cultivos II • Dinámica de Enfermedades • Fitopatología Económica • Fruticultura Especial • Fruticultura General • Horticultura General • Micología • Microbiología de Suelos • Nematología • Protección Vegetal Plan 3 • Cultivos Básicos y Oleaginosas • Fitopatología General 4
  • 5. 2. CONDICIONES DEL LABORATORIO 2.1 INFRAESTRUCTURA El laboratorio de fitopatología cuenta con la infraestructura necesaria y el equipamiento suficiente para la observación e identificación de hongos, bacterias y nematodos fitopatógenos, y para cubrir las necesidades del mismo. AREA DE PRACTICAS PRINCIPAL Cuenta con cinco mesas de trabajo con cubierta de acero inoxidable cada una y un total de 45 sillas y 17 bancos de laboratorio, con un pintarrón, un televisor para presentación de imágenes, un herbario fitopatológico, cajonera para el resguardo de muestras del herbario, el laboratorio tiene una capacidad para 50 personas, un espacio apropiado para la campana de flujo laminar, con capacidad para cinco personas. Señalando que esta área cuenta con suministro de gas el cual se requiere para trabajos de muchas de las prácticas. ÁREA DE NEMATOLOGÍA Cuenta con tres mesas de acero inoxidable, dos lavamanos, una columna de Collman, centrifuga, una autoclave, archivero, vitrina para el resguardo de material, estante para libros y documentos, dos escritorios y una computadora. Con capacidad para 30 personas. ÁREA DE PREPARACIÓN DE PRÁCTICAS Cuenta con una mesa para preparación de prácticas, una vitrina para el resguardo de cristalería y microscopia, un lavamanos, una incubadora, una estufa Arnold, un microboy, un congelador, una vitrina para resguardo de reactivos, tres vitrinas chicas y un escritorio. Capacidad para 20 personas. 2.2 PERSONAL ADSCRITO LABORATORISTA (Turno matutino) Ing. Jesús G. Loredo Vega. Ingeniero agrónomo Parasitólogo egresado de la Escuela Superior de Agricultura del Valle del Fuerte generación 2002-2007. Profesor adscrito a esta área cubriendo el turno respectivo por el Ing. Hugo Beltrán Peña, quien se encuentra realizando un posgrado en el Colegio de Posgraduados Campus Montecillo, en Texcoco estado de México. LABORATORISTA (Turno vespertino) Ing. Julia E. Hernández Luna. Ingeniero agrónomo Parasitólogo egresada de la Escuela Superior de Agricultura del Valle del Fuerte, generación 1991-1996. Profesora adscrita a esta área cubriendo el turno vespertino. 5
  • 6. 2.3 EQUIPO MICROPLATE READER FOTOCOLORIMETRO PARA ELISA MODELO-STAT FAX 3200 SERIE 3200-2155 MARCA – AWARENESS TECHNOLOGY 08040952 51563 WESCO 52905 WESCO 52906 WESCO 52907 WESCO 72891 LEYCA 51559 WESCO 51562 WESCO 30123 ZEISS (1411J229923) 72890 LEYCA 141122970 ZEISS MICROSCOPIOS DE DISECCION 8615243 SWIFT 52901 WESCO 52903 WESCO 52902 WESCO 51561 WESCO 52904 WESCO MICROSCOPIO CON CAMARA DE VIDEO DIJI PLUS LABOMED También se cuenta con el equipo necesario para el aislamiento y purificación de microorganismos como campana de flujo laminar, microboy, y el equipo para la esterilización de materiales usados en las distintas prácticas de laboratorio. 2.4 MATERIALES El laboratorio de Fitopatología cuenta con el material suficiente para la realización de las prácticas de las asignaturas afines, algunos ejemplos de estos son: 2 Campanas de secado (p/nematodos) Vidrios de reloj Tubos de ensayo Matraces Erlen Meyer de varias medidas Pipetas Mecheros de alcohol Cajas Petri Vasos de precipitado Probeta graduada 2.5 REACTIVOS Los reactivos comúnmente usados en las prácticas del área de Fitopatología son: 6
  • 7. Agar nutritivo Alcohol Lacto fenol claro Lacto fenol azul Agar bacteriológico Agar papa dextrosa Agar agar Aceite de inmersión 2.6 MEDIDAS DE SEGURIDAD El laboratorio de fitopatología de la E.S.A.V.F., cuenta con las siguientes medidas de seguridad: 1 extintor 2 regaderas de emergencia 1 botiquín Señalamientos de seguridad 3. REGLAMENTO 3.1 ORGANIZACIÓN • La Escuela Superior de Agricultura del Valle del Fuerte dentro de su organización académico-administrativa cuenta con laboratorios para la docencia y la investigación. Estos son coordinados por el Coordinador de Prácticas y bajo su cargo se encuentran los responsables de cada laboratorio; podrán nombrarse becarios o brigadistas de servicio social como personal de apoyo. • Para cada uno de los laboratorios pueden estar como responsables profesores adscritos a la Institución; éstos desarrollarán actividades de docencia, investigación y difusión afines a las funciones del laboratorio que se le haya encargado. A su vez, los encargados deberán organizar sus actividades con el Coordinador de Prácticas. 7
  • 8. • Las tareas prioritarias de los laboratorios son la docencia e investigación; en el caso de difusión, esta deberá estar coordinada entre el Departamento de Difusión y la Coordinación de los Prácticas. 3.2 DERECHOS Y OBLIGACIONES 3.2.1 LABORATORISTAS • Los Responsables de laboratorio tendrán a su cargo el resguardo del material, equipo y reactivos; deberán mantener actualizados los inventarios correspondientes. • Es obligación del laboratorista portar la bata y otros accesorios definidos para su laboratorio. • El Responsable de laboratorio deberá preparar con la debida oportunidad los materiales, equipos y reactivos que sean necesarios para las actividades programadas de los laboratorios, con excepción de aquellas actividades destinadas exclusivamente para los tesistas. • El Responsable de laboratorio deberá inspeccionar, limpiar y guardar adecuadamente el equipo y materiales a su cuidado. De igual forma llevará el control para la reposición oportuna de material y equipos dañados, destruidos o faltantes. • Los Responsables de laboratorio podrán permitir la entrada a los laboratorios sólo a aquellos alumnos o profesores investigadores que presenten el programa de trabajo de laboratorios autorizado por el Coordinador de Prácticas y el Coordinador Académico. • Los Responsables de Laboratorio deberán coordinar y supervisar las actividades del los auxiliares de laboratorio (becarios y prestadores de Servicio Social) y otras personas externas. 3.2.2 PROFESORES • Es responsabilidad del profesor programar las prácticas y otras actividades que se desarrollarán en el(los) laboratorio(s) que corresponde(n) a cada uno de los grupos y/o tesistas que atiende, al inicio de cada semestre. • Cada profesor deberá portar la bata y otros accesorios correspondientes cuando realice actividades en el laboratorio. • Es responsabilidad del profesor, dar las instrucciones y la orientación de la actividad de laboratorio programada a los alumnos, tan clara y detalladamente como lo requiera la seguridad de los participantes y el alcance de los objetivos de la misma. • El profesor deberá estar presente en el laboratorio durante el desarrollo de las actividades que haya programado. • Las actividades de laboratorio para una asignatura determinada serán controladas y evaluadas por el profesor a cargo. • Los profesores que requieran para alguna actividad equipo especializado, deberán solicitarlo al Coordinador de Laboratorios y a la Coordinación Académica, quienes decidirán sobre su uso. 8
  • 9. 3.2.3 ESTUDIANTES • Los alumnos podrán entrar a los laboratorios exclusivamente dentro de la fecha y hora programada para la actividad y con la presencia del profesor responsable de la asignatura o del trabajo de investigación, salvo que exista un acuerdo entre el profesor y el laboratorista. • El alumno deberá realizar el trabajo de laboratorio con estricto apego a las disposiciones previamente establecidas por el asesor, el profesor, y/o el laboratorista responsable. Queda prohibido realizar cualquier otra actividad fuera del trabajo indicado y la indisciplina. • Es obligatorio para los alumnos: 3.2.3.1. Dejar su mochila en el sitio predestinado para ello. 3.2.3.2. Portar bata y ropa adecuada al ingresar a los laboratorios. 3.2.3.3. No fumar dentro de los laboratorios. 3.2.3.4. No introducir ni ingerir alimentos y/o bebidas en los laboratorios. 3.2.3.5. No utilizar celulares ni aparatos de sonido que perturben el desarrollo de la práctica. • Los alumnos realizarán el manejo de los materiales, equipo y reactivos con el cuidado y la responsabilidad necesarios para mantener su seguridad y la de los demás, así como para la mejor conservación de los mismos. • Los alumnos deberán entregar el material y equipo empleados en perfectas condiciones, limpio y funcional. En el caso de deterioro o faltante, se obliga a reponer el mismo en un plazo máximo de 15 días. • Los alumnos deberán entregar su reporte de prácticas en el lapso de cinco días hábiles al Responsable del Laboratorio. 3.2.4 TESISTAS • Los tesistas podrán realizar sus trabajos de investigación y/o actividades relacionadas en los laboratorios, siempre que tengan asignado un asesor y que se hayan programado sus actividades al inicio del semestre. • Los tesistas se obligan a preparar, utilizar adecuadamente, lavar, limpiar y guardar el material que requieran en el desarrollo de sus actividades. • Los tesistas podrán emplear el equipo especializado únicamente para estudios previamente autorizados por el responsable del laboratorio y/o del coordinador de laboratorios. Además el alumno será supervisado continuamente por el asesor y/o el profesor del estudio en cuestión. 3.2.5 PERSONAS EXTERNAS • En los laboratorios de la ESAVF podrán programarse actividades de docencia e investigación, previa autorización del Coordinador Académico, para personas externas a la institución tales como: tesistas, investigadores, profesores y estudiantes de intercambio, prestadores de servicio social, practicantes, residentes y visitas. 9
  • 10. • Las personas externas deberán ajustarse a la programación de sus actividades y tendrán todas las obligaciones relativas al uso, conservación y resguardo de los materiales utilizados. 3.3 PROGRAMACIÓN DE PRÁCTICAS • El profesor responsable de cada materia realizará la programación de sus prácticas al inicio de cada semestre ante el Coordinador de Prácticas. Para ello se tomarán en cuenta alguno o más de los siguientes criterios: • Horarios. Los horarios se definirán en función de las condiciones particulares de cada laboratorio y a las necesidades propias de las prácticas a desarrollar. • Número de estudiantes. Cada laboratorio determinará el número de estudiantes que pueden realizar simultáneamente una práctica. Cuando el número de estudiantes de un grupo exceda la capacidad de un laboratorio, se realizarán equipos de trabajo de manera coordinada entre el profesor y el laboratorista. • El Coordinador de Prácticas se reunirá con cada uno de los laboratorios para definir la programación de prácticas a cubrir durante el semestre que inicia. Una vez acordado el programa, dará seguimiento para asegurar el cumplimiento del mismo. • Las prácticas externas y visitas a los laboratorios estarán sujetas a la disponibilidad de espacios y horarios de cada laboratorio. Para ello se deberán solicitar a la Dirección de la ESAVF al menos con una semana de anticipación. 3.4 SANCIONES • El laboratorista que incumpla con sus obligaciones recibirá las sanciones administrativas correspondientes por las autoridades de la ESAVF. • El profesor que no programe las prácticas de su(s) materia(s) al inicio del semestre sólo podrá acceder a este servicio en los espacios que el laboratorio tenga fuera de la programación oficial. • Cuando un profesor y/o su grupo falte injustificadamente a una práctica programada, la práctica se dará por vista. • El alumno, interno o externo, que no cumpla con alguna de sus obligaciones, no tendrá derecho a uso del laboratorio por el tiempo que considere el responsable del laboratorio. 10
  • 11. 4.- RELACIÓN DE PRÁCTICAS Plan 2 4.1 Nematología VI semestre 4.1.1 PRÁCTICA 1. OBSERVACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LOS NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS EN EL LABORATORIO. INTRODUCCIÓN Los nemátodos son animales con una organización muy sencilla, que comprenden especies parasitas de plantas (Fitoparasitas), también existen nemátodos saprófagos (vida libre) que favorecen la descomposición de la materia orgánica, Omnívoros e incluso Depredadores, sin olvidar que hay nemátodos parásitos de animales (Zooparásitos), entre ellos los entomopatógenos que parasitan insectos y pueden emplearse en la lucha biológica contra las plagas. 11
  • 12. Estos nemátodos los podemos encontrar en todos los lugares; el mar, agua dulce, suelo y partes aéreas de las plantas; donde nos causan serios daños a las plantas cultivadas, sin embargo a menudo pasan desapercibidos por los técnicos y agricultores o sus daños son confundidos con otros factores; como la falta de fertilidad del suelo (deficiencias de nutrientes), escaso contenido de humedad, etc. Esto se debe fundamentalmente a su tamaño microscópico y a que viven en el suelo y/o el interior de las raíces de las plantas. OBJETIVOS: Que el alumno reconozca y aprenda a diferenciar los nemátodos fitoparásitos de los de vida libre en el laboratorio. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio de disección Microscopio biológico MATERIAL Vidrios de reloj Pipetas Agua DESARROLLO DE LA PRÁCTICA Usando los nemátodos disponibles en el laboratorio, se coloca en un vidrio de reloj una alícuota (2-5 mm) de la suspensión nemátodos-agua, enseguida se pasan al microscopio de disección para ser observados e identificar los nematodos fitoparásitos de los de vida libre. Y después se observan en el microscopio biológico. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA CEPEDA, S. M. (1995). Prácticas de nematología agrícola. ED; Trillas. México. 109 pp. 12
  • 13. 4.1.2 PRÁCTICA 2. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DEL SUELO (ECTOPARÁSITOS) INTRODUCCIÓN Las muestras traídas del campo tienen que ser procesadas en el laboratorio para obtener los nemátodos y observarlos con la ayuda del microscopio para su identificación y conteo. Hay nematodos fitoparásitos que se alimentan de las raíces como ectoparásitos, los que siempre estarán en el suelo; pero otros se introducen al sistema radical (endoparásitos) del cual se alimentan e incluso algunos se mueven hasta las partes áreas. El método de extracción será de acuerdo al tipo de nemátodos mencionados anteriormente. OBJETIVOS: Qué el alumno se adiestre en las diferentes técnicas para la extracción de nemátodos del suelo (nemátodos de vida libre y fitoparásitos). MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Centrífuga 13
