Antologia Practicas Nematología

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  • Las prácticas me parecen claras y muy factibles para los laboratorios de enseñanza de la Nematología.
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  • 1. UNIVERSIDAD AUTONOMA DE SINALOA ESCUELA SUPERIOR DE AGRICULTURA DEL VALLE DEL FUERTE MANUAL DE PRÁCTICAS DE NEMATOLOGÍA DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA RAMA DE FITOPATOLOGÍA ING. MENA ADRIANO JORGE DANIEL JUAN JOSÉ RÍOS, AHOME, SINALOA. JUNIO DEL 2008
  • 2. INDICE Introducción 1 Instrucciones para el uso de los laboratorios de fitopatología 3 PROGRAMA DE TRABAJO 4 PRÁCTICA #1. Observación y reconocimiento de los nemátodos fitoparásitos en el laboratorio 4 PRÁCTICA #2. Técnicas de muestreo para detectar nemátodos fitoparásitos 6 PRÁCTICA #3. Métodos para la extracción de nemátodos del suelo 12 PRÁCTICA #4. Métodos para la extracción de nemátodos de la raíz 16 PRÁCTICA #5. Manipulación de nemátodos 18 PRÁCTICA #6. Preparaciones permanentes de nemátodos 21 PRÁCTICA #7. Identificación de géneros de nemátodos fitoparásitos 23 PRÁCTICA #8. Cuantificación de población de nemátodos 25 PRÁCTICA #9. Cortes y montajes de modelos perineales de Meloidogyne 27 PRÁCTICA #10. Identificación de géneros de nemátodos fitoparásitos con manejo de claves 31 Bibliografía 33 i
  • 3. INTRODUCCIÓN La siguiente antología tiene como finalidad facilitar el siguiente material de estudio; ya que la vinculación teoría-práctica es una necesidad ineludible en el proceso de enseñanza-aprendizaje de cualquier rama de las ciencias biológicas, premisa que se reproduce para el caso particular de la Nematología. Como sabemos los nemátodos son animales con una organización muy sencilla, que comprenden especies parasitas de plantas (Fitoparasitas), también existen nemátodos Saprófagos que favorecen la descomposición de la materia orgánica, Omnívoros e incluso Depredadores, sin olvidar que hay nemátodos parásitos de animales (Zooparásitos), entre ellos los entomopatógenos que parasitan insectos y pueden emplearse en la lucha biológica contra las plagas. Estos nemátodos los podemos encontrar en todos los lugares; el mar, agua dulce, suelo y partes aéreas de las plantas; donde nos causan serios daños a las plantas cultivadas, sin embargo a menudo pasan desapercibidos por los técnicos y agricultores o sus daños son confundidos con otros factores; como la falta de fertilidad del suelo (deficiencias de nutrientes), escaso contenido de humedad, etc. Esto se debe fundamentalmente a su tamaño microscópico y a que viven en el suelo y/o el interior de las raíces de las plantas. Son de gran importancia económica ya que les causan serios daños a las plantas cultivables afectando su rendimiento, se encuentran ampliamente distribuidos en el suelo, son de fácil diseminación, causan problemas permanentes en el suelo, son polífagos (fitófagos) y de difícil erradicación una vez establecidos en el suelo o la planta. El presente trabajo se ha elaborado con fines didácticos y aplicaciones prácticas para que los estudiantes que estén cursando la materia de Nematología, adquieran los conocimientos teórico-prácticos del manejo de nemátodos en el 1
  • 4. laboratorio de fitopatología. De tal manera que se incluyen las técnicas de muestreo para detectar nemátodos fitoparásitos, también se incluyen los métodos para la extracción de nemátodos del suelo y de la raíz, manipulación de nematodos, así como las preparaciones permanentes de nemátodos y muchas más que se verán mas adelante. Agradezco a los doctores Apodaca Sánchez Miguel Ángel y Quintero Benítez José Alberto, que gracias a la gran experiencia de ambos, contribuyeron con sus comentarios y sugerencias para la recopilación e integración de las practicas del presente trabajo. También expreso mi agradecimiento al Ing. Jesús Guadalupe Loredo Vega y al profesor Marco A. Uribe Domínguez por su gran apoyo en la organización y ordenamiento de la información que contiene este trabajo. Las criticas constructivas de los colegas y estudiantes son bienvenidas, ya que se pretende la mejoría permanente de este trabajo. 2
