Obtención e identificación de proteínas encontradas en la leche y en la clara de huevo.

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Práctica de laboratorio relacionada con la Caseína y ovoalbúmina

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Obtención e identificación de proteínas encontradas en la leche y en la clara de huevo.

  1. 1. MAS INFORMACIÓn (+593) 0998883344 https://www.facebook.com/tato762 ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA CARRERA DE INGENIERÍA AGROPECUARIA INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA PERÍODO: Marzo - Julio 2013 ASIGNATURA: Bioquímica. INTEGRANTES: Fabricio Guncay Renato Andrade Nelson Vinueza NIVEL: Tercero DOCENTE : Ing. Freddy Enríquez FECHA: 27 de Junio del 2013 SANTO DOMINGO-ECUADOR 2013
  2. 2. ÍNDICE 1. TEMA: ........................................................................................................................... 3 2. INTRODUCCIÓN: ........................................................................................................ 3 3. OBJETIVO GENERAL:................................................................................................ 3 4. OBJETIVOS ESPECIFICOS:........................................................................................ 4 5. EQUIPOS:...................................................................................................................... 4 6. MATERIALES: ............................................................................................................. 4 7. REACTIVOS E INSUMOS........................................................................................... 4 8. REVISIÓN DE LITERATURA:.................................................................................... 4 Caseína:.............................................................................................................................. 4 Ovoalbúmina:..................................................................................................................... 5 Reacción de Biuret:............................................................................................................ 5 Reacción xantoproteica...................................................................................................... 6 Reacción para compuestos azufrados: ............................................................................... 6 9. PROCEDIMIENTO:...................................................................................................... 7 Aislamiento de la caseína: ................................................................................................. 7 Preparación de la solución de ovoalbúmina ...................................................................... 7 Reconocimiento de proteínas............................................................................................. 7 Reacción de Biuret............................................................................................................. 7 Reacción Xantoproteica..................................................................................................... 7 Reacción para compuestos azufrados ................................................................................ 7 10. RESULTADOS Y DISCUSIÓN:............................................................................... 8 Determinación de contenido de caseína en la leche........................................................... 8 Reacción de Biuret............................................................................................................. 8 Reacción Xantoproteica..................................................................................................... 9 11. CONCLUSIONES.................................................................................................... 10 12. RECOMENDACIONES: ......................................................................................... 10 13. BIBLIOGRAFIA:..................................................................................................... 11 14. ANEXOS:................................................................................................................. 12
  3. 3. 1. TEMA: Obtención e identificación de proteínas encontradas en la leche y en la clara de huevo. 2. INTRODUCCIÓN: Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en la célula, ellas constituyen más del 50% del peso seco de la célula. Cada tipo celular, tiene un rol específico determinado por su composición proteica. Con la posibilidad de que 20 (o 22) aminoácidos diferentes puedan estar unidos en cualquier orden para conformar polipéptidos de cientos de aminoácidos, tienen el extraordinario potencial de producir una gran cantidad de variantes en su conformación. Las proteínas están formadas por aminoácidos. Los aminoácidos, gráficamente, son representados como ladrillos que forman una pared, los aminoácidos forman diferentes proteínas específicas, las proteínas son el fundamento mismo de la vida. En efecto, debido a la gran variedad de proteínas existentes y como consecuencia de su estructura, las proteínas cumplen funciones sumamente diversas, participando en todos los procesos biológicos y constituyendo estructuras fundamentales en los seres vivos. Este grupo de nutrientes se encarga básicamente de formar y renovar las células de nuestro cuerpo. Además, distribuye el agua contenida, forma enzimas, hormonas y anticuerpos y, en última instancia, nos proporciona energía. Los alimentos que ingerimos nos proveen proteínas. Pero tales