  • 14. Microscopio de disección MATERIAL Muestras de suelo con nematodos Embudos de 10-15 mm de diámetro Tubos de goma Pinzas de presión Malla de alambre Papel filtro Etiquetas Probeta Cubeta de plástico Tamiz de 100 mallas por pulgada cuadrada. Tamiz de 325 mallas por pulgada cuadrada. Tamiz de 500 mallas por pulgada cuadrada. REACTIVOS Kaolín Sucrosa DESARROLLO DE LA PRÁCTICA PREPARACIÓN DE LA MUESTRA La muestra que se recogió en el campo se esparce sobre un pedazo de plástico, se desmenuzan los terrones, se eliminan las piedras y separamos las raíces para procesarlas posteriormente y extraer los nemátodos endoparásitos. Una vez mullido el suelo, se procede a homogenizarlo con el fin de que las submuestras formen una muestra compuesta, finalmente se distribuye en el plástico. MÉTODO DEL EMBUDO DE BAERMANN: Primero se coloca un tubo de goma (8-10 cm. de largo) al cuello de un embudo de 10-15 mm. de diámetro, enseguida se lavan ambos perfectamente y luego se coloca una pinza de presión en el tubo de goma para cerrar el paso del agua. Después se procede a llenar con agua hasta 1 cm. bajo del borde del embudo y se coloca el embudo en la gradilla. Enseguida se etiqueta con los datos necesarios como: # de muestra, hospedero, fecha y lugar de colecta Una vez que se ha hecho lo anterior, se procede a preparar una tela de alambre que de antemano esté amoldada al embudo, sobre ella se coloca un papel facial (kleneex) y luego la muestra de suelo (40-50 grs.), se envuelve la muestra y se humedece con una piceta, se coloca la tela de alambre sobre el embudo cuidando que esta toque el agua del embudo. Dejamos el embudo en reposo y a las 24 horas se sacan en un vaso de precipitado unos 10 ml. de agua. En ellos van los nemátodos parásitos y saprofitos que pasaron por el papel facial y la malla. Si se desea, se pueden observar directamente los nemátodos al microscopio de disección, esto se hace colocando unos 5 ml. de la suspensión en un vidrio de reloj, luego se observan. En caso contrario o después de realizado lo anterior, se procede a matarlos y fijarlos para su preservación por tiempo indefinido. 14
  • 15. MÉTODO COMBINADO (TAMIZ-EMBUDO DE BAERMANN): Del suelo distribuido en el plástico, se toman muestras en diversos puntos agregándose a una probeta que contiene 200 CC de agua hasta aforar a 300 CC. El contenido de la probeta se pasa a una cubeta A, con 4-5 lts. de agua, en la cual se siguen desmenuzando los terrones hasta que se disuelva bien el suelo. Se agita la solución y la dejamos reposar durante 15-30 segundos para que se sedimente el material pesado y los nemátodos permanezcan flotando. El contenido de la cubeta A, se pasa a través de un tamiz de 100 mallas por pulgada cuadrada a una cubeta B, en la cual se agita y la dejamos sedimentar para pasarlo por un tamiz de 325 (ó 500) y lo que queda en él se pasa al embudo de Baermann. MÉTODO DE FLOTACIÓN (TAMIZ-CENTRÍFUGA): Lo que queda en el tamiz de 325 ó 500 se pasa a un vaso de precipitado y se distribuyen los tubos de la centrifuga a los que previamente se les agregó 0.5-1.0 g de kaolín, el cual se mezcla bien y se centrifuga a 3000 rpm por 5 minutos, lo que permite la sedimentación de los nemátodos junto con las partículas de suelo (favorecido por el kaolín). Después se decanta el sobrenadante eliminando la materia orgánica suspendida. El sobrenadante eliminado se sustituye por solución sucrosa (45 g. de solución sucrosa o azúcar refinada en 100 CC. de agua destilada) y se mezcla con la muestra. Se centrifuga a 3000 rpm durante 2 minutos y el sobrenadante se pasa por el tamiz de 325 ó 500 mallas donde los nemátodos quedan retenidos procediéndose inmediatamente a lavarlos sumergiendo el tamiz en agua para eliminar el azúcar del cuerpo de los nemátodos. Con la ayuda de una piceta se pasan a un vaso de precipitado, quedando listo los nemátodos para hacer observaciones al microscopio y/o matarlos y fijarlos para estudios posteriores de identificación y conteo. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA PACHECO, A. J. (2000). Manual de prácticas de laboratorio de Nematología. Juan José Ríos, Sin; México. 20 pp. THORNE, G. (1961). Principles of nematology, MC. Graw-Hill book Co, New York, Estados Unidos. 553 pp. 15
  • 16. 4.1.3 PRÁCTICA 3. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DE LA RAÍZ (ENDOPARÁSITOS) INTRODUCCIÓN Paralelamente al grupo de los nemátodos ectoparásitos (es decir, aquellos que se alimentan externamente de la raíz y cuyo hábitat es el suelo), existe el grupo de los endoparásitos que se han adaptado a vivir dentro de los tejidos vegetales y que ya no dependen totalmente del ambiente del suelo, sino más bien de lo que ocurre en la planta. Así pues, podemos encontrar nemátodos desde la raíz, tallos y hojas hasta en las flores, frutos y semillas, y que constituyen un serio problema para la agricultura porque son un grupo mucho más peligroso que el anterior. Para la extracción de estos nemátodos, existen algunos métodos que por su sencillez y efectividad vale la pena conocerlos. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y realice los métodos de extracción más sencillos y prácticos que se conocen para extraer nemátodos endoparásitos. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO 16
  • 17. Microscopio de disección Licuadora MATERIAL Raíces infectadas por nematodos Navajas Embudos Tamiz 325 mallas por pulgada cuadrada Agujas de disección REACTIVOS Kaolín Sucrosa DESARROLLO DE LA PRÁCTICA OBSERVACIÓN DIRECTA: Se usa en raíces con agallamiento, se utilizan agujas de disección para desmenuzar las agallas y extraer hembras, juveniles, machos y masas de huevecillos de los nemátodos que causan agallas (Meloidogyne spp. y Nacobbus spp.). INCUBACIÓN: Las raíces previamente lavadas o el follaje son cortados en pequeñas piezas y se colocan en un recipiente con agua limpia dejándose reposar por unas 24-48 horas para que los nemátodos salgan de los tejidos. LICUADORA CENTRÍFUGA: Las raíces lavadas se licuan a alta velocidad durante un minuto y el licuado se centrifuga de igual forma que en la flotación para nemátodos ectoparásitos. EMBUDO DE BAERMANN: Se procede de igual forma que lo descrito para ectoparásitos, solo que aquí usamos en lugar de suelo, pequeñas piezas de raíces previamente lavadas. LICUADO-TAMIZADO: Lavar el material vegetal y cortar alrededor de 5 g. de raíces; los trocitos de raíz se colocan en una licuadora en 100 ml. de agua y licuar durante un minuto. El material licuado se pasa a través de un tamiz de 325 mallas, recogiendo el material en un vaso de precipitado. Después observar al microscopio de disección. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA GERARDO, A. M. (2002). Manual de prácticas de Micología. Juan José Ríos, Sin; México. 35 pp. 17
  • 18. 4.1.4 PRÁCTICA 4. MANIPULACIÓN DE NEMÁTODOS INTRODUCCIÓN La manipulación de los nematodos previo a su identificación y conteo una vez que han sido extraídos por las técnicas usadas en el laboratorio, es un proceso muy importante porque lleva implícitos el matado, fijado y pesca de estos organismos. OBJETIVOS: Que el alumno conozca las técnicas de manipulación más usadas para realizar la identificación y conteo de nematodos en un análisis nematológico de una muestra. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio de disección MATERIAL Vidrio de reloj Lámpara de alcohol Pipetas Palillos de bambú Vasos de precipitado 18
  • 19. Tubos de ensayo Portaobjetos REACTIVOS Agua Fijador FA. 4:10 DESARROLLO DE LA PRÁCTICA MATADO: Existen varios métodos para realizar el matado de los nemátodos pero todos ellos lo hacen tratando de evitar su distorsión. Hay 2 formas generales para realizar esta operación, ellas son: MATADO EN VIDRIO DE RELOJ: Se coloca en un vidrio de reloj una alícuota de la suspensión nemátodos-agua y enseguida se expone durante 12 segundos a la flama de una lámpara de alcohol. Después se observan al microscopio de disección para verificar su muerte. MATADO EN MASA: Se pone a calentar agua en un vaso de precipitado de 500 ml., cuando alcance una temperatura de 60 ºC se retira de la flama y se introduce durante 3-4 minutos el recipiente (tubo de ensayo) que contiene 10 cc. de agua con nemátodos. También se puede matar dejando hervir el agua introduciendo el tubo de ensayo durante un minuto. FIJACIÓN: Una vez que los nemátodos han sido matados, se deja enfriar el agua con nemátodos y se le agrega el fijador (FA. 4:10) en una porción de 1:1. Fijador FA. 4:10 Formol al 40%.................... 10 CC. Acido glacial acético............10 CC. Agua destilada.....................10 CC. Nota: Con este fijador los nemátodos rara vez se distorsionan, pero tienden a tornarse café y la parte posterior del estilete de los Tylenchidos se vuelven transparentes después de unos cuantos días. PESCA DE NEMÁTODOS: Después de la extracción, matado y fijación de los nemátodos, es necesario que sean trasladados a un portaobjetos con una gota de agua para observarlos, estudiar sus características e identificación bajo el microscopio biológico. El traslado se hace siempre de uno en uno con la ayuda de una varita de bambú con la punta bien adelgazada. La técnica para pescar nematodos es la siguiente: 1.- En el centro de un portaobjetos se deposita una gota de agua. 2.- Se coloca una alícuota de la suspensión agua-nemátodos matados y fijados en un vidrio de reloj y se observan bajo el microscopio estereoscópico. 19
  • 20. 3.- Se localiza un nematodo en el fondo del vidrio de reloj y con la ayuda de la varita de bambú se lleva al nematodo hacia la superficie lentamente y una vez en la superficie, se saca rápidamente y se coloca en la gota de agua del portaobjetos. 4.- Nuevamente se busca otro nemátodos y se sigue el mismo procedimiento hasta trasladar por lo menos 5 nemátodos al portaobjetos. 5.- Se coloca un cubreobjetos a la gota de agua con nemátodos. Enseguida se observa al microscopio biológico. 6.- Se estudian las características de cada nematodo para su identificación y su posterior cuantificación. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA PACHECO, A. J. (2000). Manual de prácticas de laboratorio de Nematología. Juan José Ríos, Sin; México. 20 pp. THORNE, G. (1961). Principles of nematology, Mc. Graw-Hill book Co, New York, Estados Unidos. 553 pp. 4.1.5 PRÁCTICA 5. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMÁTODOS INTRODUCCIÓN En nemátodos fijados muchos de los detalles internos del cuerpo, especialmente gónadas, pueden ser obscurecidas por la apariencia granular del intestino. Los especimenes pueden ser aclarados procesándolos a lactó fenol ó glicerina, los cuales son medios de montaje apropiados. Además es muy importante con fines académicos o de investigación al conservar preparaciones permanentes de nemátodos. OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar preparaciones permanentes de nemátodos para su conservación. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Estufa Arnold MATERIAL Campana deshidratadora Vidrio de reloj Pelo de ángel Portaobjetos 20
  • 21. Cubreobjetos REACTIVOS Etanol 96% Glicerina Agua destilada Lacto fenol Cloruro de calcio DESARROLLO DE LA PRÁCTICA Transferir nemátodos del fijador a un vidrio de syracuse o de reloj que contenga 0.5 ml. de la siguiente solución: Solución I: Etanol 96%.................... 20 partes Glicerina........................ 1 parte Agua destilada.............. 79 partes Colocar el vidrio de reloj es una campana deshidratadora que contiene 1/10 de su capacidad con etanol 96% y déjelo cuando menos durante 12 horas en una estufa a 35-40 ºC. Esto permite que se elimine casi toda el agua y deja a los nemátodos en una mezcla de glicerina y etanol. Llene el vidrio de reloj con la solución II (5 partes de glicerina y 95 partes de etanol 96%) y parcialmente cerrado, colóquelo durante 3 horas en una estufa a 40 ºC para que se evapore lentamente el etanol hasta que los nemátodos queden en glicerina pura. Los nemátodos así deshidratados son transferidos a una gota de glicerina pura (purificarla dejándola en un recipiente abierto en una campana deshidratadora que contenga cloruro de calcio) en un portaobjetos, se colocan 2 tiras de pelo de ángel, después se coloca un cubreobjeto y el borde de éste se sella con esmalte de uñas transparentes. Se colocan etiquetas adhesivas al portaobjeto con los siguientes datos: 1.- Nombre científico 2.- Localidad 3.- Hospedante 4.- No. de hembras y machos 5.- Colector 6.- Fecha INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA YEPEZ, T. G. (1972). Los nemátodos enemigos de la agricultura, Imprenta Universidad de Caracas; Universidad Autónoma de Venezuela, Facultad de Agronomía. Venezuela. 220 pp. 21
  • 22. 4.1.6 PRÁCTICA 6. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS INTRODUCCIÓN Los nemátodos fitoparásitos abarcan un gran número de géneros y especies de gran importancia agrícola. El conocimiento de la sintomatología, morfología, biología y control es de interés fundamental para el parasitólogo. El control de los nemátodos fitoparásitos, se basa en una identificación correcta del nematodo en cuestión, de ahí que sea importante conocer las características morfológicas más importantes de los principales géneros de estos patógenos. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y diferencie las características morfológicas de los principales géneros de nemátodos fitoparásitos de importancia agrícola. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio biológico 22
  • 23. MATERIAL Suelo con nemátodos Montajes permanentes Portaobjetos DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 1.- Elaborar montajes a partir de material vegetal enfermo o suelo procesado, los montajes se harán siguiendo la metodología descrita anteriormente. 2.- Usando los montajes permanentes disponibles en el laboratorio, observar al microscopio biológico los especimenes, con los objetivos 10x y 40x. 3.- Dibujar cada espécimen cuidadosamente, resaltando las características más importantes: forma, tamaño, tipo de estilete, tipo de esófago, unión del bulbo basal con el intestino, posición de la vulva, tipo de cola, características del sistema reproductor de la hembra, etc. 4.- Se estudiarán los siguientes géneros: -Meloidogyne -Heterodera -Globodera -Punctodera -Nacobbus -Xiphinema INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA CEPEDA, S. M. (1995). Prácticas de nematología agrícola. ED; Trillas. México. 23