  • 5. INSTRUCCIONES PARA EL USO DE LOS LABORATORIOS DE FITOPATOLOGÍA El laboratorio constituye un lugar de trabajo para la enseñanza y la investigación; los mayores peligros que presenta no lo son ni el fuego ni las descargas eléctricas, sino el descuido y la irresponsabilidad de los usuarios. Para la conservación y mejor servicio de los laboratorios de fitopatología, las personas que deseen usarlo deberán apegarse a las siguientes disposiciones: LIMPIEZA Los materiales de desecho deberán depositarse en el recipiente de basura, no dejarlos nunca sobre la mesa o tirarlos al suelo. El material de vidrio que se use, deberá llevarse inmediatamente al lavadero para que el ayudante lo tenga limpio para su uso inmediato. El material utilizado por los alumnos en actividades extraclase, deberá ser lavado por el mismo. Cuando no se utilicen las mesas de trabajo, deberán permanecer libres de polvo y otros materiales: no dejar materiales innecesarios sobre ellas. Cuando el caso lo amerite, se deberá cubrir el material (tubos, cajas de petri, material vegetal, etc.) con un papel polietileno, indicando su nombre y la fecha en que lo dejan. Después de hacer uso de algunas substancias y otros materiales de uso general, regresarse a su gaveta, revisando que no hayan quedado residuos de estas substancias sobre la mesa. NOTA: EL MATERIAL QUE NO REÚNA ESTAS CONDICIONES, PODRÁ SER DESECHADO POR EL AYUDANTE O ENCARGADO DE LIMPIEZA 3
  • 6. PROGRAMA DE TRABAJO PRÁCTICA #1. OBSERVACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LOS NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS EN EL LABORATORIO INTRODUCCIÓN Como sabemos los nemátodos son animales con una organización muy sencilla, que comprenden especies parasitas de plantas (Fitoparasitas), también existen nemátodos Saprófagos (vida libre) que favorecen la descomposición de la materia orgánica, Omnívoros e incluso Depredadores, sin olvidar que hay nemátodos parásitos de animales (Zooparásitos), entre ellos los entomopatógenos que parasitan insectos y pueden emplearse en la lucha biológica contra las plagas. Estos nemátodos los podemos encontrar en todos los lugares; el mar, agua dulce, suelo y partes aéreas de las plantas; donde nos causan serios daños a las plantas cultivadas, sin embargo a menudo pasan desapercibidos por los técnicos y agricultores o sus daños son confundidos con otros factores; como la falta de fertilidad del suelo (deficiencias de nutrientes), escaso contenido de humedad, etc. Esto se debe fundamentalmente a su tamaño microscópico y a que viven en el suelo y/o el interior de las raíces de las plantas. OBJETIVOS: Que el alumno reconozca y aprenda a diferenciar los nemátodos fitoparásitos de los de vida libre en el laboratorio. MATERIALES Y MÉTODOS Usando los nemátodos disponibles en el laboratorio, se coloca en un vidrio de reloj una alícuota (2-5 mm) de la suspensión nemátodos-agua, enseguida se pasan al microscopio de disección para ser observados e identificar los nematodos 4
  • 7. fitoparásitos de los de vida libre. Y después se observan en el microscopio biológico. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5
  • 8. PRÁCTICA #2. TÉCNICAS DE MUESTREO PARA DETECTAR NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS (PRÁCTICA DE CAMPO) INTRODUCCIÓN Antes del inicio del muestreo es recomendable la decisión de los propósitos u objetivos a fin de estar en condiciones de aplicar el método de muestreo mas aplicado. Puesto que el “universum” en el que es posible encontrar a los nemátodos puede ser: 1). En el suelo (ya sea en un terreno agrícola o una muestra de suelo) y/o 2). Tejido vegetal (un cultivo o una planta), el examen de muestras de suelo y de raíces es una de los primeros pasos para diagnosticar un problema en un cultivo en el que estos especimenes se están considerando como factores limitantes en la producción. Las especies presentes y el numero que se extraigan, nos proporcionara información útil sobre si son parcial o totalmente los responsables del pobre desarrollo del cultivo. OBJETIVOS: Que el alumno realice diferentes tipos de muestreos y se capacite para aplicar el mas adecuado al cultivo afectado por nemátodos fitoparásitos. MATERIALES Y METODOS 1.- MUESTREO EN UN TERRENO CON CULTIVO ESTABLECIDO A).- MUESTREO DIRIGIDO: Este método se utiliza cuando detectamos manchones de plantas bien definidos que manifiesten síntomas aparentemente por ataque de namátodos (reducción de tamaño, amarillamiento, estaca producción, etc.) y queremos saber si son nemátodos los que están causando esta sintomatología. 6
  • 9. El método consiste en tomar 3 submuestras (plantas enfermas) dentro del manchón a partir del centro hasta la orilla y por separado se toman otras 3 submuestras fuera de él (plantas aparentemente sanas). Cada submuestra consistirá aproximadamente de 100-200 grs. de rizosfera (asociación de suelo mas raíces) por punto de muestreo. La profundidad del muestreo será entre 10-30 cms. Donde se localizan la mayor cantidad de raíces jóvenes y en activo crecimiento; aquí es donde los nemátodos son más abundantes. Las muestras se colectarán en bolsas de polietileno a las que se le colocarán una etiqueta para su identificación. B.- MUESTREO NO DIRIGIDO: Este método se utiliza cuando se quiere conocer la fauna nematológica asociada a un cultivo el cuál no muestra síntomas todavía o bien está afectado de manera general. El método consiste en recorrer una sección del lote en zig-zag y establecer 5 puntos de muestreo (plantas) a una distancia de 20 pasos (metros) uno de otro. En cada punto de muestreo se toman aproximadamente 100 grs. de rizosfera (asociación de suelo más raíces) a una profundidad de 10-30 cms. Eliminando la capa superficial del suelo (unos 10 cms.). Las muestras se colectan en bolsas de polietileno y se le coloca una etiqueta de identificación. 