proteínas no se absorben directamente ni como tales, sino que, luego de su desdoblamiento (“hidrólisis” o rotura), causado por el proceso de digestión, atraviesan la pared intestinal en forma de aminoácidos. La extracción de proteínas celulares comienza siempre con una ruptura celular o lisis. Los métodos más utilizados se basan esencialmente en la homogenización de los tejidos y la destrucción de los límites celulares por medio de diferentes procedimientos físicos y/o químicos. Obteniéndose lo que se denomina extracto crudo. Los objetivos a lograr en esta etapa son maximizar la liberación de las proteínas de interés, evitando la degradación térmica o las alteraciones secudarias por oxidación, proteólisis La funcionalidad de la proteína es algunas veces considerada solo importante para procesos de alta demanda, como extrusiones o emulsiones. Sin embargo, la funcionalidad de la proteína debe ser considerada para todos los productos y sistemas de consumo humano. La leche es un alimento rico en proteínas aunque en su mayoría, se encuentran en reducidas cantidades entre el 3 y el 3,5% de la leche de vaca, está formado por proteínas. Estas proteínas se distribuyen en seroproteínas o proteínas solubles, caseínas y otras sustancias nitrogenadas de naturaleza no protéica., así mismo las proteínas del huevo la principal proteína de la clara de huevo es la ovoalbúmina, un tipo de albúmina, además de tener el mejor perfil proteico que se puede encontrar en un alimento, la clara contiene vitaminas y minerales y aporta aproximadamente 17 calorías, además de la ovoalbúmina, la clara de huevo tiene otras proteínas como la ovomucina responsable de cuajar el huevo pochado o frito, la conalbúmina y el ovomucoide. 3. OBJETIVO GENERAL: Aplicar técnicas para la separación y obtención de proteínas y su identificación mediante reacciones químicas.
  4. 4. 4. OBJETIVOS ESPECIFICOS:  Determinar la solubilidad de las proteínas  Determinar la cantidad de caseína presente en la leche.  Verificar si la ovoalbúmina es una proteína  Comprobar si la ovoalbúmina tiene proteínas con azufre en su composición. 5. EQUIPOS: Balanza electrónica 6. MATERIALES:  tubos de ensayo  Matraz Erlenmeyer  Pinzas  Mechero  Vaso de precipitación  Embudo  Papel filtro  Pipeta aforada 20 ml  Pipetas  Placa calefactora  Varilla de vidrio  Vaso de precipitación 100 ml  Vasos de precipitación 250 ml 7. REACTIVOS E INSUMOS  Ácido acético 1 M  Etanol  Éter etílico  Agua  Hidróxido de sodio 1N  Sulfato de cobre 10%  Cloruro mercúrico 10%  Bicarbonato de sodio 10%  Nitrato de plata 1%  Nitrato de potasio 10%  Alcohol de 90º  Solución de ovoalbúmina  Acido clorhídrico 1N  Acetato de plomo  Ácido nítrico concentrado 8. REVISIÓN DE LITERATURA: Caseína: (Alais, 2003) La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica (caseína cálcica). La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2.7% en composición de la leche.
  5. 5. La caseína está formada por alpha (s1), alpha (s2)-caseína,β caseína , y kappa – caseína formando una micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se añade la kappa caseína a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo de caseína que es solubilizado en forma de micela. Esta micela está estabilizada por la kappa caseína mientras que las alfa y beta son fosfoproteínas que precipitan en presencia de iones calcio. (Ortuño, 2006) La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a Ph 4.6. El pH de la leche es 6.6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica. Si se añade acido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita. La función biológica de las micelas de la caseína es transportar grandes cantidades de Ca y P altamente insolubles en forma líquida a los lactantes y formar un coagulo en el estómago para favorecer una nutrición eficiente. Además la caseína, Ca y P la micela formada también contiene citrato, iones, lipasa, enzimas plasmáticas y suero. Estas micelas ocupan del 6-12 % del volumen total de la leche. Ovoalbúmina: (Gil, 2010) Es la principal proteína de la clara del huevo (60-65% del peso de la clara de huevo). Además de tener el mejor perfil proteico que se puede encontrar en un alimento, la clara contiene vitaminas y minerales y aporta aproximadamente 17 calorías. Es una proteína de referencia en bioquímica y es conocida en la industria alimentaria por sus propiedades como transportadora, estabilizadora y formadora de emulsiones. Se desnaturaliza fácilmente con el calor. Es la proteína de mayor valor biológico ya que tiene muchos de los ocho aminoácidos esenciales. Es rica en cisteína y metionina y presenta grupos sulfhídrilos. La presencia de estos grupos sulfhidrilos hacen una gran contribución aparte del sabor, textura y aroma característicos del huevo. Sus propiedades es que son insoluble en agua, soluble en soluciones alcalinas, resistente a tratamientos térmicos suaves (coagula a 80ºC) y rica en cisteína y metionina. Se pueden aplicar en la medicina en los casos especiales de intoxicación por metales pesados (tales como el hierro) se puede administrar unas dosis de ovoalbúmina. La ovoalbúmina está relacionada con los metales pesados y su misión es la de atrapar los iones de los metales pesados debido a la presencia de las uniones sulfhídricas de la proteína. Su coagulación tras el proceso de absorción previene la absorción de metales en el tracto gastrointestinal previniendo el envenenamiento. En algunos casos, es utilizada para aliviar quemaduras o como regenerador de la piel. Reacción de Biuret: (Mora, 2007) Es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida.