  • 24. 4.2 Bacteriología y virología, VII semestre. 4.2.1 PRÁCTICA 1. ESTERILIZACIÓN DE EQUIPO DE LABORATORIO Y DE MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCIÓN El microbiólogo y el fitopatólogo necesitan frecuentemente trabajar con materiales y equipos estériles, en el caso de medios de cultivo la esterilidad es obligada antes de usarlos. La esterilización es el proceso mediante el cual se obtienen sustancias o materiales libres de organismos vivos. Los métodos de esterilización pueden ser químicos o físicos. Entre los métodos físicos se encuentra el calor, las radiaciones y la filtración. El método químico incluye el uso de gases o sustancias líquidas con propiedades biocidas. OBJETIVOS: Que el alumno comprenda el concepto de esterilización y aprenda a utilizar los aparatos usados en el laboratorio para este fin. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Autoclave Estufa Arnold MATERIAL Medio de cultivo Agua Cajas Petri Tubos de ensayo Pipetas Matraces Morteros Probetas REACTIVOS Medio de cultivo Agua 24
  • 25. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO 1). Revise que el agua se encuentre al nivel de la rejilla basal. 2). Introducir el material a utilizar. 3). Cierre el recipiente correctamente. 4). Abra la válvula de escape para que salga el aire seco y encienda la olla de presión. 5). Un minuto después de que empieza a salir el aire y vapor, cierre la válvula de escape. El tiempo de esterilización se empieza a contar hasta que la aguja alcance 15 libras/pulgada cuadrada. 6). Mantenga el aparato de 15-20 libras durante el tiempo deseado, regulando la flama del mechero. 7). Concluido el tiempo de esterilización, apague el aparato, espere a que baje a cero presión antes de sacar con cuidado el material caliente. ADVERTENCIA: nunca deje el aparato encendido sin vigilancia. ESTERILIZACION CON CALOR SECO 1). Deposite el material seco y limpio en la estufa. 2). Cierre perfectamente y encienda el interruptor. 3). Ajuste el regulador a la temperatura deseada, cheque la temperatura con el termómetro y cuente el tiempo de esterilización cuando se alcance la temperatura requerida (100-180 oC). 4). Concluido el tiempo de exposición, apague el aparato. ADVERTENCIA: no saque cristales muy calientes de la estufa, pues al contacto con el aire frío o caliente se revientan. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Echando, E. 1971 Manual de Laboratorio para Fitopatología General, Herrera Hermanos. Sucesores. 89 pp. López, A. G. F. 1979. Manejo de hongos fitopatógenos. Departamento de Parasitología Agrícola. UACH. 135 pp. Diversos textos de microbiología: Bryan, Burdon. Pelckzar, etc. 25
  • 26. 4.2.2 PRÁCTICA 2. ELABORACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCIÓN Para el cultivo in Vitro de fitobacterias se requiere de la elaboración de un medio que proporcione todos los requerimientos nutricionales que permitan su reproducción, los cuales se les conoce como medios de cultivo. Los medios de cultivo contienen cuatro componentes esenciales: fuentes de carbono y nitrógeno, minerales y vitaminas. Existe una gran variedad de de fuentes de carbono que se pueden emplear en los medios de cultivo como son: alcoholes, pentosas, hexosas, disacáridos, trisacáridos, polisacáridos, ácidos e hidroxiácidos ya sean solos o en combinación. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a elaborar medios de cultivo para el aislamiento de bacterias fitopatógenas. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Autoclave Agitador magnético MATERIAL Agar Nutritivo Agua destilada Caseína hidrolizada Peptona Glucosa Extracto de carne Sacarosa DESARROLLO DE LA PRÁCTICA AGAR NUTRITIVO Agar nutritivo 23 g Agua destilada 1000 ml Disolver el agar nutritivo en el agua, si desea puede dividir el líquido en dos matraces. Esterilizar en autoclave a 115 lbs/pulgada cuadrada durante 15 minutos y vaciar en cajas de Petri. Este medio generalmente se emplea para aislamientos de material vegetal. Es un medio útil para el aislamiento de especies de Xanthomonas. 26
  • 27. MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES (TTC) Peptona 10 g Caseína hidrolizada 1.0 g Glucosa 5.0 g Agar 12 g Agua 1000 ml Ajustar el ph a 7 y esterilizar en la forma normal, cuando el medio alcance una temperatura de aproximadamente 45-50 0C adicionar solución acuosa de cloruro de tetrazolio al 1.0% para dar una concentración final de 0.005%. Con este medio de cultivo se pueden detectar las colonias virulentas y avirulentas de Ralstonia solanacearum y P. s. p.v. phaseolicola. En el primer caso las colonias virulentas son blancas, fluidas, con centro rojo y para la segunda bacteria las cepas virulentas forman colonias rojas y las avirulentas son blancas. MEDIO PARA LA PRODUCCION DE LEVANA Extracto de carne 3g Peptona 10 g Sacarosa 50 g Agar 20 g Agua 1000 ml Disuelva los ingredientes, esterilice en la forma convencional y vacíe en cajas esterilizadas. MEDIO DE GELATINA Extracto de carne 3.0 g Peptona 5.0 g Gelatina 120.0 g Agua 1000 ml La gelatina se adiciona al agua y se deja hidratar durante 15 a 30 minutos y luego se calienta para disolver la gelatina; posteriormente agregar y disolver los otros constituyentes. Ajustar el ph a 7, vaciar a tubos y esterilizar a 120 0C durante 20 minutos. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Agrios, GN. 2007. Fitopatología. LIMUSA, México. 285-288 p. Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriología “Bacterias fitopatógenas” INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados. 27
  • 28. 4.2.3 PRÁCTICA 3. MÉTODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS INTRODUCCIÓN El cultivo puro, es una condición artificial en el crecimiento de bacterias bajo condiciones de laboratorio. Para determinar las características de una especie bacteriana en particular, es imperativo que el organismo sea aislado y multiplicado en laboratorio en cultivo puro. Existe una variedad de técnicas para el aislamiento y desarrollo de bacterias como son: técnica de estría cruzada y la de vaciado en placa. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a realizar las técnicas para el aislamiento y obtención de cultivos puros de bacterias fitopatógenas. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Cámara de flujo laminar o microboy MATERIAL Medio de cultivo Cajas Petri Lámpara de alcohol Asa bacteriológica Material vegetal enfermo Navajas o bisturí Tubos de ensayo Agua destilada estéril DESARROLLO DE LA PRÁCTICA Técnica de estría cruzada. Con el asa bacteriológica previamente flameada y enfriada, se toma una gota de suspensión bacteriana del tubo de ensayo. Se procede a realizar un estriado (4 o 5 “rayas”) en la caja de Petri. A partir de la ultima “raya” del estriado # 1, se comienza a rayar el estriado # 2, esto se repite 4 ó 5 veces cuidando de no tocar mas que la ultima raya del estriado anterior. Todo esto se realiza en el microboy previamente desinfectado y con la ayuda de una lámpara de alcohol. Al terminar se sellan las cajas y se incuban a 28 grados centígrados Durante 24-48 hrs. Técnica de vaciado en placa. Para lograr tener colonias separadas por esta técnica, primeramente se debe hacer una suspensión (que se puede lograr al suspender el material vegetal enfermo en agua esterilizada o en medio de cultivo líquido). De esta suspensión se toma una gota ó 0.5 ml y se transfieren a otro tubo ó matraz con medio de cultivo con agar líquido. Esta operación se repite 2 ó 3 veces más, teniendo cuidado de agitar los tubos antes de hacer la transferencia. Inmediatamente después de cada dilución, el contenido de cada uno de los tubos se traslada a una caja Petri estéril y después del periodo de incubación se obtendrán colonias separadas. 28
  • 29. AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN Uno de los requisitos para considerar a una bacteria como el agente inductor de una enfermedad, es aislarla y purificarla a partir del tejido enfermo. Para llevar a cabo esta etapa existen diferentes metodologías y la elección de cualquiera de ellas dependerá del tipo de síntoma, órgano afectado, grado de avance de la enfermedad y del material y equipo disponibles. Entre las técnicas de aislamiento más comunes, se encuentran las siguientes: AISLAMIENTO DIRECTO (Para muestras con marchites) PROCEDIMIENTO 1. Con una navaja flameada y enfriada, haga un corte transversal al tallo que presente flacidez incipiente, de preferencia cerca del nivel del suelo. 2. Haga una ligera presión y espere unos segundos para que de los haces vasculares salga un exudado bacteriano. 3. Con el asa previamente flameada y enfriada, tome del exudado y transfiéralo a un tubo con agua destilada estéril. 4. Agite el tubo para homogeneizar. 5. Con el asa flameada tome una gota de la suspensión y siembre una caja con medio de cultivo por el método de estría cruzada. 6. Incube a 28 0C por 24-48 horas. INMERSIÓN DEL TEJIDO EN AGUA ESTERIL (Para muestras con manchas o tizones) PROCEDIMIENTO 1. Al microscopio estereoscópico observe los tejidos afectados, para detectar la presencia de exudados, escamas bacterianas, micelio u otras estructuras fungosas. 2. De la zona de avance de la enfermedad haga una preparación en fresco y observe al microscopio compuesto. 3. Si en estas preparaciones observa únicamente células bacterianas, esto le indica que el síntoma se puede deber a bacterias, por el contrario, si observa micelio, lo más seguro es que el síntoma sea ocasionado por un hongo. 4. Seleccione tejido enfermo y lávelo con agua estéril. 5. Corte pequeños trocitos y desinféctelos con una solución de hipoclorito de sodio al 1% durante 1 a 2 minutos. 6. Decante el hipoclorito de sodio y lave 3 veces con agua esterilizada. 7. Una vez transcurridos los 5 ó 10 minutos, tome una gota de la suspensión con el asa bacteriológica y siembre con estría cruzada una caja con medio de cultivo. 8. Después del periodo de incubación seleccione las colonias bacterianas que se asemejen a las del agente causal, y siémbrelas una nueva caja con medio de cultivo para obtener así, suficiente cultivo puro y continuar con las pruebas de patogenicidad. 29
  • 30. INMERSIÓN DEL TEJIDO EN AGUA ESTERIL (Muestra con sobrecrecimiento) PROCEDIMIENTO 1. Con un cepillo pequeño y cerdas suaves lave al chorro del agua la agalla o tejido con fasciación y luego haga unas fracciones. 2. Coloque los cortes en un tubo con 3 ml de agua destilada estéril y manténgalos así durante unos 10-20 minutos. 3. Pase 3 asadas de la suspensión anterior a otro tubo con 3 ml de agua estéril. 4. Siembre 2 cajas con medio de cultivo por estría cruzada. 5. Incube a 22-28 0C durante 2-4 días. 6. Seleccione las colonias bacterianas con características del posible patógeno y transfiera a las otras cajas con medio de cultivo. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Rodríguez, M. M. 2001 Manual de prácticas de bacterias fitopatógenas. DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA AGRICOLA. Universidad Autónoma de Chapingo. 30
  • 31. 4.2.4 PRÁCTICA 4. TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA DETERMINAR FORMA, TAMAÑO Y AGRUPACIÓN CELULAR INTRODUCCIÓN Como las células bacterianas son incoloras, se requiere del empleo de colorantes para hacerlas más nítidas al microscopio, para lo cual se pueden emplear técnicas de coloración simples o diferenciales. Tinción simple. El azul de metileno de Loeffler es uno de los reactivos más valiosos que se tienen para la tinción de bacterias. Es excelente para las bacterias del género Curtobacterium donde puede demostrar el perlado y los gránulos. En los bacilos esporulados (Bacillus), teñidos con este reactivo, las esporas aparecen como cuerpos no teñidos dentro de células azules. Tinción diferencial. Una de las técnicas más ampliamente utilizadas es la “Tinción de Gram.”, porque no solo permite determinar la forma y agrupación de las bacterias, sino también es de considerable valor en la identificación y clasificación, al separar a las bacterias en gram negativas y gram positivas. OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a utilizar los reactivos para llevar a cabo las distintas técnicas de coloración de bacterias. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio biológico MATERIAL Cultivo bacteriano Asa bacteriológica Agua alcohol Azul de metileno Portaobjetos Lámpara de alcohol Cristal violeta Lugol Safranina INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriología “Bacterias fitopatógenas” INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados. 31
  • 32. 4.2.5 PRÁCTICA 5. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD INTRODUCCIÓN Cuando una planta, supuestamente infectada por una bacteria, es traída al laboratorio, se procede al aislamiento en medio artificial de cultivo según la técnica usual. No obstante, los resultados del aislamiento precisan ser interpretados con cautela, pues: a) las colonias desarrolladas en la caja de Petri pueden ser bacterias saprofitas, por lo que la enfermedad puede no ser provocada por estas bacterias. b) aparecen en la caja, colonias de bacterias patogénicas y saprofitas las cuales no se diferencian por su aspecto. c) las colonias obtenidas, aunque sean de bacteria patogénica, se presentan avirulentas o perdieron por alguna razón, la patogenicidad. La demostración de la patogenicidad de una cepa bacteriana es un procedimiento complicado que requiere mucho tiempo para que aparezcan los síntomas típicos de la enfermedad en a planta homóloga. En la mayoría de las ocasiones no siempre se dispone de este material, siendo más difícil, aún, cuando se tratan de árboles o plantas que no se encuentran en la región. Existen pruebas de patogenicidad como la reacción de hipersensibilidad, pudrición del tubérculo de papa, inoculación a frutos verdes de peral o manzano las cuales se describen a continuación. OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar pruebas de patogenicidad de bacterias fitopatógenas. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio biológico Incubadora MATERIAL Material vegetal enfermo Agua estéril Alcohol Cajas de Petri Papel filtro DESARROLLO DE LA PRÁCTICA PUDRICIÓN DEL TUBERCULO DE PAPA Para bacterias aisladas de órganos con pudrición, la patogenicidad se puede valorar con la prueba de pudrición del tubérculo de papa y los resultados se pueden observar a las 24 horas de haberse realizado. 32