2.- MUESTREO SISTEMATIZADO 8X8 Este método se utiliza cuando se quiere conocer la fauna nematológica existente en un terreno antes de establecer un cultivo. El método consiste en colectar pequeñas submuestras cada 8 pasos (metros) a lo largo del terreno y otros 8 a lo ancho, pero regresando en línea paralela al recorrido anterior, con esto estamos prácticamente cuadriculando el terreno y en los puntos de intersección, tomamos las submuestras a una profundidad entre 7
  • 10. 10-30 cms. de donde se tomarán de 50-60 grs. de suelo. La muestra se colectara en una bolsa de polietileno y se le colocará su etiqueta de identificación. En el caso de que el muestreo sea para detectar nemátodos formadores de quistes, se procede de igual manera que en el caso anterior, solo que las submuestras se obtienen de la superficie del terreno. 3).- MUESTREO EN HUERTAS FRUTALES (AGUACATE, MANGO, VID, CITRICOS, PLATANO, ETEC.) A).- MUESTREO DIRIGIDO: Este método se utiliza cuando detectamos manchones de árboles bien definidos que manifiesten síntomas aparentemente de estar afectados por nemátodos, como son: reducción del crecimiento, amarillamientos, hojas pequeñas y escasas, baja producción, etc. El método consiste en tomas 3 submuestras (árboles enfermos) dentro del manchón a partir del centro hasta la orilla del manchón y por separado se toman otras 3 submuestras fuera de él (árboles sin síntomas). En cada árbol (punto de muestreo) se toman 4 submuestras a 1 m. de distancia del tronco del árbol hacia fuera en dirección de los puntos cardinales. La profundidad del muestreo será en el lugar donde se encuentren el mayor número de raíces jóvenes y en crecimiento activo, lo cual puede variar entre los 10-40 cms. dependiendo del árbol frutal. La cantidad de rizosfera (suelo más raíces) obtenida por submuestras será aproximadamente de 100 grs. Las muestras se colectarán en bolsas de poliétileno y de etiquetaran para su identificación. B).- MUESTREO NO DIRIGIDO: Este método se utiliza cuando se quiere conocer la fauna nematológica asociada a una huerta de un frutal, donde todavía no hay 8
  • 11. síntomas evidentes de ataque de nemátodos o bien se ve afectado de manera general. El método consiste en recorrer una sección en zig-zag y establecer 5 puntos de muestreo (árboles) a una distancia de 20 pasos (metros). Otra forma seria muestreando 1 de cada 10 árboles revisados de la huerta. La obtención de las muestras en cada punto de muestreo sería siguiendo la misma metodología explicada anteriormente en el método dirigido. ¿QUÉ DATOS DEBEN TOMARSE EN EL MUESTREO? Es importante que el técnico anote cierta información que le será de utilidad en la interpretación de los resultados o para que si es necesario un nuevo muestreo le sea fácil localizar el lugar. Debe informarse del tipo de manejo del cultivo (fertilización, aplicación de plaguicidas, riegos, etc.), las características del suelo (textura, ph, etc.), tipo de malezas, así como la localización exacta, fecha, cultivo (anterior, actual), colector y otra información que le sea útil. Para esto deberá tener una libreta de campo y etiquetas para colgar, en estas ultimas anotará el numero de muestra (identificación), fecha de muestreo, cultivo y variedad. ¿CÓMO DEBEMOS MANEJAR LAS MUESTRAS? Las muestras al ser transportadas del campo al laboratorio deben cuidarse que no le peguen directamente los rayos solares y no se golpeen porque muchos nemátodos morirán por deshidratación. En el laboratorio deben ser procesadas inmediatamente, y si no conservarlas en el refrigerador a unos 4 ºC. 9
  • 12. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 10
  • 13. REGISTRO DE MUESTRAS NEMATOLÓGICAS No. de muestra ........ Fecha .................. Cultivos y variedad .................................... Ubicación del lote muestreado ................................................................................... Nombre del propietario .............................................................................................. Dirección y teléfono ................................................................................................... Fecha de siembra ó transplante ................................................................................ Método de siembra ................................. Densidad de siembra ............................... Material de siembra: Certificado ............................ No certificado ............................ Forma de riego: Goteo ......... Aspersión .......... Gravedad .......... Inundación .......... Frecuencia de riegos .................................. Fertilización (material y dosis) .............. .................................................................................................................................... Control de plagas y enfermedades ............................................................................ .................................................................................................................................... Ph del suelo: Alcalino ........................ Neutro ........................ Acido ......................... Tipo de suelo: Arcilloso ............ Limoso ............. Franco ............. Arenoso .............. Topografía del suelo: Plano ................... Ladera ................... Ondulado .................. Síntomas (en follaje y raíz) ........................................................................................ .................................................................................................................................... Fecha aproximada de inicio del problema ................................................................. Superficie: Afectada ...................................... Muestreada ........................................ Numero de muestras por hectárea ..................... Tipo de muestreo ......................... Producción anterior ..................................... Producción actual ................................ Otras observaciones de campo ................................................................................. .................................................................................................................................... .................................................................................................................................... .................................................................................................................................... .................................................................................................................................... .................................................................................................................................... .................................................................................................................................... 11
  • 14. PRÁCTICA #3. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DEL SUELO (ECTOPARÁSITOS) INTRODUCCIÓN Las muestras traídas del campo tienen que ser procesadas en el laboratorio para obtener los nemátodos y observarlos con la ayuda del microscopio para su identificación y conteo. Hay nematodos fitoparásitos que se alimentan de las raíces como ectoparásitos, los que siempre estarán en el suelo; pero otros se introducen al sistema radical (endoparásitos) del cual se alimentan e incluso algunos se mueven hasta las partes áreas. El método de extracción será de acuerdo al tipo de nemátodos mencionados anteriormente. OBJETIVOS: Qué el alumno se adiestre en las diferentes técnicas para la extracción de nemátodos del suelo (nemátodos de vida libre y fitoparásitos). PREPARACIÓN DE LA MUESTRA La muestra que se recogió en el campo se esparce sobre un pedazo de plástico, se desmenuzan los terrones, se eliminan las piedras y separamos las raíces para procesarlas posteriormente y extraer los nemátodos endoparásitos. Una vez mullido el suelo, se procede a homogenizarlo con el fin de que las submuestras formen una muestra compuesta, finalmente se distribuye en el plástico. MATERIALES Y MÉTODOS 1).- MÉTODO DEL EMBUDO DE BAERMANN: Primero se coloca un tubo de goma (8-10 cm. de largo) al cuello de un embudo de 10-15 mm. de diámetro, enseguida se lavan ambos perfectamente y luego se coloca una pinza de presión en el tubo de goma para cerrar el paso del agua. Después se procede a llenar con agua hasta 1 cm. bajo del borde del embudo y se coloca el embudo en la gradilla. 12
  • 15. Enseguida se etiqueta con los datos necesarios como: # de muestra, hospedero, fecha y lugar de colecta Una vez que se ha hecho lo anterior, se procede a preparar una tela de alambre que de antemano esté amoldada al embudo, sobre ella se coloca un papel facial (kleneex) y luego la muestra de suelo (40-50 grs.), se envuelve la muestra y se humedece con una piceta, se coloca la tela de alambre sobre el embudo cuidando que esta toque el agua del embudo. Dejamos el embudo en reposo y a las 24 horas se sacan en un vaso de precipitado unos 10 ml. de agua. En ellos van los nemátodos parásitos y saprófitos que pasaron por el papel facial y la malla. Si se desea, se pueden observar directamente los nemátodos al microscopio de disección, esto se hace colocando unos 5 ml. de la suspensión en un vidrio de reloj, luego se observan. En caso contrario o después de realizado lo anterior, se procede a matarlos y fijarlos para su preservación por tiempo indefinido. 