  6. 6. Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El hidróxido de potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar. Se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un método colorimétrico que permite determinar la concentración de proteínas de una muestra mediante espectroscopia ultravioleta visible a una longitud de onda de 560 nm (para detectar el ion Cu2+ ). Reacción xantoproteica (Guarnizo, 2003) Es un método que se puede utilizar para determinar la presencia de proteínas solubles en una solución, empleando ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali, se torna color amarillo oscuro. La reacción xantoproteica se puede considerar como una sustitución electrofílica aromática de los residuos de tirosina de las proteínas por el ácido nítrico dando un compuesto coloreado amarillo a pH ácido. Según las guías químicas es una reacción cualitativa, mas no cuantitativa. Por ende determina la presencia o no de proteínas. Para cuantificar se usa otra reacción, como la de Biuret, y se hace un análisis espectro fotométrico. Reacción para compuestos azufrados: (Flanzy, 2003) Son compuestos que presentan azufre como es el caso de la metionina y de la cisteína los dos aminoácidos azufrados son esenciales, la metionina estrictamente, mientras que la cisteína puede formarse a partir de la metioniona (no al revés). Las dietas basadas en leguminosas pueden ser deficientes en estos aminoácidos. Además, ambos son bastante inestables frente a condiciones de oxidación. La cisteína es muy importante en el mantenimiento de la estructura terciaria y cuaternaria de la mayoría de las proteínas mediante la formación de puentes disulfuro, en dímeros de la cisteína formados por oxidación. Junto a la cisteína, la metionina es uno de los dos aminoácidos proteinogénicos que contienen azufre. Este deriva de la s-Adenosil metionina (SAM) sirviendo como donante de metiles. La metionina es un intermediario en la biosíntesis de la cisteína, la carnitina, la taurina, la lecitina, la fosfatidilcolina y otros fosfolípidos. Fallos en la conversión de metionina pueden desembocar en ateroesclerosis. Este aminoácido es usado también por las plantas en la síntesis del etileno. Este proceso es conocido como el ciclo de Yang o el ciclo de la metionina.