  • 33. PROCEDIMIENTO Un tubérculo de papa de preferencia de la variedad Alpha, se lava, se seca y se desinfecta superficialmente, bañándolo con etanol al 70%, seguido de un flameado (evite adicionar mucho alcohol porque al quemarse podrá dañar las capas externas del tubérculo y se correrá el riesgo de contaminación por bacterias esporuladas como Bacillus spp. De estos tubérculos se cortan rebanadas de 5mm de grosor y se colocan en cajas de Petri con papel filtro (previamente esterilizado) se pueden acomodar dos rebanadas por caja y una de ellas servirá de testigo. A cada una de las rebanadas se les hace una insición superficial y solo en una de ellas se pone crecimiento de la bacteria a probar. Finalmente se le adicionan unos 2-3 mm de agua estéril solo para humedecer el papel y crear un ambiente húmedo, se incuban a 28 0C durante 24-72 horas. A partir de las primeras 24 horas, se palpa el tejido de cada una de las rebanadas y si la que ha sido inoculada, se siente blanda, indica que la bacteria probada sintetiza enzimas pectolíticas y es muy probable que sea el agente causal de la pudrición. Al igual que la prueba anterior, también sirve para diferenciar especies y pato vares de Pseudomonas fluorescentes. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Agrios, GN. 2007. Fitopatología, LIMUSA. México. 35 p. 33
  • 34. 4.2.6 PRÁCTICA 6. REACCIÓN DE KOH INTRODUCCIÓN La determinación del Gram de las bacterias, también se puede realizar de una forma más rápida y sencilla, empleando únicamente solución acuosa de KOH al 3%, la cual resulta ser una prueba rápida y muy sencilla en la que no influye la edad del cultivo con los resultados como sucede con la tinción de Gram y el procedimiento es como sigue: OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a realizar la prueba de reacción de KOH, para diferenciar a las bacterias gram negativas de las gram positivas. MATERIAL REQUERIDO MATERIAL Asa bacteriológica Cultivo bacteriano Portaobjetos REACTIVOS Hidróxido de potasio DESARROLLO DE LA PRÁCTICA a) En un portaobjetos limpio coloque una gota de KOH. b) Del cultivo bacteriano puro, tome una asada. c) Mezcle el cultivo con el hidróxido durante unos segundos y levante lentamente el asa. d) Si se forma un hilo, la reacción se considera positiva y significa que la bacteria pertenece al grupo de las gram negativas. Por el contrario si después de unos minutos no se forma el hilo, la bacteria es un miembro de las Gram positivas. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriología “Bacterias fitopatógenas” INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados. 34
  • 35. 4.2.7 PRÁCTICA 7. TINCIÓN DE CÁPSULA INTRODUCCIÓN La cápsula es una capa gelatinosa y mucoide cuyo espesor puede ser escaso o por el contrario, importante, hasta el punto de duplicar el volumen de la bacteria. Este material no solamente no existe en todas las bacterias, sino que en las especies capsuladas puede no estar siempre presente. Su desarrollo se favorece cuando la bacteria se cultiva en medios con alto contenido de carbohidratos o cuando se multiplica dentro del hospedante. OBJETIVOS: Que el alumno sea capaz de utilizar los reactivos para la coloración de la cápsula bacteriana y mejorar su observación al microscopio. MATERIALES REQUERIDOS EQUIPO Microscopio biológico MATERIAL Portaobjetos Lámpara de alcohol REACTIVOS Fuccina Etanol Mordente de Muir Azul de metileno Agua estéril DESARROLLO DE LA PRÁCTICA a) Se hace un frotis de la bacteria y se fija al aire. b) La laminilla se cubre con fuccina fenicada fuerte y se calienta ligeramente durante 1 minuto. c) El frotis se lava rápidamente con etanol, y después se lava perfectamente con agua. d) Se cubre con el mordente de Muir durante 30 seg. e) Lave con agua y posteriormente con etanol durante 30 segundos ó hasta que el frotis tome un color rojo pálido. f) Lave perfectamente con agua. g) Tiña con azul de metileno de Loeffler durante 30 segundos. h) Lave con agua y deje secar. i) Observe al microscopio compuesto, las bacterias se tiñen de rojo y las capsulas de azul. 35
  • 36. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriología “Bacterias fitopatógenas” INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados Rodríguez, M. M. 2001 Manual de prácticas de bacterias fitopatógenas. DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA AGRICOLA. Universidad Autónoma de Chapingo. 36
  • 37. 4.2.8 PRÁCTICA 8. OBSERVACIÓN DE SÍNTOMAS CAUSADOS POR FITOBACTERIAS INTRODUCCIÓN Las bacterias fitopatógenas ocasionan el desarrollo de casi tantos tipos de síntomas en las plantas que infectan como los que producen los hongos. Producen manchas y tizones foliares, pudriciones blandas de frutos, raíces y órganos almacenados, marchitamientos, crecimientos excesivos, sarnas, cancros etc. Cualquiera de estos tipos de síntomas puede ser producido por las bacterias patógenas de varios géneros y cada género contiene algunos patógenos capaces de producir diferentes tipos de enfermedades. Sin embargo, las especies de Agrobacterium, sólo producen crecimientos excesivos o proliferación de los órganos. Por otra parte, los crecimientos excesivos también pueden ser producidos por ciertas especies de Corynebacterium y Pseudomonas. Asimismo, las dos especies fitopatógenas de Streptomyces, sólo producen sarnas o lesiones en los órganos subterráneos de las plantas. Las especies de Rhizobium inducen la formación de nódulos en las raíces de las leguminosas. Los síntomas pueden indicar la existencia de una enfermedad, pero ellos no son en sí la enfermedad, estos son utilizados como guías para diagnosticar la naturaleza o causa de una enfermedad en particular. Entre las enfermedades bacterianas encontramos variados tipos de síntomas, los cuales son divididos en cuatro categorías: 1. Cambios de color: Alteraciones presentes en los plastidios, vacuolas o cloroplastos dando como consecuencia: Clorosis: Retardamiento o disminución de la clorofila por anormalidades en los cloroplastos. Amarillamiento: Disminución de clorofila e incremento de carotenos y xantofilas. Antocianocencia: coloración púrpura como resultado del incremento del pigmento antocianina. 2. Desintegración de tejidos: Son ocasionados por la acción enzimático o toxinas que producen los patógenos sobre la pared del hospedante y/o afectando el protoplasma celular. Pudrición: áreas muertas debido a la maceración de tejidos con presencia de exudados bacterianos. Esta pudrición puede ser de consistencia seca o húmeda. Cancro: Necrosis restringida en los tejidos corticales de tallos y raíz con crecimiento secundario, usualmente delimitado por tejido sano. Necrosis: Áreas donde las células sufren primeramente plasmólisis, colapso y la muerte. En ocasiones éstas áreas presentan una coloración oscura o castaña debido a la producción de melaninas. 37
  • 38. Tizón: Desintegración rápida de los tejidos seguida por la muerte celular, esta puede ser parcial o total del hospedante (producción de toxinas) también definida como lesiones de crecimiento indeterminado. Mancha: Necrosis localizada en cualquier parte de la planta. 3. Desarrollo anormal del crecimiento: Ocasionado por alteraciones en las sustancias reguladoras del crecimiento ya sea aumentando o disminuyendo su concentración. Agalla: desarrollo anormal donde las células dañadas sufren el fenómeno de Hiperplasia (multiplicación excesiva de las células) o Hipertrofia (aumento de tamaño de las células). Fasciación: proliferación excesiva de brotes como consecuencia de la Hipoplasia (poca división celular), presentándose la planta como arrosetada. 4. Daños al sistema vascular Marchitez: Flacidez o pérdida de turgencia de la planta debido al taponamiento de los vasos que conforman este sistema, ya sea por estructuras del patógeno, sustancias que las bacterias producen o estructura del tejido vegetal. OBJETIVOS: Que el alumno sea capaz de diferenciar la sintomatología de enfermedades de importancia en plantas causadas por bacterias. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio biológico MATERIAL Agua destilada estéril Portaobjetos Material vegetal enfermo Navajas DESARROLLO DE LA PRÁCTICA a). Identificar los distintos tipos de síntomas ya señalados, usando para ello las muestras de material vegetal enfermo que le proporcione el instructor. b). Describir en forma sencilla al menos un tipo de síntoma característico de cada enfermedad. En cada caso, indique el patógeno y el nombre común de la enfermedad. Por ultimo señalar como diferenciar síntomas de enfermedades causadas por bacterias y hongos y discutir que tan confiable resulta la identificación de las enfermedades en base a la observación de síntomas. 38
  • 39. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Agrios, G. N. 2007. Fitopatología. LIMUSA Wiley, México. pp 540-541 Bauer, L. I. 1984. Fitopatología. LIMUSA. Colegio de Postgraduados. 39
  • 40. Plan 3 4.3 Fitopatología General. IV semestre. 4.3.1 PRÁCTICA 1. PREPARACIÓN Y MANEJO DE MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCIÓN Los medios de cultivo son mezclas de sustancias que se usan para el aislamiento y desarrollo de hongos, bacterias y otros microorganismos. Cabe señalas que la mayoría de los hongos fitopatógenos se pueden cultivar de manera relativamente sencilla en medios adecuados. Sin embargo existen grupos de patógenos denominados parásitos obligados cuyo cultivo aún no se a logrado a menos que se inoculen en plantas vivas. Los medios de cultivo requieren de ciertas características mínimas para lograr exitosamente el desarrollo de los hongos y entre los más importantes se encuentran: 1. El medio deberá contener elementos nutritivos tales como: fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio, cobre y molibdeno. También pueden ser necesarias algunas vitaminas y otras sustancias que se hallan presentes en los materiales naturales o artificiales que componen los medios. 2. El medio no deberá deshidratarse fácilmente, por que se evita manejándolo en recipientes adecuados que además permitan su manejo en condiciones estériles es decir, evitando contaminaciones. El oxigeno es necesario en todos los casos por lo que deberá permitirse la aireación. Ya sea en las cajas de Petri o en tubos de cultivo. 3. La mayoría de los medios de cultivo para hongos requieren esterilización antes de usarse, lo que generalmente se logra mediante calor húmedo usando autoclave u olla Express. 4. La mayoría de los hongos crecen bien a temperatura de 20 a 32 oC, pero existe mucha variación entre grupos o especies. La temperatura óptima para el desarrollo de la enfermedad que causen puede servir como punto de referencia para la temperatura de incubación del hongo en el medio de cultivo. 5. La mayoría de los hongos crecen bien a ph de 5 a 6, pero hay excepciones. La temperatura y/o Ph óptimo para la esporulación puede ser distinto que para el crecimiento del micelio. En ocasiones es conveniente agregar pequeñas cantidades de ácido láctico para eliminar bacterias contaminantes en el medio, pues estas generalmente no toleran la acidez, permitiendo el crecimiento fungoso. 6. El crecimiento del micelio y sobre todo la esporulación de los hongos en el medio, esta muy influido por la luz. Muchos hongos esporulan fácilmente sin necesidad de luz artificial o aun en plena oscuridad, pero otros requieren condiciones especiales de calidad y confiabilidad de luz. Este factor puede ser clave cuando se requieren altas cantidades de esporas con fines de investigación o para identificar alguna especie en particular. El medio de cultivo sustituye parcialmente las propiedades nutricionales del hospedante o sustrato natural del hongo por cultivar. La utilidad del medio es 40
  • 41. proporcionar energía al microorganismo, para que desarrolle en la forma más normal posible. Por su composición nutritiva los medios de cultivo pueden ser: 1. Medios naturales. Están compuestos por materiales enteramente naturales, tales como partes de plantas, malta, levadura etc.… se requieren en forma de extractos o decocciones o simplemente esterilizando las partes vegetales con calor u otro método. Aunque se usan poco, pueden ser superiores a otros medios sobre todo en el caso de hongos de difícil esporulación. Por ejemplo se pueden conseguir altas cantidades de esporas de Stemphylium, sembrando a este hongo en tallos de cartamo esterilizados en autoclave. 2. Medios semisintéticos. Están compuestos parcialmente por materiales naturales y sintéticos, el ejemplo mas común es el de papa dextrosa y agar, V8 agar, harina de maíz, agar etc.… son los más usados. 3. Medios sintéticos. Se conoce perfectamente su composición, ejemplo medio de Komada o de Awuah y Lorbeer, para Fusarium oxisporum, por su consistencia los medios de cultivo pueden ser: a) Sólidos. Contienen agentes solidificantes principalmente el agar, proporción de 1 a 3%, el agar esta compuesto por una mezcla de carbohidratos complejos y se obtiene a partir de algas. b) Semisólidos. Aunque generalmente se usan poco en micología, estos se obtienen bajando la concentración del agar o usando gelatina como agente solidificante. c) Líquidos. Se preparan sin agente solidificante. Se usan principalmente para obtener altas concentraciones de esporas, ejemplo: papa- dextrosa. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO La preparación de medios de cultivo presenta distinto grado de complejidad, pero en general se tarda una o dos horas para la elaboración de las más comunes. A continuación se describe la forma de preparar el medio papa dextrosa agar, jugo V8 agar, agua agar, por ser los más comunes n la mayoría de los laboratorios de fitopatología en el mundo. OBJETIVOS Aprender a elaborar los medios de cultivo. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Autoclave Olla Express 41
  • 42. MATERIAL Papas Agua destilada Matraces Tubos de ensayo Vasos de precipitado REACTIVOS Agar Dextrosa Carbonato de calcio Jugo V8 DESARROLLO DE LA PRÁCTICA a). Elaboración de papa dextrosa agar (PDA). Crecen la mayoría de hongos y bacterias. Papa partida 200 gr. Dextrosa (glucosa) 13 gr. Agar 18-16 gr. Agua destilada 1000 ml 1. Hierva las papas partidas en 500 ml de agua. 2. En otro recipiente disuelva el agar, calentando para ayudar a disolver. 3. Cuele el caldo de papa a través de la manta de cielo o algodón. Mezcle ambos líquidos, agregue la dextrosa y homogenice. 4. Divida el líquido en recipientes adecuados (matraces o tubos). Tapar los matraces con tapón de algodón. En caso de requerir el medio en tubos de cultivo, se vacía a estos cuidadosamente, procurando no derramar medio en la boca de los tubos. Los tubos también se tapan con algodón (al igual que los matraces); en caso de ser tubos con tapa de rosca, esta deberá quedar ligeramente floja durante la esterilización. 5. Esterilizar matraces y/o tubos en el autoclave u olla de presión de 15-20 libras/pulgada2 (± 120 oC durante 15-20 minutos) contados a partir del momento en que se alcance la presión ya mencionada. 6. Abra la olla o autoclave hasta que la presión baje a cero. Deje enfriar el medio al contacto con el aire, cuando este se encuentre tibio se vacía a cajas de Petri en condiciones asépticas, es decir en la cámara de transferencia o al manos desinfectando una mesa y auxiliándose de mecheros de gas. Las corrientes de aire deberán evitarse al máximo. Los tubos de ensayo se colocan en posición inclinada hasta que el medio solidifique, apretando los tapones de rosca o algodón, según se trate. 7. En ocasiones se agregan 2 o 3 gotas de ácido láctico (antes de vaciar) para prevenir el desarrollo de bacterias. en otros casos se agregan pequeñas cantidades (50-200 ppm) de antibióticos tales como la estreptomicina, penicilina, etc., también antes de vaciar, el cloranfenicol tolera la esterilización en las condiciones antes señaladas. A ciertos 42