2).- MÉTODO COMBINADO (TAMIZ-EMBUDO DE BAERMANN): Del suelo distribuido en el plástico, se toman muestras en diversos puntos agregándose a una probeta que contiene 200 cc de agua hasta aforar a 300 cc. El contenido de la probeta se pasa a una cubeta A, con 4-5 lts. de agua, en la cual se siguen desmenuzando los terrones hasta que se disuelva bien el suelo. Se agita la solución y la dejamos reposar durante 15-30 segundos para que se sedimente el material pesado y los nemátodos permanezcan flotando. El contenido de la cubeta A, se pasa a través de un tamiz de 100 mallas por pulgada cuadrada a una cubeta B, en la cual se agita y la dejamos sedimentar para pasarlo por un tamiz de 325 (ó 500) y lo que queda en él se pasa al embudo de Baermann. 3).- MÉTODO DE FLOTACIÓN (TAMIZ-CENTRÍFUGA): Lo que queda en el tamiz de 325 ó 500 se pasa a un vaso de precipitado y se distribuyen los tubos de la centrifuga a los que previamente se les agregó 0.5-1.0 g de kaolín, el cual se mezcla bien y se centrifuga a 3000 rpm por 5 minutos, lo que permite la 13
  • 16. sedimentación de los nemátodos junto con las partículas de suelo (favorecido por el kaolín). Después se decanta el sobrenadante eliminando la materia orgánica suspendida. El sobrenadante eliminado se sustituye por solución sucrosa (45 g. de solución sucrosa o azúcar refinada en 100 cc. de agua destilada) y se mezcla con la muestra. Se centrifuga a 3000 rpm durante 2 minutos y el sobrenadante se pasa por el tamiz de 325 ó 500 mallas donde los nemátodos quedan retenidos procediéndose inmediatamente a lavarlos sumergiendo el tamiz en agua para eliminar el azúcar del cuerpo de los nemátodos. Con la ayuda de una piceta se pasan a un vaso de precipitado, quedando listo los nemátodos para hacer observaciones al microscopio y/o matarlos y fijarlos para estudios posteriores de identificación y conteo. 4).- MÉTODO PARA EXTRAER DEL SUELO A NEMÁTODOS FORMADORES DE QUISTES: De la muestra completamente seca (si es de cultivo en pie se debe secar a temperatura ambiente por unos 15 días) se toman 1000 g. que se colocan sobre un tamiz de 8 mallas por pulgada cuadrada sobre la boca del flotador de Fenwick lleno de agua. Se hace pasar el suelo a través del tamiz utilizando una corriente de agua. Lo que hace que el material pesado se vaya al fondo del deposito, floten los quistes mezclados con restos de material orgánico, que son arrastrados hacia fuera al derramarse el agua haciéndolos caer en dos tamices, uno (el superior) de 20 mallas y el otro (inferior) de 60 mallas. El primero retendrá todo los materiales grandes y el segundo partículas pequeñas junto con los quistes, en caso de existir. El material retenido en el tamiz de 60 mallas se pasará a un vaso de precipitado utilizando una piceta el cual contiene agua y se le colocó previamente una tira de papel absorbente. Se agrega una pequeña cantidad de jabón detergente con el fin de romper la tensión superficial y propiciar que la materia orgánica y quistes se 14
  • 17. adhieran al papel. Esta se extrae y se coloca sobre una tira de vidrio para observarse al microscopio estereoscópico y colectar los quistes si la muestra los contiene. RESULTADOS Y DISCUCIÓN 15
  • 18. PRÁCTICA #4. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DE LA RAÍZ (ENDOPARÁSITOS) INTRODUCCIÓN Paralelamente al grupo de los nemátodos ectoparásitos (es decir, aquellos que se alimentan externamente de la raíz y cuyo hábitat es el suelo), existe el grupo de los endoparásitos que se han adaptado a vivir dentro de los tejidos vegetales y que ya no dependen totalmente del ambiente del suelo, sino más bien de lo que ocurre en la planta. Así pues, podemos encontrar nemátodos desde la raíz, tallos y hojas hasta en las flores, frutos y semillas, y que constituyen un serio problema para la agricultura porque son un grupo mucho más peligroso que el anterior. Para la extracción de estos nemátodos, existen algunos métodos que por su sencillez y efectividad vale la pena conocerlos. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y realice los métodos de extracción más sencillos y prácticos que se conocen para extraer nemátodos endoparásitos. MATERIALES Y MÉTODOS 1).- OBSERVACIÓN DIRECTA: Se usa en raíces con agallamiento, se utilizan agujas de disección para desmenuzar las agallas y extraer hembras, juveniles, machos y masas de huevecillos de los nemátodos que causan agallas (Meloidogyne spp. y Nacobbus spp.). 2).- INCUBACIÓN: Las raíces previamente lavadas o el follaje son cortados en pequeñas piezas y se colocan en un recipiente con agua limpia dejándose reposar por unas 24-48 horas para que los nemátodos salgan de los tejidos. 16