  7. 7. 9. PROCEDIMIENTO: Aislamiento de la caseína: Se calentó en un vaso de precipitación 150ml de agua destilada a 38ºC, se puso 50ml de leche y luego gota a gota y con agitación, se adicionó ácido acético 1M hasta que se observe que se forma un precipitado (la leche se corta). Se dejó sedimentar y se filtró sobre papel de filtro usando un embudo de cristal. Se lavó el precipitado con 20ml de etanol en el mismo filtro, se seca el precipitado colocando varios pliegues de papel de filtro, luego se colocó el precipitado en un vaso de precipitación pequeño previamente pesado, se volvió a pesar el vaso con el precipitado y luego se adicionó 5ml/g de éter etílico. Se filtró nuevamente. Se desechó el líquido quedando un precipitado blanco de fácil manipulación que es la caseína. Preparación de la solución de ovoalbúmina En un vaso se puso la clara de huevo, se batió durante algunos instantes, luego se mezcló con 5 veces su volumen de agua. Se filtró la mezcla. Reconocimiento de proteínas Reacción de Biuret En dos tubos de ensayo se colocó 2 ml de solución de clara de huevo. Al tubo 1 se agregó 2cc de agua destilada. Se añadió igual volumen de solución de hidróxido de sodio. Se agitó. Se agregó tres gotas de solución de sulfato de cobre y se agita. Se dejó reposar la mezcla, y se observó la reacción En el tubo 2 se añadió 2cc de solución de hidróxido de sodio. Se agitó. Se agregó tres gotas de solución de sulfato de cobre y nuevamente se agitó. Se dejó reposar la mezcla, y se observó la reacción. Reacción Xantoproteica En un tubo de ensayo se puso 3 ml de solución problema. Se añadió lentamente 1 ml de ácido nítrico concentrado. Se calentó a baño maría. Se dejó enfriar y se agregó unas gotas de hidróxido de sodio y se observó el cambio de color. Reacción para compuestos azufrados Se colocó en el tubo de ensayo de 2 a 3cc. de albúmina de huevo (clara de huevo). Se añadió 2cc. de solución de hidróxido sódico al 20%. Y se añadió 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5%. Se calentó el tubo hasta su ebullición, si se formó un precipitado de color negruzco nos indicó que se ha formado sulfuro de plomo, utilizándose el azufre de los aminoácidos, lo que sirvió para identificar proteínas que tienen en su composición aminoácidos con azufre.
  8. 8. 10. RESULTADOS Y DISCUSIÓN: Determinación de contenido de caseína en la leche Tabla 1. Pesos de materiales empleados para determinación de contenido de caseína Material Pesos Probeta vacía 72,37 Probeta con leche 126,06 Leche 53,69 Vaso de precipitación vacío 115,91 Vaso con precipitado 129,45 Peso precipitado 13,54 Peso caseína seca 2,38 El porcentaje de caseína obtenido en el laboratorio 3,65% no concuerda con el porcentaje de Alais (2003) que es de 2,7% una de las causas de la variación del porcentaje podría ser que la leche del laboratorio en comparación con la leche de (Alais 2003), tubo diferente grado de procesamiento. Reacción de Biuret -Con ovoalbúmina
  9. 9. En la foto 1 se observa que la primera reacción fue positiva en los tubos con la solución de ovoalbúmina, por este motivo tomó una coloración violeta indicando la presencia de enlaces peptídicos, al contrario en la solución solamente con el agua destilada tomó una coloración celeste debido a que adoptó el color del sulfato de cobre, por lo tanto fue una reacción negativa. En la foto 2 se observa que esta reacción es positiva mientras haya dos o mas enlaces peptídicos. La coloración de la primera reacción fue de un color violeta, lo que me indica que existe presencia de proteínas, por ende estoy de acuerdo con lo que cita Mora (2007). El color de la segunda reacción fue de celeste, no de violeta; lo que me indica que en esta reacción no hay presencia de proteínas, péptidos cortos u otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos, por tal estoy de acuerdo con lo que menciona Mora (2007). Reacción Xantoproteica El ácido nítrico (HNO3) reacciona con el radical fenilo de los aminoácidos de la ovoalbúmina, radical que se transforma en hidroxi-benceno, que da el color amarillo característico de esta reacción, debido a la formación de un compuesto aromático nitrado, por medio de sustitución nucleofílica, lo que indica la presencia de proteínas con aminoácidos portadores de anillos aromáticos. Con la reacción xantoproteica tuvimos un color amarillento como lo cita Guarnizo (2003), esto nos quiere decir que en la reacción se produjo un resultado positivo en las proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos, especialmente con presencia de tirosina