  • 43. medios selectivos también se le pueden incorporar PCNB, Benomyl u otros fungicidas pero en dosis bajas (mg /lt). b). Elaboración de V8-agar. Para Phycomycetes y otros Jugo V8 200 ml Carbonato de calcio 3 gr Agar 16-18 gr Agua destilada 800 ml Agregue 200 ml de jugo V8 a 800 ml de agua tibia, agregue el carbonato de calcio y el agar agitando la mezcla, caliente en baño Maria hasta disolver el agar. Una vez que el agar este disuelto, lleve el volumen a 1000 ml con agua destilada. Vacíe el medio en recipientes adecuados y esterilice en el autoclave a 15 libras de presión durante 20 minutos. c). Elaboración de agua-agar. Phycomycetes y otros. No crecen bacterias. Agar 16 gr. Agua destilada hasta completar 1000 ml Disuelva el agar en 800 ml de agua utilizando un baño Maria, una vez disuelto, lleve el volumen con agua a 1000 ml, vacíe el medio en recipientes apropiados y esterilice en el autoclave a 15 libras de presión. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Agrios, GN. 2007. Fitopatología. LIMUSA, México. 285-288 p. López, A.G. 1979. Manejo de Hongos Fitopatógenos. Universidad Autónoma de Chapingo, México. 43
  • 44. 4.3.2 PRÁCTICA 2. AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATÓGENOS A PARTIR DE PLANTAS ENFERMAS INTRODUCCIÓN: El aislamiento consiste en el proceso de separación de microorganismos a partir de su sustrato natural (plantas) para hacerlas crecer en un medio de cultivo artificial. El aislamiento y cultivo persigue diversos fines, el más común en un laboratorio de fitopatología es para diagnosticar la causa de una enfermedad desconocida, sin embargo, puede tener objetivos didácticos o de investigación sobre taxonomía, fisiología y genética microbiana. Es común también cuando se quiere tener cepas puras en la evaluación de productos químicos in Vitro. El cultivo de microorganismos tiene enormes ventajas que contribuyen al conocimiento de la biología de estos. Sin embargo, hay que considerar que al cultivar un organismo: a) pueden ocurrir mutaciones b) se puede perder parcial o totalmente su patogenicidad, c) los hongos pueden o no formar cuerpos fructíferos en medios artificiales; estos cuerpos pueden presentar variación, d) existen hongos que no se pueden cultivar (parásitos obligados) y otros que requieren medios complejos para su desarrollo. Las técnicas para aislar hongos son diversas y dependen del hongo a estudiar y de la propia experiencia del investigador. OBJETIVOS Aprender a aislar y cultivar hongos fitopatógenos MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Cámara de flujo laminar Olla Express Autoclave Microscopio estereoscopico MATERIAL Material vegetal enfermo Agua destilada Agujas de disección Pinzas Navajas Filtros de porcelana REACTIVOS Alcohol etílico Hipoclorito de sodio PDA 44
  • 45. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA INDUCCIÓN AL DESARROLLO MICELAR Se recomienda que el hongo crezca y esporule sobre medios de cultivo, recomendable para hongos que crecen en el interior del hospedante y/o que esporulen poco en el tejido, tales como hongos de la raíz. Este método es el más usado cuando se requiere tener a un hongo en cultivo puro. 1. Lavar el material enfermo con agua corriente y secar. 2. Seleccionar al tejido vegetal afectado procurando que los trocitos queden de 0.3 a 0.5 cm de longitud. 3. Desinfectar los trocitos (ver anexos al final de la práctica). 4. Enjuagar los trocitos en 3 pasos de agua destilada estéril y secarlos perfectamente, al secar bien, disminuyen las contaminaciones. 5. Pasar 4 a 5 secciones a una caja de Petri con PDA, selle la caja con cinta parafilm e incube de 20 a 25 oC. INDUCCIÓN A LA ESPORULACIÓN Se recomienda para aislar hongos que esporulen abundantemente y que atacan las partes aéreas de las plantas. 1. Colocar en una caja de Petri 1 o 2 hojas de papel kleenex y humedecerlo con agua destilada estéril (cámara húmeda). 2. Pasar la sección del tejido infectado a la cámara húmeda. 3. Después de 24-72 hrs, observar con el microscopio estereoscopico, tomar las esporas con agujas de disección y transferir a una caja de Petri con PDA. PURIFICACIÓN DE CEPAS Es raro que al hacer una siembra o aislamiento, se obtenga solo al hongo deseado, normalmente también crecen microorganismos contaminantes de los cuales es necesario apartar al organismo de interés. Este proceso se denomina purificación y normal mente consiste en cortar puntas de micelio del borde de la colonia en crecimiento, mediante aguja de disección flameada. Esta pequeña porción del hongo y agar se deposita en otras cajas con medio de cultivo estéril y de esta forma se obtienen cultivos puros. Es aconsejable hacer aislamientos que la muestra sea fresca (pocas horas) y que se siembre a partir del borde de lesiones en crecimiento activo, de lo contrario la purificación se dificulta, en ocasiones es necesario utilizar medios selectivos con antibióticos y fungicidas para purificar cepas (la experiencia es clave). 45
  • 46. DESINFECCIÓN Los tejidos enfermos contienen normalmente diversidad de organismos que invaden los tejidos muertos por el patógeno. Estos contaminantes dificultan el aislamiento, por lo que generalmente es necesaria una desinfección previa a la siembra. Entre los desinfectantes más usuales se tienen a: 1. Hipoclorito de sodio. El desinfectante más usado es el blanqueador de uso domestico (cloralex), basta mezclar una parte de esta sustancia en cinco partes de agua destilada para obtener el producto deseado ya que el blanqueador viene al 5-6%, es decir que normalmente se usa hipoclorito al 1-2%, el tiempo de exposición varía de 30 a 90 segundos; el material viejo o muy contaminado se puede tratar por 2 a 3 minutos siempre que no se elimine el patógeno. 2. Alcohol etílico. Se usa generalmente al 70% por periodos de 30 segundos, el uso de alcohol al 95% es peligroso por su flameabilidad. INFORME DE RESULTADOS . BIBLIOGRAFÍA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. LIMUSA, México. 285-290 p. López, A.G.F. 1979. Manejo de Hongos Fitopatógenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 46
  • 47. 4.3.3. PRÁCTICA 3. ELABORACIÓN DE MONTAJES MICROSCOPICOS DE HONGOS FITOPATÓGENOS INTRODUCCIÓN Por su tamaño microscópico, los hongos generalmente no pueden observarse a simple vista, a excepción de hongos macroscópico que por su propio tamaño pueden ser observados superficialmente sin aparatos, siempre y cuando no se requiera estudiar detalles de las esporas, etc. Para su observación al microscopio compuesto, los hongos requieren ser preparados y montados en portaobjetos. En estudios preliminares o de rutina se hacen preparaciones temporales desechables, pero si se desea preservar especimenes por largo tiempo es necesario elaborar montajes permanentes, los que de hacerse correctamente duran uno o varios años en buenas condiciones. Para hacer un montaje de calidad, se requiere paciencia y experiencia, además de la destreza individual, sin embargo, todo fitopatólogo debe intentar hacer buenas preparaciones, ya que actividades prácticas tales como el diagnostico de enfermedades dependen de alto grado de buenas preparaciones. OBJETIVOS Aprender a preparar montajes microscópicos de especimenes fungosos. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio biológico compuesto MATERIAL Cepas de hongos Montajes permanentes de hongos Agua Cinta adhesiva Porta y cubre objetos Navajas REACTIVOS Fenol ( cristales ) Acido láctico Lactofenol azul y claro Glicerina 47
  • 48. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA MONTAJE CON AGUJA DE DISECCIÓN Es útil para montar estructuras que desarrollan abundantemente en la superficie del hospedante, o a partir de cepas que crecen en medio de cultivo. Es la técnica obligada para hacer preparaciones a partir de raíces infectadas. El procedimiento consiste en: 1. Colocar una pequeña gota de agua u otro medio de montaje en el centro de un portaobjetos. 2. con la punta de la aguja humedecida tome o roce ligeramente las esporas y/o micelio que desee montar, evite tomar material excesivo ya que dificulta la observación posterior. De ser necesario, puede auxiliarse del microscopio estereoscopico para hacer mejor el trabajo. 3. Transferir el material a la gota del medio de montaje, coloque cuidadosamente un cubreobjetos y observe con los objetivos 10x y 40x. 4. Para montajes temporales use agua o lactofenol, para preparaciones permanentes use lactofenol y selle con esmalte para uñas. MONTAJE MEDIANTE CINTA ADHESIVA Es la técnica más rápida y fácil, sobre todo para personas inexpertas. Las preparaciones son exclusivamente temporales. No usar para hacer montajes a partir de raíces, especialmente si estas presentan suelo adherido. El método consiste en: 1. Colocar una gota de agua u otro medio de montaje en el centro de un portaobjetos. 2. cortar un trozo de cinta, 1 o 2 cm más grande que la longitud del portaobjetos, no use trozos de cinta más pequeños o más grandes. 3. Tomar la cinta por los extremos con dos de los dedos, deposite suavemente la parte engomada sobre la superficie del hospedante o crecimiento del hongo en medio de cultivo, evite presionar demasiado, pues tomara material en exceso y/o también se pegaran setas u otras estructuras de la planta que dificultaran la observación. 4. Tome la cinta con las dos manos y péguela sobre el portaobjetos, vigile que la cinta pegue rápidamente en ambos extremos del cristal, pues de lo contrario despegara fácilmente, observe al microscopio con los objetivos 10x y 40x. Las mejores preparaciones no son aquellas que presentan mucho material, sino las que contienen las estructuras típicas del hongo, más aun si se encuentran bien separadas y arregladas en forma estética. CORTES DE CUERPOS FRUCTÍFEROS Cuando se quieran observar estructuras que se encuentran parcial o totalmente inmersas en el hospedante y/o encerradas en cuerpos fructíferos, es necesario hacer cortes transversales que permitan observar perfectamente la forma y ubicación interna de las esporas, estos cortes se pueden hacer con aparatos especiales, pero generalmente se efectúan de manera manual mediante el siguiente método: 48
  • 49. 1. Coloque el material enfermo bajo el microscopio de disección, separe una porción superficial del tejido enfermo mediante un corte longitudinal procurando no dañar los cuerpos fungosos, esto facilitara los cortes de los cuerpos ya que solo manejaremos una pequeña porción de tejido, el tamaño de la muestra puede variar, pero se aconseja dejar tiras de +/- 1 a 3 cm de largo por +/- 1 a 3 mm de ancho, con un grosor de +/- 0.5 a 2 mm; esto depende de muchos factores tales como el tamaño de los cuerpos a cortar, consistencia del tejido etc., la experiencia es básica. 2. Con una navaja de rasurar sin usar, separe el tejido adyacente que se encuentra adelante y a los lados del cuerpo fructífero; este quedara delimitado y listo para los cortes definitivos. 3. Coloque el dedo índice de la mano izquierda junto al cuerpo a cortar, cuide de no presionar directamente al cuerpo, de tal forma que al recargar la navaja en el dedo índice, este guíe y regule el espesor de los cortes, estos deben ser lo más delgado posible (cortes transversales de un solo tajo). 4. Los cortes que van quedando adheridos o por un lado de la navaja, se toman con una aguja de disección humedecida y se transfieren al portaobjetos, en el que previamente se a depositado una gota de medio de montaje. Coloque al portaobjetos y observe al microscopio. MEDIOS DE MONTAJE 1. Agua destilada. Útil para montajes temporales, se puede agregar detergente en bajas cantidades para reducir la formación de burbujas. 2. Lactofenol. Aunque existen otros medios, este es uno de los más usados por su fácil preparación y alta eficiencia, además también funciona como solución fijadora y restauradora de la turgencia del material. PREPARACIÓN DEL LACTOFENOL Fenol (cristales) 20 gr Ácido láctico 20 ml Glicerina 40 ml Agua destilada 20 ml Para obtener una mezcla rápida, calentar ligeramente el agua hasta disolver el fenol, agregue enseguida la glicerina y el ácido láctico, se pueden agregar (opcional) colorantes tales como el azul algodón u otros, para teñir las esporas y para que la observación sea más agradable a la vista. ABLANDAMIENTO DE TEJIDOS SECOS Las tres técnicas descritas se pueden hacer con tejido fresco y seco. En el caso de cortes de material seco o duro se puede reblandecer los trozos a cortar en una solución de hidróxido de potasio (KOH) al 2%, esto facilita los cortes, el periodo de exposición es variable, pero comúnmente basta de 3 a 5 minutos, la exposición prolongada reblandece excesivamente los tejidos y/o desintegra las estructuras fungosas. 49
  • 50. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Echando, E. 1971. Manual de Laboratorio para Fitopatología General, Herrera Hermanos. 13-14 p. Streeta, R.B. 1972 Tha Diagnosis of Plant diseases, Univ. Arizona Press. López, A.G. 1979. Manejo de Hongos Fitopatógenos. UACH. 25-29 p. 50