  • 19. 3).- LICUADORA CENTRÍFUGA: Las raíces lavadas se licuan a alta velocidad durante un minuto y el licuado se centrifuga de igual forma que en la flotación para nemátodos ectoparásitos. 4).- EMBUDO DE BAERMANN: Se procede de igual forma que lo descrito para ectoparásitos, solo que aquí usamos en lugar de suelo, pequeñas piezas de raíces previamente lavadas. 5).- LICUADO-TAMIZADO: Lavar el material vegetal y cortar alrededor de 5 g. de raíces; los trocitos de raíz se colocan en una licuadora en 100 ml. de agua y licuar durante un minuto. El material licuado se pasa a través de un tamiz de 325 mallas, recogiendo el material en un vaso de precipitado. Después observar al microscopio de disección. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 17
  • 20. PRÁCTICA #5. MANIPULACIÓN DE NEMÁTODOS INTRODUCCIÓN La manipulación de los nemátodos previo a su identificación y conteo una vez que han sido extraídos por las técnicas usadas en el laboratorio, es un proceso muy importante porque lleva implícitos el matado, fijado y pesca de estos organismos. OBJETIVOS: Que el alumno conozca las técnicas de manipulación más usadas para realizar la identificación y conteo de nemátodos en un análisis nematológico de una muestra. MATERIALES Y MÉTODOS 1).- MATADO: Existen varios métodos para realizar el matado de los nemátodos pero todos ellos lo hacen tratando de evitar su distorsión. Hay 2 formas generales para realizar esta operación, ellas son: A).- MATADO EN VIDRIO DE RELOJ: Se coloca en un vidrio de reloj una alícuota de la suspensión nemátodos-agua y enseguida se expone durante 12 segundos a la flama de una lámpara de alcohol. Después se observan al microscopio de disección para verificar su muerte. B).- MATADO EN MASA: Se pone a calentar agua en un vaso de precipitado de 500 ml., cuando alcance una temperatura de 60 ºC se retira de la flama y se introduce durante 3-4 minutos el recipiente (tubo de ensayo) que contiene 10 cc. de agua con nemátodos. También se puede matar dejando hervir el agua introduciendo el tubo de ensayo durante un minuto. 2).- FIJACIÓN: Una vez que los nemátodos han sido matados, se deja enfriar el agua con nemátodos y se le agrega el fijador (F.A. 4:10) en una porción de 1:1. 18
  • 21. Fijador F.A. 4:10 Formol al 40% .................... 10 cc. Acido glacial acético ............10 cc. Agua destilada .....................10 cc. Nota: Con este fijador los nemátodos rara vez se distorsionan, pero tienden a tornarse café y la parte posterior del estilete de los Tylenchidos se vuelven transparentes después de unos cuantos días. 3).-PESCA DE NEMÁTODOS: Después de la extracción, matado y fijación de los nemátodos, es necesario que sean trasladados a un portaobjetos con una gota de agua para observarlos, estudiar sus características e identificación bajo el microscopio biológico. El traslado se hace siempre de uno en uno con la ayuda de una varita de bambú con la punta bien adelgazada. La técnica para pescar nematodos es la siguiente: 1.- En el centro de un portaobjetos se deposita una gota de agua. 2.- Se coloca una alícuota de la suspensión agua-nemátodos matados y fijados en un vidrio de reloj y se observan bajo el microscopio estereoscópico. 3.- Se localiza un nemátodo en el fondo del vidrio de reloj y con la ayuda de la varita de bambú se lleva al nemátodo hacia la superficie lentamente y una vez en la superficie, se saca rápidamente y se coloca en la gota de agua del portaobjetos. 4.- Nuevamente se busca otro nemátodos y se sigue el mismo procedimiento hasta trasladar por lo menos 5 nemátodos al portaobjetos. 5.- Se coloca un cubreobjetos a la gota de agua con nemátodos. Enseguida se observa al microscopio biológico. 6.- Se estudian las características de cada nemátodo para su identificación y su posterior cuantificación. 19
  • 22. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 20
  • 23. PRÁCTICA #6. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMÁTODOS INTRODUCCIÓN En nemátodos fijados muchos de los detalles internos del cuerpo, especialmente gónadas, pueden ser obscurecidas por la apariencia granular del intestino. Los especimenes pueden ser aclarados procesándolos a lactófenol ó glicerina, los cuales son medios de montaje apropiados. Además es muy importante con fines académicos o de investigación al conservar preparaciones permanentes de nemátodos. OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar preparaciones permanentes de nemátodos para su conservación. MATERIALES Y MÉTODOS Transferir nemátodos del fijador a un vidrio de syracuse o de reloj que contenga 0.5 ml. de la siguiente solución: Solución I: Etanol 96% .................... 20 partes Glicerina ........................ 1 parte Agua destilada .............. 79 partes Colocar el vidrio de reloj es una campana deshidratadora que contiene 1/10 de su capacidad con etanol 96% y déjelo cuando menos durante 12 horas en una estufa a 35-40 ºC. Esto permite que se elimine casi toda el agua y deja a los nemátodos en una mezcla de glicerina y etanol. Llene el vidrio de reloj con la solución II (5 partes de glicerina y 95 partes de etanol 96%) y parcialmente cerrado, colóquelo durante 3 horas en una estufa a 40 ºC para que se evapore lentamente el etanol hasta que los nemátodos queden en glicerina pura. 21