  10. 10. Compuestos azufrados Los enlaces peptídicos se hidrolizan con facilidad al calentarse, es por eso que se sometió el tubo de ensayo con ovoalbúmina e hidróxido de sodio a baño María. La mezcla de la proteína con hidróxido de sodio formó una precipitación lechosa tal como se observa en la figura 7, la reacción sucedida se describe a continuación: R-SH + 2 NaOH  R-OH + SNa2 + H2O La ecuación nos muestra que el hidróxido de sodio reacciona con el aminoácido correspondiente (metionina o cisteína) separando el azufre que éste contiene, cuando agregamos las gotas de acetato de plomo, observamos el cambio de color en la muestra de proteína, mientras que en el agua permaneció incoloro. Este cambio de color se debe a la formación de un precipitado de aspecto negruzco llamado sulfuro de plomo, el cual fue el producto final de la reacción de ovoalbúmina con hidróxido de sodio y acetato de plomo. De esta manera se pudo comprobar que la ovoalbúmina contiene aminoácidos azufrados (cisteína o metionina). Por medio de la reacción para compuestos azufrados tuvimos un color negruzco, esto nos indica que la reacción tiene en su composición aminoácidos con azufre tal como lo cita Flanzy (2003), estos aminoácidos son la metionina y la cisteína. 11. CONCLUSIONES La caseína luego de que la leche se cortó no fue soluble en agua, debido a este motivo se la pudo filtrar. La ovoalbúmina fue soluble en agua, gracias a esto se pudo formar una solución para su posterior análisis. El contenido de proteínas presente en la leche es muy bajo, a pesar de que la leche empleada para la práctica era una leche pura, sin procesar tuvo un contenido de 4,43% de caseína la cual contiene el 82,5% de las proteínas de la leche, por lo tanto el 3,65% de la proteína de la leche está contenida en la caseína. Se pudo observar mediante varias reacciones que la clara del huevo tiene proteínas que la conforman, esta proteína es la ovoalbúmina. La ovoalbúmina tiene proteínas con azufre en su composición, esto se pudo identificar mediante la reacción de la solución de la clara del huevo con el hidróxido de sodio y el acetato de plomo, el cual forma sulfuro de plomo con el azufre presente en algunos aminoácidos (cisteína y metionina) de la ovoalbúmina. 12. RECOMENDACIONES: Colocar la leche en una probeta o recipiente que tenga un diámetro pequeño para facilitar la posterior separación del suero de leche y el precipitado, ser pacientes y esperar que se precipite lo suficiente antes de separarlos. Tener mucha cautela al momento de pesar las muestras, para evitar errores que posteriormente perjudiquen el cálculo de contenido de caseína en la leche.
  11. 11. Al momento de extraer la clara de huevo tener cuidado que no se vaya a mezclar con la yema, debido a que dificultaría la preparación de la solución para su respectivo análisis. 13. BIBLIOGRAFIA:  Alais, C. (2003). Ciencias de la leche. España: REVERTE.  Flanzy, C. (2003). Enología: Funadamentos Científicos y Tecnológicos. Madrid - España: Ediciones Mundi Prensa.  Gil, A. (2010). Composicion y Calidad Nutritiva de los Alimentos. Madrid - España: Medica Panamericana.  Guarnizo, A. (2003). Experimentos de química orgánica. Colombia: Elizcom.  Mora, S. Q. (2007). Manual de experimentos de laboratorio para Bioquimica. Costa Rica: EUNED.  Ortuño, Á. V. (2006). Introducción a la Química Industrial. España: REVERTE.  http://www.csi- csif.es/andalucia/modules/mod_ense/revista/pdf/Numero_21/ALMUDENA_MOR ENO_2.pdf
  12. 12. 14. ANEXOS: Foto 1. Reacción de Biuret Foto 2. Reacción en enlaces peptídicos Foto 3. Probeta con leche Foto 4. Reacción xantoproteica Foto 5. Solución de ovoalbúmina con NaOH Foto 6. Tubo con solución de ovoalbúmina en baño maría, reacción compuestos azufrados Foto 7. Se forma precipitado negruzco Foto 8. Precipitado de caseína

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