  • 51. 4.3.4 PRÁCTICA 4. SÍNTOMAS CAUSADOS POR HONGOS FITOPATÓGENOS INTRODUCCIÓN De manera sencilla podemos decir que una enfermedad es toda alteración de la fisiología o de la estructura normal de la planta, lo suficientemente prolongada para producir síntomas visibles y ocasionar daños en la calidad y/o cantidad de la producción. En consecuencia, los síntomas son manifestaciones visibles de tal anormalidad, cada enfermedad fungosa es causada generalmente por un solo patógeno y presenta síntomas que son característicos; si bien es cierto que algunas enfermedades presentan síntomas idénticos, por lo que se requieren estudios de laboratorio para diferenciarlas. Por lo anterior, el conocimiento de los síntomas es indispensable para el diagnostico de enfermedades, sobre todo a nivel de campo, las enfermedades fungosas pueden agruparse en base a los síntomas principales, de la siguiente manera: 1. Enfermedades vasculares. Estos hongos atacan principalmente los vasos conductores, el micelio, esporas y algunos productos de su metabolismo taponean o destruyen los vasos, evitando el flujo de agua y nutrientes hacia la parte superior de la planta, a consecuencia de lo anterior generalmente se derivan tres tipos de síntomas: a) Marchitamiento. El sistema conductor es bloqueado gradualmente y la planta muestra flacidez que inicialmente se observa solo en horas calurosas, al paso del tiempo la planta muere. b) Amarillamiento. Puede o no presentarse con la marchitez, pero generalmente se presenta al inicio de la enfermedad, cuando los tejidos están parcialmente incluidos por el hongo. Se inhibe la síntesis de clorofila o esta se destruye por la acción de toxinas fungosas. c) Defoliación. La obstrucción del sistema vascular o el ataque directo al follaje provocan desprendimiento de hojas. 2. Enfermedades de tipo necrótico. Algunos hongos invaden inicialmente los tejidos parenquimatosos, si bien es cierto que con el tiempo también alcanzan los vasos conductores, los síntomas más comunes de este tipo son: a) Manchas foliares. Estos hongos parásitos destruyen la lámina foliar, ramas o superficies de frutos, las manchas son de tamaño pequeño, es decir que solo alcanzan un tamaño y forma determinada a pesar de que el ambiente sea favorable, con frecuencia las lesiones están limitadas por las nervaduras principales. b) Tizones. El patógeno causa manchas necróticas extensivas en cualquier órgano de la parte aérea de la planta, las lesiones crecen de forma relativamente indefinida mientras existan condiciones ambientales favorables, los órganos afectados presentan aspecto de quemaduras por fuego. c) Pudriciones. Estos patógenos producen enzimas que destruyen la lámina media de la pared celular y como resultado, las células pierden su integridad, se plasmolizan y mueren. Las pudriciones pueden ser blandas o secas. 3. Enfermedades hiperplasicas. Algunos patógenos estimulan anormalmente las células, induciendo su división excesiva (hiperplasia) o provocan su crecimiento 51
  • 52. exagerado (hipertrofia), a simple vista se aprecian tumores o agallas en distintos órganos de la planta. OBJETIVOS Reconocer distintos tipos de síntomas causados por hongos fitopatógenos. MATERIALES REQUERIDO EQUIPO Microscopios de disección y biológico compuesto. MATERIAL Material vegetal enfermo. REACTIVOS Lactofenol claro. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 1. Identifique los distintos tipos de síntomas ya señalados, usando para ello las muestras de material vegetal enfermo que le proporcione su instructor. 2. Describa en forma sencilla al menos un tipo de síntomas típico representativo de cada grupo, señalando: color, tamaño, forma, borde, consistencia etc. En cada caso, indique el patógeno y el nombre común de la enfermedad. 3. Haga un dibujo sencillo pero explícito de cada tipo de síntomas que observe. RESULTADO DE LA PRÁCTICA Se consideran los dibujos y la descripción BIBLIOGRAFÍA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. LIMUSA. México. 284 p. González, L.C. Introducción a la Fitopatología IICSA. Walker, J.C. Patología Vegetal. OMEGA. Barcelona, España. 52
  • 53. 4.3.5 PRÁCTICA 5. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD DE HONGOS FITOPATÓGENOS INTRODUCCIÓN. Los hongos causan enfermedades mediante un proceso que indica cuando las esporas (o micelio) que germina y el patógeno penetra a los tejidos sanos, al paso de días y meses el patógeno invade los tejidos, produciendo sobre la superficie del hospedante nuevas generaciones de esporas. La identificación de enfermedades se basa en gran parte en el reconocimiento de síntomas típicos de cada enfermedad, en caso de duda o de enfermedades poco conocidas, es necesario un estudio de laboratorio para determinar la causa del problema. En laboratorio, el fitopatólogo analiza las plantas y en base al microorganismo detectado a los síntomas y apoyándose en literatura especializada da un diagnostico del problema, sin embargo estos diagnósticos con frecuencia tienen alto grado de incertidumbre, ya que es raro encontrar a un solo microorganismo asociado a la enfermedad en estudio, en ocasiones hay 2, 3, 4 o más organismos creciendo en los tejidos enfermos. Aquí cabe la interrogante ¿ cuál de todos es el causante del problema en estudio?. El diagnostico rápido y preciso es indispensable para tomar medidas de control, diagnósticos equivocados conducen a fallas en el control, que pueden conducir a pérdidas totales, por lo anterior, el investigador tiene que probar experimentalmente en ocasiones a todos los microorganismos asociados para establecer la causa de la enfermedad. Los ensayos que se utilizan para probar la capacidad de un organismo para causar una enfermedad, se denominan “pruebas de patogenicidad”. Estas pruebas tienen que satisfacer cuatro reglas o postulados fueron desarrollados por Roberto Koch en el siglo pasado y señalan que: 1. El microorganismo debe estar asociado con la enfermedad, a su vez esta no debe aparecer sin que el microorganismo este o haya estado presente. 2. El microorganismo debe aislarse en cultivo puro y deben establecerse sus caracteres específicos (forma, tamaño, fisiología, etc.) 3. El microorganismo puro debe reproducir los síntomas de la enfermedad cuando se inocule en plantas sanas de la misma variedad o tipo del cual fue aislado, este proceso deberá efectuarse bajo ambiente favorable a la enfermedad. 4. El microorganismo debe ser reaislado del hospedante inoculado y debe mostrar las mismas características en cultivo, que el microorganismo inoculado originalmente en plantas sanas. En el caso de parásitos obligados, es necesario hacer adaptaciones que permiten cumplir los postulados de Koch. 53
  • 54. OBJETIVOS Conocer la metodología para probar la patogenicidad de hongos fitopatogenos y cumplir los postulados de Koch. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microboy. MATERIAL Frutos enfermos (de tomate ) Agujas de disección Lámparas de alcohol. Bolsas de plástico. Papel absorbente REACTIVOS PDA infectado con hongo Hipoclorito de sodio. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 1. Colecte frutos de tomate enfermos por pudrición agria (Geotrichum candidum), observe y describa los síntomas, observe al microscopio el cuerpo (micelio y esporas) del hongo y haga dibujos detallados de estos. 2. Desinfecte frutos de tomate sumergiéndolos en hipoclorito de sodio al 2% por dos minutos, los frutos deberán estar sanos y sin golpes, de preferencia maduros y consistencia firme. 3. Provoque heridas de 0.5 a 1.0 cm de profundidad en los frutos desinfectados, para ello utilice una aguja de disección esterilizada, a la flama de un mechero. 4. Coloque sobre las heridas un disco pequeño de PDA-hongo (micelio y esporas) o gotas de agua estéril con esporas en suspensión de cultivos jóvenes y puros de Geotrichum candidum. Tome otros frutos desinfectados e inocúlelos de la misma forma, pero sin causar heridas previas, deje frutos con o sin heridas sin inocular, como testigos. 5. Coloque los frutos inoculados y no inoculados por separado, en una bolsa o recipiente que contenga papel absorbente humedecido con agua destilada estéril (cámara húmeda). 6. Incube de 2 a 4 días a temperatura de 25 a 39 oC. 7. Al detectar síntomas de la enfermedad en los frutos inoculados, proceda a hacer el reaislamiento de manera similar a como realizó el aislamiento, cheque las características del hongo desarrollando en los frutos inoculados antes de hacer el reaislamiento. 8. Compare las características morfológicas del hongo inoculado, compare también los síntomas reproducidos artificialmente con los que presentaron los frutos infectados naturalmente. 54
  • 55. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología, LIMUSA. México. 35 p. González, L.C. 1981. Introducción a la Fitopatología. IICA. San José Costa Rica. 12-13 p. Bauer, L.I. 1984. Fitopatología. LIMUSA. Colegio de Postgraduados. 55
  • 56. 4.3.6 PRÁCTICA 6. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE IMPORTANCIA AGRÍCOLA DE LA CLASE PHYCOMYCETES INTRODUCCIÓN Los phycomycetes son hongos de hábitat acuático o semi acuático que abarcan a numerosos géneros y especies de gran importancia agrícola. El conocimiento de la sintomatología, biología, morfología y control es de interés fundamental para el parasitólogo. El control de enfermedades se basa en une identificación correcta del patógeno, de ahí que sea importante conocer las características más sobresalientes de los principales géneros de esta clase. OBJETIVOS Conocer y diferenciar las características morfológicas de los principales géneros de importancia agrícola de la clase phycomycetes. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio de disección y biológico. MATERIAL Material vegetal enfermo. Cinta adhesiva. Agujas de disección. Navajas y bisturí. Montajes permanentes DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 1. Elaborar montajes a partir de material vegetal enfermo o de cultivos proporcionados por el laboratorio, los montajes se harán con cinta o aguja, tal como se señalo en prácticas anteriores (de ser necesario, hacer cortes). 2. Usando los montajes frescos o preparaciones permanentes disponibles en el laboratorio, observar al microscopio compuesto los especimenes, con los objetivos 10x y 40x. 3. Dibujar cada espécimen cuidadosamente, resaltando las características más importantes: tipo de micelio, esporangios, esporangioforo y oosporas. 4. Se estudiaran los siguientes géneros: a) Pythium b) Phytophthora c) Peronospora d) Bremia 56
  • 57. e) Plasmopara f) Pseudoperonospora g) Rhizopus h) Albugo i) Otros INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. LIMUSA-Wiley. México. Alexopoulos, C.J. Introducción a la Micología. Frezz, M.J.1950. Las especies de Phytophthora en la Argentina. Ministro de Agricultura, Buenos Aires, Argentina. Romero, C.S. 1988. Hongos Fitopatógenos. Universidad Autónoma de Chapingo. 57
  • 58. 4.3.7 PRÁCTICA 7. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE IMPORTANCIA AGRÍCOLA DE LA CLASE DEUTEROMYCETES. INTRODUCCIÓN La mayor parte de los géneros y especies de importancia agrícola de la región, pertenecen a esta clase. La sintomatología varía desde pudriciones de la raíz y tallo, manchas y tizón en el follaje así como marchitez y pudriciones en frutos. El conocimiento de la forma y color de las esporas y/o cuerpos fructíferos es indispensable para la identificación de estas especies. El diagnóstico correcto es pre- requisito para el control de las enfermedades causada por estos o cualquier patógeno. En ese sentido, el conocimiento de la morfología de cada género es de vital importancia para el fitopatólogo. OBJETIVOS Conocer y diferenciar en base a morfología los principales géneros de importancia agrícola de la clase Deuteromycetes. MATERIALE REQUERIDO EQUIPO Microscopio de disección. Microscopio biológico compuesto. MATERIAL Material vegetal enfermo Cinta adhesiva Agujas de disección Navajas o bisturí. Montajes permanentes. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 1. Elabore preparaciones temporales mediante la técnica de la aguja, cinta adhesiva o cortes. 2. Use las preparaciones señaladas o montajes permanentes proporcionados por su instructor y observe al microscopio compuesto con los objetivos 10x y 40x. 3. Dibuje cada espécimen cuidadosamente, resaltando las características más importantes: micelio septado, conidios y conidioforos, esporodoquios y sinemas, acérvulos y picnidios. 4. Se estudiaran los siguientes géneros: a) Oidium b)Oidiopsis 58
  • 59. c)Alternaria d) Helminthosporium e) Corynespora f) Botrytis g) Geotrichum h) Aspergillus i) Phymatotrichum j) Colletotrichum k) Macrophomina l) Rhizoctonia INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. Ed. LIMUSA-Wiley. México. Alexopoulos, C.J. 1969. Introducción a la Micología, EUDEBA, Buenos Aires, Argentina. Barnett, H.L. 1960. Ilustrated genera of imperfecti fungi. Burguess, Minneapolis. 59
  • 60. 4.3.8 PRÁCTICA 8. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE IMPORTANCIA AGRÍCOLA DE LA CLASE ASCOMYCETES. INTRODUCCIÓN Los miembros de esta clase se caracterizan porque producen esporas de origen sexual en bolsas o sacos membranosos llamados ascas. Esta clase es de gran importancia sobre todo en zonas frescas o frías y de alta humedad relativa, en el noroeste de México no es común encontrar a la fase sexual de estos hongos, no así la fase asexual (conidios) de algunas especies de gran importancia, tales como la cenicilla. OBJETIVOS Reconocer algunos géneros de importancia agrícola de la clase Ascomycetes. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopios de disección Microscopios biológico compuesto MATERIAL Material vegetal enfermo Cinta adhesiva Agujas de disección Navajas o bisturí. Montajes permanentes. 1. Use las preparaciones permanentes que le proporcione el instructor para observar al microscopio, en caso de haber material disponible, haga montajes temporales de estructuras de Ascomycetes siguiendo la técnica de raspado con agujas o haciendo cortes de material vegetal con cuerpos fructíferos. 2. Dibuje cada espécimen resaltando: ascosporas y cuerpos fructíferos. 3. Se observaran los géneros: a) Erisyphe b) Uncinula c) Ceratocystis e) Phyllachora f) Otros 60
  • 61. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. LIMUSA-Wiley, México. Alexopoulos, C.J. 1969. Introducción a la Micología, EUDEBA. Buenos Aires, Argentina. Romero, C.S. 1988. Hongos Fitopatógenos. Universidad Autónoma de Chapingo, México. 61
  • 62. 4.3.9 PRÁCTICA 9. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE IMPORTANCIA AGRÍCOLA DE LA CLASE BASIDIOMYCETES. INTRODUCCIÓN Esta clase es de gran importancia fitopatológica ya que incluye a los chahuixtles o royas, así como a los carbones, estas enfermedades causan pérdidas de millones de dólares al año en diversas zonas agrícolas del mundo, algunos basidiomycetes causan pudrición de raíces de árboles o atacan madera. El conocimiento de la sintomatología y de las características morfológicas de estos hongos es importante para las enfermedades que causan, por lo antes dicho en esta práctica se pretende que el estudiante se relacione con estos dos aspectos indispensables para el diagnóstico de royas y carbones. OBJETIVOS Identificar y diferenciar los principales géneros causantes de royas y carbones. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopios de disección Microscopios biológicos compuestos MATERIAL Material vegetal enfermo. Cinta adhesiva. Agujas de disección. Navajas y bisturís DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 1. Elabore preparaciones temporales mediante el método de la aguja y cinta. 2. Use estas preparaciones temporales o montajes permanentes proporcionados por su instructor para observar al microscopio con los objetivos 10x y 40x. 3. Dibuje cada espécimen cuidadosamente., resaltando las características más importantes: uredosporas y teliosporas. 4. Se observaran los géneros: a) Puccinia b)Uromyces c) Phragmidium 62