  • 24. Los nemátodos así deshidratados son transferidos a una gota de glicerina pura (purificarla dejándola en un recipiente abierto en una campana deshidratadora que contenga cloruro de calcio) en un portaobjetos, se colocan 2 tiras de pelo de ángel, después se coloca un cubreobjeto y el borde de éste se sella con esmalte de uñas transparentes. Se colocan etiquetas adhesivas al portaobjeto con los siguientes datos: 1.- Nombre científico 4.- No. de hembras y machos 2.- Localidad 5.- Colector 3.- Hospedante 6.- Fecha RESULTADOS Y DISCUSIÓN 22
  • 25. PRÁCTICA #7. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS INTRODUCCIÓN Los nemátodos fitoparásitos abarcan un gran número de géneros y especies de gran importancia agrícola. El conocimiento de la sintomatología, morfología, biología y control es de interés fundamental para el parasitólogo. El control de los nemátodos fitoparásitos, se basa en una identificación correcta del nemátodo en cuestión, de ahí que sea importante conocer las características morfológicas más importantes de los principales géneros de estos patógenos. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y diferencie las características morfológicas de los principales géneros de nemátodos fitoparásitos de importancia agrícola. MATERIALES Y MÉTODOS 1.- Elaborar montajes a partir de material vegetal enfermo o suelo procesado, los montajes se harán siguiendo la metodología descrita anteriormente. 2.- Usando los montajes permanentes disponibles en el laboratorio, observar al microscopio biológico los especimenes, con los objetivos 10x y 40x. 3.- Dibujar cada espécimen cuidadosamente, resaltando las características más importantes: forma, tamaño, tipo de estilete, tipo de esófago, unión del bulbo basal con el intestino, posición de la vulva, tipo de cola, características del sistema reproductor de la hembra, etc. 4.- Se estudiarán los siguientes géneros: 23
  • 26. a).- Meloidogyne g).- Helicotylenchus b).- Globodera h).- Mononchus c).- Heterodera i).- Rhabditis d).- Punctodera j).- Ditylenchus e).- Nacobbus k).- Otros f).- Xiphinema RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1.- Se presentan los dibujos tal como se hicieron en el laboratorio. 2.- Indique cómo diferenciar entre sí los géneros observados, para ello consulte la literatura al respecto. 24
  • 27. PRÁCTICA #8. CUANTIFICACIÓN DE POBLACIÓN DE NEMÁTODOS INTRODUCCIÓN Las poblaciones de nemátodos en el suelo y raíces aumentan o disminuyen a través del tiempo y son afectadas por las condiciones fisiológicas del hospedante, la presencia de otros organismos, el tipo de suelo y por influencias ambientales y edáficas. OBJETIVOS: Que el alumno conozca una metodología para cuantificar poblaciones de nemátodos, en una muestra de suelo o raíces. MATERIALES Y MÉTODOS En un vaso de precipitado se toman 20 ml. de la suspensión agua con nemátodos del método de extracción desarrollado; enseguida se extrae una alícuota de 1 ml. usando una jeringa hipodérmica y se vierte en un vidrio de reloj, previamente cuadriculado marcando cuadros de 5 mm. por lado. Si los nemátodos están vivos se matan bajo la flama de una lámpara de alcohol durante 12 segundos. Después se deja enfriar y se coloca el vidrio de reloj bajo el microscopio de disección; se cuentan los nemátodos en forma ordenada en cada cuadro. Esta operación se repite con 5 alícuotas de 1 mm. del mismo vaso de precipitado para sacar un promedio. Después se obtiene mediante una regla de tres simple, el número total de nemátodos en los 20 ml. que representan la muestra procesada. Cuando en una muestra tenemos varios géneros se cuantifica cada uno por separado. Ejemplo: Se quiere conocer el número de nemátodos contenidos en una muestra de 1 kg. de suelo procedente de una huerta de cítricos. Para la extracción de los 25
  • 28. nemátodos en el laboratorio se empleo el método tamiz-embudo, se procesaron 200 ml. de suelo. A las 48 horas se tomaron 20 ml. de agua con nemátodos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1.- Los resultados presentarlos en cuadros. 26