  • 63. d) Hemileia e)Neovossia f) Ustilago g) Entiloma h) Otros INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. LIMUSA-Wiley, México. Alexopoulos, C.J. 1969. Introducción a la Micología. EUDEBA, Buenos Aires, Argentina. 63
  • 64. 4.3.10 PRÁCTICA 10 ELABORACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCIÓN Para el cultivo in Vitro de fitobacterias se requiere de la elaboración de un medio que proporcione todos los requerimientos nutricionales que permitan su reproducción, los cuales se les conoce como medios de cultivo. Los medios de cultivo contienen cuatro componentes esenciales: fuentes de carbono y nitrógeno, minerales y vitaminas. Existe una gran variedad de de fuentes de carbono que se pueden emplear en los medios de cultivo como son: alcoholes, pentosas, hexosas, disacáridos, trisacáridos, polisacáridos, ácidos e hidroxiácidos ya sean solos o en combinación. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a elaborar medios de cultivo para el aislamiento de bacterias fitopatógenas. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Autoclave Agitador magnético MATERIAL Agar Nutritivo Agua destilada Caseína hidrolizada Peptona Glucosa Extracto de carne Sacarosa DESARROLLO DE LA PRÁCTICA AGAR NUTRITIVO Agar nutritivo 23 g Agua destilada 1000 ml Disolver el agar nutritivo en el agua, si desea puede dividir el líquido en dos matraces. Esterilizar en autoclave a 115 lbs/pulgada cuadrada durante 15 minutos y vaciar en cajas de Petri. Este medio generalmente se emplea para aislamientos de material vegetal. Es un medio útil para el aislamiento de especies de Xanthomonas. 64
  • 65. MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES (TTC) Peptona 10 g Caseína hidrolizada 1.0 g Glucosa 5.0 g Agar 12 g Agua 1000 ml Ajustar el pH a 7 y esterilizar en la forma normal, cuando el medio alcance una temperatura de aproximadamente 45-50 0C adicionar solución acuosa de cloruro de tetrazolio al 1.0% para dar una concentración final de 0.005%. Con este medio de cultivo se pueden detectar las colonias virulentas y avirulentas de Ralstonia solanacearum y P. s. p.v. phaseolicola. En el primer caso las colonias virulentas son blancas, fluídas, con centro rojo y para la segunda bacteria las cepas virulentas forman colonias rojas y las avirulentas son blancas. MEDIO PARA LA PRODUCCION DE LEVANA Extracto de carne 3g Peptona 10 g Sacarosa 50 g Agar 20 g Agua 1000 ml Disuelva los ingredientes, esterilice en la forma convencional y vacíe en cajas esterilizadas. MEDIO DE GELATINA Extracto de carne 3.0 g Peptona 5.0 g Gelatina 120.0 g Agua 1000 ml La gelatina se adiciona al agua y se deja hidratar durante 15 a 30 minutos y luego se calienta para disolver la gelatina; posteriormente agregar y disolver los otros constituyentes. Ajustar el pH a 7, vaciar a tubos y esterilizar a 120 0C durante 20 minutos. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. LIMUSA, México. 285-288 p. Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriología “Bacterias fitopatógenas” INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados. 65
  • 66. 4.3.11 PRÁCTICA 11. MÉTODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS INTRODUCCIÓN El cultivo puro, es una condición artificial en el crecimiento de bacterias bajo condiciones de laboratorio. Para determinar las características de una especie bacteriana en particular, es imperativo que el organismo sea aislado y multiplicado en laboratorio en cultivo puro. Existe una variedad de técnicas para el aislamiento y desarrollo de bacterias como son: técnica de estría cruzada y la de vaciado en placa. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a realizar las técnicas para el aislamiento y obtención de cultivos puros de bacterias fitopatógenas. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Cámara de flujo laminar o microboy MATERIAL Medio de cultivo Cajas Petri Lámpara de alcohol Asa bacteriológica Material vegetal enfermo Navajas o bisturí Tubos de ensayo Agua destilada estéril DESARROLLO DE LA PRÁCTICA Técnica de estría cruzada. Con el asa bacteriológica previamente flameada y enfriada, se toma una gota de suspensión bacteriana del tubo de ensayo. Se procede a realizar un estriado (4 o 5 “rayas”) en la caja de Petri . A partir de la ultima “raya” del estriado # 1, se comienza a rayar el estriado # 2, esto se repite 4 ó 5 veces cuidando de no tocar mas que la ultima raya del estriado anterior. Todo esto se realiza en el microboy previamente desinfectado y con la ayuda de una lámpara de alcohol. Al terminar se sellan las cajas y se incuban a 28 grados centígrados Durante 24-48 hrs. Técnica de vaciado en placa. Para lograr tener colonias separadas por esta técnica, primeramente se debe hacer una suspensión (que se puede lograr al suspender el material vegetal enfermo en agua esterilizada o en medio de cultivo líquido). De esta suspensión se toma una gota ó 0.5 ml y se transfieren a otro tubo ó matraz con medio de cultivo con agar líquido. Esta operación se repite 2 ó 3 veces más, teniendo cuidado de agitar los tubos antes de hacer la transferencia. Inmediatamente después de cada dilución, el contenido de cada uno de los tubos se traslada a una caja Petri estéril y después del periodo de incubación se obtendrán colonias separadas. 66
  • 67. AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN Uno de los requisitos para considerar a una bacteria como el agente inductor de una enfermedad, es aislarla y purificarla a partir del tejido enfermo. Para llevar a cabo esta etapa existen diferentes metodologías y la elección de cualquiera de ellas dependerá del tipo de síntoma, órgano afectado, grado de avance de la enfermedad y del material y equipo disponibles. Entre las técnicas de aislamiento más comunes, se encuentran las siguientes: AISLAMIENTO DIRECTO (Para muestras con marchitez) PROCEDIMIENTO 7. Con una navaja flameada y enfriada, haga un corte transversal al tallo que presente flacidez incipiente, de preferencia cerca del nivel del suelo. 8. Haga una ligera presión y espere unos segundos para que de los haces vasculares salga un exudado bacteriano. 9. Con el asa previamente flameada y enfriada, tome del exudado y transfiéralo a un tubo con agua destilada estéril. 10. Agite el tubo para homogeneizar. 11. Con el asa flameada tome una gota de la suspensión y siembre una caja con medio de cultivo por el método de estría cruzada. 12. Incube a 28 0C por 24-48 horas. INMERSIÓN DEL TEJIDO EN AGUA ESTERIL (Para muestras con manchas o tizones) PROCEDIMIENTO 9. Al microscopio estereoscópico observe los tejidos afectados, para detectar la presencia de exudados, escamas bacterianas, micelio u otras estructuras fungosas. 10. De la zona de avance de la enfermedad haga una preparación en fresco y observe al microscopio compuesto. 11. Si en estas preparaciones observa únicamente células bacterianas, esto le indica que el síntoma se puede deber a bacterias, por el contrario, si observa micelio, lo más seguro es que el síntoma sea ocasionado por un hongo. 12. Seleccione tejido enfermo y lávelo con agua estéril. 13. Corte pequeños trocitos y desinféctelos con una solución de hipoclorito de sodio al 1% durante 1 a 2 minutos. 14. Decante el hipoclorito de sodio y lave 3 veces con agua esterilizada. 15. Una vez transcurridos los 5 ó 10 minutos, tome una gota de la suspensión con el asa bacteriológica y siembre con estría cruzada una caja con medio de cultivo. 16. Después del periodo de incubación seleccione las colonias bacterianas que se asemejen a las del agente causal, y siémbrelas una nueva caja con medio de cultivo para obtener así, suficiente cultivo puro y continuar con las pruebas de patogenicidad. 67
  • 68. INMERSIÓN DEL TEJIDO EN AGUA ESTÉRIL (Muestra con sobrecrecimiento) PROCEDIMIENTO 7. Con un cepillo pequeño y cerdas suaves lave al chorro del agua la agalla o tejido con fasciación y luego haga unas fracciones. 8. Coloque los cortes en un tubo con 3 ml de agua destilada estéril y manténgalos así durante unos 10-20 minutos. 9. Pase 3 asadas de la suspensión anterior a otro tubo con 3 ml de agua estéril. 10. Siembre 2 cajas con medio de cultivo por estría cruzada. 11. Incube a 22-28 0C durante 2-4 días. 12. Seleccione las colonias bacterianas con características del posible patógeno y transfiera a las otras cajas con medio de cultivo. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Rodríguez, M. M. 2001 Manual de prácticas de bacterias fitopatógenas. DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA AGRICOLA. Universidad Autónoma de Chapingo. 68
  • 69. 4.3.12 PRÁCTICA 12. TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA DETERMINAR FORMA, TAMAÑO Y AGRUPACIÓN CELULAR INTRODUCCIÓN Como las células bacterianas son incoloras, se requiere del empleo de colorantes para hacerlas más nítidas al microscopio, para lo cual se pueden emplear técnicas de coloración simples o diferenciales. Tinción simple. El azul de metileno de Loeffler es uno de los reactivos más valiosos que se tienen para la tinción de bacterias. Es excelente para las bacterias del género Curtobacterium donde puede demostrar el perlado y los gránulos. En los bacilos esporulados (Bacillus), teñidos con este reactivo, las esporas aparecen como cuerpos no teñidos dentro de células azules. Tinción diferencial. Una de las técnicas más ampliamente utilizadas es la “Tinción de Gram”, porque no solo permite determinar la forma y agrupación de las bacterias, sino también es de considerable valor en la identificación y clasificación, al separar a las bacterias en gram negativas y gram positivas. OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a utilizar los reactivos para llevar a cabo las distintas técnicas de coloración de bacterias. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio biológico MATERIAL Cultivo bacteriano Asa bacteriológica Agua alcohol Azul de metileno Portaobjetos Lámpara de alcohol Cristal violeta Lugol Safranina INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriología “Bacterias fitopatógenas” INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados. 69
  • 70. 4.3.13 PRÁCTICA 13. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD INTRODUCCIÓN Cuando una planta, supuestamente infectada por una bacteria, es traída al laboratorio, se procede al aislamiento en medio artificial de cultivo según la técnica usual. No obstante, los resultados del aislamiento precisan ser interpretados con cautela, pues: a) las colonias desarrolladas en la caja de Petri pueden ser bacterias saprófitas, por lo que la enfermedad puede no ser provocada por estas bacterias. b) aparecen en la caja, colonias de bacterias patogénicas y saprófitas las cuales no se diferencian por su aspecto. c) las colonias obtenidas, aunque sean de bacteria patogénica, se presentan avirulentas o perdieron por alguna razón, la patogenicidad. La demostración de la patogenicidad de una cepa bacteriana es un procedimiento complicado que requiere mucho tiempo para que aparezcan los síntomas típicos de la enfermedad en a planta homóloga. En la mayoría de las ocasiones no siempre se dispone de este material, siendo más difícil, aún, cuando se tratan de árboles o plantas que no se encuentran en la región. Existen pruebas de patogenicidad como la reacción de hipersensibilidad, pudrición del tubérculo de papa, inoculación a frutos verdes de peral o manzano las cuales se describen a continuación. OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar pruebas de patogenicidad de bacterias fitopatógenas. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio biológico Incubadora MATERIAL Material vegetal enfermo Agua estéril Alcohol Cajas de Petri Papel filtro DESARROLLO DE LA PRÁCTICA PUDRICIÓN DEL TUBERCULO DE PAPA Para bacterias aisladas de órganos con pudrición, la patogenicidad se puede valorar con la prueba de pudrición del tubérculo de papa y los resultados se pueden observar a las 24 horas de haberse realizado. 70
  • 71. PROCEDIMIENTO Un tubérculo de papa de preferencia de la variedad Alpha, se lava, se seca y se desinfecta superficialmente, bañándolo con etanol al 70%, seguido de un flameado (evite adicionar mucho alcohol porque al quemarse podrá dañar las capas externas del tubérculo y se correrá el riesgo de contaminación por bacterias esporuladas como Bacillus spp. De estos tubérculos se cortan rebanadas de 5mm de grosor y se colocan en cajas de Petri con papel filtro (previamente esterilizado) se pueden acomodar dos rebanadas por caja y una de ellas servirá de testigo. A cada una de las rebanadas se les hace una insición superficial y solo en una de ellas se pone crecimiento de la bacteria a probar. Finalmente se le adicionan unos 2-3 mm de agua estéril solo para humedecer el papel y crear un ambiente húmedo, se incuban a 28 0C durante 24-72 horas. A partir de las primeras 24 horas, se palpa el tejido de cada una de las rebanadas y si la que ha sido inoculada, se siente blanda, indica que la bacteria probada sintetiza enzimas pectolíticas y es muy probable que sea el agente causal de la pudrición. Al igual que la prueba anterior, también sirve para diferenciar especies y patovares de Pseudomonas fluorescentes. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA Agrios, G.N. 2007. Fitopatología, LIMUSA. México. 35 p. 71
  • 72. 4.3.14 PRÁCTICA 14. OBSERVACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LOS NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS EN EL LABORATORIO. INTRODUCCIÓN Los nemátodos son animales con una organización muy sencilla, que comprenden especies parasitas de plantas (Fitoparasitas), también existen nemátodos Saprófagos (vida libre) que favorecen la descomposición de la materia orgánica, Omnívoros e incluso Depredadores, sin olvidar que hay nemátodos parásitos de animales (Zooparásitos), entre ellos los entomopatógenos que parasitan insectos y pueden emplearse en la lucha biológica contra las plagas. Estos nemátodos los podemos encontrar en todos los lugares; el mar, agua dulce, suelo y partes aéreas de las plantas; donde nos causan serios daños a las plantas cultivadas, sin embargo a menudo pasan desapercibidos por los técnicos y agricultores o sus daños son confundidos con otros factores; como la falta de fertilidad del suelo (deficiencias de nutrientes), escaso contenido de humedad, etc. Esto se debe fundamentalmente a su tamaño microscópico y a que viven en el suelo y/o el interior de las raíces de las plantas. OBJETIVOS: Que el alumno reconozca y aprenda a diferenciar los nemátodos fitoparásitos de los de vida libre en el laboratorio. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio de disección Microscopio biológico MATERIAL Vidrios de reloj Pipetas Agua DESARROLLO DE LA PRÁCTICA Usando los nemátodos disponibles en el laboratorio, se coloca en un vidrio de reloj una alícuota (2-5 mm) de la suspensión nemátodos-agua, enseguida se pasan al microscopio de disección para ser observados e identificar los nematodos fitoparásitos de los de vida libre. Y después se observan en el microscopio biológico. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA CEPEDA, S. M. (1995). Prácticas de nematología agrícola. Ed; Trillas. México. 109 pp. 72
  • 73. 4.3.15 PRÁCTICA 2. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DEL SUELO (ECTOPARÁSITOS) INTRODUCCIÓN Las muestras traídas del campo tienen que ser procesadas en el laboratorio para obtener los nemátodos y observarlos con la ayuda del microscopio para su identificación y conteo. Hay nematodos fitoparásitos que se alimentan de las raíces como ectoparásitos, los que siempre estarán en el suelo; pero otros se introducen al sistema radical (endoparásitos) del cual se alimentan e incluso algunos se mueven hasta las partes áreas. El método de extracción será de acuerdo al tipo de nemátodos mencionados anteriormente. OBJETIVOS: Qué el alumno se adiestre en las diferentes técnicas para la extracción de nemátodos del suelo (nemátodos de vida libre y fitoparásitos). MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Centrífuga Microscopio de disección MATERIAL Muestras de suelo con nematodos Embudos de 10-15 mm de diámetro Tubos de goma Pinzas de presión Malla de alambre Papel filtro Etiquetas Probeta Cubeta de plástico Tamiz de 100 mallas por pulgada cuadrada. Tamiz de 325 mallas por pulgada cuadrada. Tamiz de 500 mallas por pulgada cuadrada. REACTIVOS Kaolin Sucrosa DESARROLLO DE LA PRÁCTICA PREPARACIÓN DE LA MUESTRA La muestra que se recogió en el campo se esparce sobre un pedazo de plástico, se desmenuzan los terrones, se eliminan las piedras y separamos las raíces para procesarlas posteriormente y extraer los nemátodos endoparásitos. Una vez mullido el suelo, se procede a homogenizarlo con el fin de que las submuestras formen una muestra compuesta, finalmente se distribuye en el plástico. 73
  • 74. MÉTODO DEL EMBUDO DE BAERMANN: Primero se coloca un tubo de goma (8-10 cm. de largo) al cuello de un embudo de 10-15 mm. de diámetro, enseguida se lavan ambos perfectamente y luego se coloca una pinza de presión en el tubo de goma para cerrar el paso del agua. Después se procede a llenar con agua hasta 1 cm. bajo del borde del embudo y se coloca el embudo en la gradilla. Enseguida se etiqueta con los datos necesarios como: # de muestra, hospedero, fecha y lugar de colecta Una vez que se ha hecho lo anterior, se procede a preparar una tela de alambre que de antemano esté amoldada al embudo, sobre ella se coloca un papel facial (kleneex) y luego la muestra de suelo (40-50 grs.), se envuelve la muestra y se humedece con una piceta, se coloca la tela de alambre sobre el embudo cuidando que esta toque el agua del embudo. Dejamos el embudo en reposo y a las 24 horas se sacan en un vaso de precipitado unos 10 ml. de agua. En ellos van los nemátodos parásitos y saprófitos que pasaron por el papel facial y la malla. Si se desea, se pueden observar directamente los nemátodos al microscopio de disección, esto se hace colocando unos 5 ml. de la suspensión en un vidrio de reloj, luego se observan. En caso contrario o después de realizado lo anterior, se procede a matarlos y fijarlos para su preservación por tiempo indefinido. MÉTODO COMBINADO (TAMIZ-EMBUDO DE BAERMANN): Del suelo distribuido en el plástico, se toman muestras en diversos puntos agregándose a una probeta que contiene 200 cc de agua hasta aforar a 300 cc. El contenido de la probeta se pasa a una cubeta A, con 4-5 lts. de agua, en la cual se siguen desmenuzando los terrones hasta que se disuelva bien el suelo. Se agita la solución y la dejamos reposar durante 15-30 segundos para que se sedimente el material pesado y los nemátodos permanezcan flotando. El contenido de la cubeta A, se pasa a través de un tamiz de 100 mallas por pulgada cuadrada a una cubeta B, en la cual se agita y la dejamos sedimentar para pasarlo por un tamiz de 325 (ó 500) y lo que queda en él se pasa al embudo de Baermann. MÉTODO DE FLOTACIÓN (TAMIZ-CENTRÍFUGA): Lo que queda en el tamiz de 325 ó 500 se pasa a un vaso de precipitado y se distribuyen los tubos de la centrifuga a los que previamente se les agregó 0.5-1.0 g de kaolín, el cual se mezcla bien y se centrifuga a 3000 rpm por 5 minutos, lo que permite la sedimentación de los nemátodos junto con las partículas de suelo (favorecido por el kaolín). Después se decanta el sobrenadante eliminando la materia orgánica suspendida. El sobrenadante eliminado se sustituye por solución sucrosa (45 g. de solución sucrosa o azúcar refinada en 100 cc. de agua destilada) y se mezcla con la muestra. Se centrifuga a 3000 rpm durante 2 minutos y el sobrenadante se pasa por el tamiz de 325 ó 500 mallas donde los nemátodos quedan retenidos procediéndose inmediatamente a lavarlos sumergiendo el tamiz en agua para eliminar el azúcar del cuerpo de los nemátodos. Con la ayuda de una piceta se pasan a un vaso de precipitado, quedando listo los nemátodos para hacer observaciones al microscopio y/o matarlos y fijarlos para estudios posteriores de identificación y conteo. 74
  • 75. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA PACHECO, A. J. (2000). Manual de prácticas de laboratorio de Nematología. Juan José Ríos, Sin; México. 20 pp. THORNE, G. (1961). Principles of nematology, Mc. Graw-Hill book Co, New York, Estados Unidos. 553 pp. 75
  • 76. 4.3.16 PRÁCTICA 16. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DE LA RAÍZ (ENDOPARÁSITOS) INTRODUCCIÓN Paralelamente al grupo de los nemátodos ectoparásitos (es decir, aquellos que se alimentan externamente de la raíz y cuyo hábitat es el suelo), existe el grupo de los endoparásitos que se han adaptado a vivir dentro de los tejidos vegetales y que ya no dependen totalmente del ambiente del suelo, sino más bien de lo que ocurre en la planta. Así pues, podemos encontrar nemátodos desde la raíz, tallos y hojas hasta en las flores, frutos y semillas, y que constituyen un serio problema para la agricultura porque son un grupo mucho más peligroso que el anterior. Para la extracción de estos nemátodos, existen algunos métodos que por su sencillez y efectividad vale la pena conocerlos. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y realice los métodos de extracción más sencillos y prácticos que se conocen para extraer nemátodos endoparásitos. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio de disección Licuadora MATERIAL Raíces infectadas por nematodos Navajas Embudos Tamiz 325 mallas por pulgada cuadrada Agujas de disección REACTIVOS Kaolin Sucrosa DESARROLLO DE LA PRACTICA OBSERVACIÓN DIRECTA: Se usa en raíces con agallamiento, se utilizan agujas de disección para desmenuzar las agallas y extraer hembras, juveniles, machos y masas de huevecillos de los nemátodos que causan agallas (Meloidogyne spp. y Nacobbus spp.). INCUBACIÓN: Las raíces previamente lavadas o el follaje son cortados en pequeñas piezas y se colocan en un recipiente con agua limpia dejándose reposar por unas 24-48 horas para que los nemátodos salgan de los tejidos. 76
  • 77. LICUADORA CENTRÍFUGA: Las raíces lavadas se licuan a alta velocidad durante un minuto y el licuado se centrifuga de igual forma que en la flotación para nemátodos ectoparásitos. EMBUDO DE BAERMANN: Se procede de igual forma que lo descrito para ectoparásitos, solo que aquí usamos en lugar de suelo, pequeñas piezas de raíces previamente lavadas. LICUADO-TAMIZADO: Lavar el material vegetal y cortar alrededor de 5 g. de raíces; los trocitos de raíz se colocan en una licuadora en 100 ml. de agua y licuar durante un minuto. El material licuado se pasa a través de un tamiz de 325 mallas, recogiendo el material en un vaso de precipitado. Después observar al microscopio de disección. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA GERARDO, A. M. (2002). Manual de prácticas de Micología. Juan José Ríos, Sin; México. 35 pp. 77
  • 78. 4.3.17 PRÁCTICA 17. MANIPULACIÓN DE NEMÁTODOS INTRODUCCIÓN La manipulación de los nematodos previo a su identificación y conteo una vez que han sido extraídos por las técnicas usadas en el laboratorio, es un proceso muy importante porque lleva implícitos el matado, fijado y pesca de estos organismos. OBJETIVOS: Que el alumno conozca las técnicas de manipulación más usadas para realizar la identificación y conteo de nematodos en un análisis nematológico de una muestra. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio de disección MATERIAL Vidrio de reloj Lámpara de alcohol Pipetas Palillos de bambú Vasos de precipitado Tubos de ensayo Portaobjetos REACTIVOS Agua Fijador F.A. 4:10 DESARROLLO DE LA PRÁCTICA MATADO: Existen varios métodos para realizar el matado de los nemátodos pero todos ellos lo hacen tratando de evitar su distorsión. Hay 2 formas generales para realizar esta operación, ellas son: MATADO EN VIDRIO DE RELOJ: Se coloca en un vidrio de reloj una alícuota de la suspensión nemátodos-agua y enseguida se expone durante 12 segundos a la flama de una lámpara de alcohol. Después se observan al microscopio de disección para verificar su muerte. MATADO EN MASA: Se pone a calentar agua en un vaso de precipitado de 500 ml., cuando alcance una temperatura de 60 ºC se retira de la flama y se introduce durante 3-4 minutos el recipiente (tubo de ensayo) que contiene 10 cc. de agua con nemátodos. También se puede matar dejando hervir el agua introduciendo el tubo de ensayo durante un minuto. 78
  • 79. FIJACIÓN: Una vez que los nemátodos han sido matados, se deja enfriar el agua con nemátodos y se le agrega el fijador (F.A. 4:10) en una porción de 1:1. Fijador F.A. 4:10 Formol al 40%.................... 10 cc. Acido glacial acético............10 cc. Agua destilada.....................10 cc. Nota: Con este fijador los nemátodos rara vez se distorsionan, pero tienden a tornarse café y la parte posterior del estilete de los Tylenchidos se vuelven transparentes después de unos cuantos días. PESCA DE NEMÁTODOS: Después de la extracción, matado y fijación de los nemátodos, es necesario que sean trasladados a un portaobjetos con una gota de agua para observarlos, estudiar sus características e identificación bajo el microscopio biológico. El traslado se hace siempre de uno en uno con la ayuda de una varita de bambú con la punta bien adelgazada. La técnica para pescar nematodos es la siguiente: 1.- En el centro de un portaobjetos se deposita una gota de agua. 2.- Se coloca una alícuota de la suspensión agua-nemátodos matados y fijados en un vidrio de reloj y se observan bajo el microscopio estereoscópico. 3.- Se localiza un nemátodo en el fondo del vidrio de reloj y con la ayuda de la varita de bambú se lleva al nemátodo hacia la superficie lentamente y una vez en la superficie, se saca rápidamente y se coloca en la gota de agua del portaobjetos. 4.- Nuevamente se busca otro nemátodos y se sigue el mismo procedimiento hasta trasladar por lo menos 5 nemátodos al portaobjetos. 5.- Se coloca un cubreobjetos a la gota de agua con nemátodos. Enseguida se observa al microscopio biológico. 6.- Se estudian las características de cada nemátodo para su identificación y su posterior cuantificación. INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA PACHECO, A. J. (2000). Manual de prácticas de laboratorio de Nematología. Juan José Ríos, Sin; México. 20 pp. THORNE, G. (1961). Principles of nematology, Mc. Graw-Hill book Co, New York, Estados Unidos. 553 pp. 79
  • 80. 4.3.18 PRÁCTICA 18. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMÁTODOS INTRODUCCIÓN En nemátodos fijados muchos de los detalles internos del cuerpo, especialmente gónadas, pueden ser obscurecidas por la apariencia granular del intestino. Los especimenes pueden ser aclarados procesándolos a lactófenol ó glicerina, los cuales son medios de montaje apropiados. Además es muy importante con fines académicos o de investigación al conservar preparaciones permanentes de nemátodos. OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar preparaciones permanentes de nemátodos para su conservación. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Estufa Arnold MATERIAL Campana deshidratadora Vidrio de reloj Pelo de angel Portaobjetos Cubreobjetos REACTIVOS Etanol 96% Glicerina Agua destilada Lactofenol Cloruro de calcio DESARROLLO DE LA PRÁCTICA Transferir nemátodos del fijador a un vidrio de syracuse o de reloj que contenga 0.5 ml. de la siguiente solución: Solución I: Etanol 96% .................... 20 partes Glicerina ........................ 1 parte Agua destilada .............. 79 partes Colocar el vidrio de reloj es una campana deshidratadora que contiene 1/10 de su capacidad con etanol 96% y déjelo cuando menos durante 12 horas en una estufa a 35-40 ºC. Esto permite que se elimine casi toda el agua y deja a los nemátodos en una mezcla de glicerina y etanol. Llene el vidrio de reloj con la solución II (5 partes de glicerina y 95 partes de etanol 96%) y parcialmente cerrado, colóquelo durante 3 horas en una estufa a 40 ºC para que se evapore lentamente el etanol hasta que los nemátodos queden en glicerina pura. 80
  • 81. Los nemátodos así deshidratados son transferidos a una gota de glicerina pura (purificarla dejándola en un recipiente abierto en una campana deshidratadora que contenga cloruro de calcio) en un portaobjetos, se colocan 2 tiras de pelo de ángel, después se coloca un cubreobjeto y el borde de éste se sella con esmalte de uñas transparentes. Se colocan etiquetas adhesivas al portaobjeto con los siguientes datos: 1.- Nombre científico 2.- Localidad 3.- Hospedante 4.- No. de hembras y machos 5.- Colector 6.- Fecha INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA YEPEZ, T. G. (1972). Los nemátodos enemigos de la agricultura, Imprenta Universidad de Caracas; Universidad Autónoma de Venezuela, Facultad de Agronomía. Venezuela. 220 pp. 81

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