  • 29. PRÁCTICA #9. CORTES Y MONTAJES DE MODELOS PERINEALES DE Meloidogyne INTRODUCCIÓN La identificación de las especies del género Meloidogyne spp. esta basada primordialmente en el tipo de modelo perineal que presentan las hembras; por tal motivo es importante cortar y montar adecuadamente la región genital de estos nematodos. OBJETIVOS: Que el alumno conozca una de las metodologías para identificar especies de Meloidogyne. MATERIALES Y MÉTODOS 1.- Para la extracción de nemátodos del género Meloidogyne se observa la raíz afectada con nódulos, y con 2 agujas de disección se extraen las hembras (globosas) endoparásitas. 2.- Sobre un portaobjetos, poner una gota de agua o acido láctico. 3.- Colocar una hembra de Meloidogyne sobre la gota. 4.- Con una aguja hipodérmica (para insulina), realizar un corte perineal (región del ano y vulva) debajo de la línea ecuatorial. Se elimina la parte anterior del cuerpo. 5.- Se lava y limpia el corte cuidando no romper la estructura. 6.- Sobre un portaobjetos limpio, se deposita una gota de lactófenol y sobre este se le colocan 4 cortes, de forma tal que la parte interna del modelo perineal haga contacto con la superficie del portaobjetos. 7.- Colocar un cubreobjetos, sellar con barniz de uñas y etiquetar. 8.- Se observan al microscopio compuesto para su identificación, de acuerdo a las estructuras que tiene en la parte anal y con base en claves taxonómicas para especies de Meloidogyne se logra la identificación a nivel especie. 27
  • 30. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 28
  • 31. CLAVES DE LAS ESPECIES MAS IMPORTANTES DEL GÉNERO Meloidogyne BASADAS EN LA MORFOLOGIA DEL PATRÓN PERINEAL 1. Puntuaciones presentes en el área terminal de la cola M. hapla Puntuaciones ausentes en el área terminal de la cola 2 2. Campo lateral marcado con profundas incisuras, generalmente extendiéndose más allá del perineum M. javanica Campo lateral no claramente marcado o terminado cerca del perineum 3 3. Estrías del arco dorsal fusionadas y entremezcladas M. chitwoodi Estrías del arco dorsal no fusionadas ni entremezcladas 4 4. Campo lateral cerca del perineum marcado por incisuras gruesas, curvadas, elevadas y dobladas M. exigua Campo lateral no marcado por estrías curvadas y dobladas 5 5. Arco dorsal alto y cuadrado, estrías lisas a onduladas M. incognita Arco dorsal bajo y redondeado 6 6. Estrías en el arco dorsal cerca del perineum gruesas y toscas M. artiellia Estrías en el arco dorsal cerca del perineum no gruesas ni toscas 7 7. Estrías en el arco dorsal redondeadas formando hombreras M. arenaria Arco dorsal sin hombreras evidentes 8 8. Fasmidias grandes M. naasi Fasmidias muy pequeñas M. graminicola MORFOLOGÍA DEL PATRÓN PERINEAL DE LAS HEMBRAS DE Meloidogyne 2.1.- Meloidogyne incognita 2.19.- Meloidogyne hapla 29
  • 32. 1.1.- Morfología general de un 2.7.- Meloidogyne javanica modelo perineal 2.13.- Meloidogyne arenaria PRÁCTICA #10. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS CON MANEJO DE CLAVES INTRODUCCIÓN 30
  • 33. Es muy importante que el estudiante adquiera a través de la práctica, la habilidad para identificar los géneros de nemátodos más comunes, distinga sus rasgos distintivos y determine su clasificación, la sintomatología que causan en las plantas y los principales hospederos. Lo anterior es importante porque con frecuencia los nemátodos son más dañinos de lo que puede imaginarse, por lo que su determinación e identificación permiten al agrónomo aplicar las medidas de control más eficientes. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y desarrolle la metodología necesaria para identificar géneros de nemátodos, mediante el manejo de claves. MATERIALES Y MÉTODOS Para la realización de esta práctica es necesario contar con las “claves para la identificación de nemátodos” de Fernando de la Jara A. y Filiberto Zerón B. El desarrollo de la misma se basará en el manejo de las claves. 1.- Elaborar montajes a partir de muestras de nemátodos matados y fijados, los montajes se harán siguiendo la metodología descrita anteriormente. 2.- Observar detalladamente las características del nemátodo bajo el microscopio biológico con el objetivo 40x. 3.- Siga cuidadosamente la secuencia de la clave hasta llegar al género al que pertenece el nemátodo en estudio. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 31
  • 34. BIBLIOGRAFÍA AGRIOS, G. N. (1995). Fitopatología, 2da. Ed. Limusa. México. 838 pp. 32
  • 35. CEPEDA, S. M. (1995). Prácticas de nematología agrícola. Ed; Trillas. México. 109 pp. GERARDO, A. M. (2002). Manual de prácticas de Micología. Juan José Ríos, Sin; México. 35 pp. JESSE, R. (1978). Fitonematología tropical. Campo experimental de la Universidad de Puerto Rico, Puerto Rico. 256 pp. MEREDITH, J. A. (1973). Algunos métodos de campo y laboratorio para trabajar con nemátodos. Facultad de Agronomía. Universidad Central de Venezuela. Maracay, Venezuela. 79 pp. PACHECO, A. J. (2000). Manual de prácticas de laboratorio de Nematología. Juan José Ríos, Sin; México. 20 pp. THORNE, G. (1961). Principles of nematology, Mc. Graw-Hill book Co, New York, Estados Unidos. 553 pp. YEPEZ, T. G. (1972). Los nemátodos enemigos de la agricultura, Imprenta Universidad de Caracas; Universidad Autónoma de Venezuela, Facultad de Agronomía. Venezuela. 220 pp. 33