• Share
  • Email
  • Embed
  • Like
  • Save
  • Private Content

Loading…

Flash Player 9 (or above) is needed to view presentations.
We have detected that you do not have it on your computer. To install it, go here.

Like this presentation? Why not share!

Protein engineering

on

  • 3,125 views

 

Statistics

Views

Total Views
3,125
Views on SlideShare
3,125
Embed Views
0

Actions

Likes
2
Downloads
0
Comments
0

0 Embeds 0

No embeds

Accessibility

Categories

Upload Details

Uploaded via as Microsoft PowerPoint

Usage Rights

© All Rights Reserved

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Processing…
Post Comment
Edit your comment

    Protein engineering Protein engineering Presentation Transcript

    • REKAYASA PROTEINRekayasa protein adalah campuran menarik daripengetahuan :Biologi MolekulerAnalisa Struktur Kimia ProteinMatematikaEkonomiKomputasi atau Bio InformatikaBiokimiaDengan tujuan pengembangan protein untuk sesuatuyang berguna atau berharga di bidang industri,kesehatan, dsbnya.
    • SEJARAH REKAYASA PROTEIN
    • TUJUAN REKAYASA PROTEIN•Mengembangkan protein untuk sesuatu yang berguna atau berharga di bidang industri, kesehatan, dll. dengan :• Membentuk produk baru dari suatu campuran protein• Merubah struktur atau sifat protein sehingga dihasilkan perubahan pada produk protein dengan target struktur atau sifat yang diinginkan.• Merubah protein sehingga dapat diterjemahkan untuk memberikan informasi dan aplikasi lain.• Menganalisa sifat protein yang ada untuk aplikasi produk lain• Meningkatkan kemampuan dan efisiensi penggunaan produk untuk suatu produk
    • REKAYASA PROTEIN Protein EngineeringRational Protein Design Nature Proteins with Novel Properties Random Mutagenesis
    • REKAYASA PROTEINKEGIATAN REKAYASA PROTEIN :  Peningkatan katalisis dengan substrat alami atau kofaktor  Peningkatan katalisis dengan substrat nonnatural atau kofaktor  Peningkatan katalisis di nonnatural pelarut  Peningkatan ligan mengikatSTABILITAS PROTEIN: • Peningkatan termostabilitas • Peningkatan aktivitas pada pH alternatif • Peningkatan aktifitas dalam kekuatan ion yang berbeda • Peningkatan protein lipat • Penurunan kerentanan terhadap proteolisis • Farmakokinetik
    • REKAYASA PROTEINEKSPRESI PROTEIN: • Peningkatan tingkat ekspresi di host nonnatural • Target ekspresi ke lokasi selular yang berbeda • Penambahan tag untuk mendeteksi ekspresi protein • Perubahan modifikasi posttranslational SIFAT-SIFAT LAIN:  Menambahkan tag untuk memfasilitasi pemurnian  Mengubah kecenderungan untuk polimerisasi  Menambahkan tag untuk memvisualisasikan lokalisasi  Merekayasa mengikat situs alosterik  Mengubah titik isoelektrik  Menurunkan imunogenisitas
    • APLIKASI REKAYASA PROTEIN•Pembuatan enzim•Memproduksi jenis obat obatan•Menghasilkan vaksin antibody tertentuBeberapa Contoh Aplikasi langsung secara komersial sebagai berikut :•Menggukanan perancah/scaffold protein berdasarkan domain pada Protein A untukmengembangkan molekul moleku seperti antibody (Company : Affibody)•Menambahkan asam amino yang tidak terkodekan kapada protein, memungkinkan sintesaprotein dengan diversity bahan kimia (Company : Ambrx)•Menggunakan perancah protein berdasarkan perpindahan untuk mengembangkan molekulmolekul seperti antibody, membuat penggabungan protein protein (Fusi) dan receptor agonist(Company: BioRexis)•Menggunakan perancah protein berdasarkan lectin Tipe C untuk mengembangkan molekulmolekul seperti antibody, teknologi protein trimerisasi (Company : Borean).•Merekayasa proteases untuk menurunkan molekul molekul yang ditargetkan (Company:Catalyst). Menggunakan domain Fibronektin untuk mengembangkan molekul molekul sepertiantibody, menciptakan protein protein dua fungsi dengan domain ikatan target yang terhubungterhadap domain enzimatik (Company: Compound Therpaeutics).
    • APLIKASI REKAYASA PROTEIN•Pengembangan peningkatan metode untuk humanisasi antibody (Company: Kalobios)•Menggunakan perancah protein berdasarkan lipocalin untuk mengembangkan molekulmolekul seperti antibody (Company: Pieris)•Menggunakan perancah protein berdasarkan Kristal gamma untuk mengembangkan molekulmolekul seperti antibody (Company: Scil)•Menggunakan perancah protein berdasarkan Sistein Knots untuk mengembangkan molekulmolekul seperti antibody (Company: Selecore)•Merekayasa fungsi efektor yang diinginkan terhadap protein protein SMIP seperti antibody(Company : Trubion).•Menggunakan teknologi PDA untuk Merekayasa fungsi efektor yang diinginkan terhadapantibody dan menciptakan protein protein domain negative dan protein protein denganpeningkatan sifat propertinya (Company : Xencor).•Rancangan dan konstruksi dari protein atau enzim baru dengan teknologi baru/novel ataufungsi fungsi yang diinginkan dengan memodifikasi susunan asam amino menggunakanteknologi rekombinan deokssrinukleaikasid (RDT)
    • STRATEGI REKAYASA PROTEINRekayasa Protein Protokol mempertimbangkanbeberapa strategi dan Pendekatan untuk merekayasaprotein :• Pendekatan Desain De Novo• Pendekatan Desain Rasional, termasuk diantaranya adalah teknik pendekatan mutagenesis Site Directed.• Pendekatan Desain Mutagenesis Acak/Random , termasuk diantarnya adalah Evolusi yang diarahkan/Directed Evolusi, DNA Shuffling, dan Mutasi Kimia (Teknik pendekatan Glicosilasi,Pegilasi, Lipida, dll)• Teknik Penggabungan protein (Fusion Protein)
    • STRATEGI DESAIN DE NOVO
    • TUJUAN STRATEGI DESAIN DE NOVO• Mengidentifikasi susunan dan geometrik asam amino yang optimal untuk stabilisasi geometry backbone• Mengembangkan algoritma yang powerful untuk solusi optimal• Mendesain dan merekonstruksi Protein Sintetik menggunakan informasi dari Struktur 3D dari akumulasi Protein Alam dan Ikatan ikatan protein . Contoh: Methionine : Memperlihatkan segmen rigid, central part segmen helix dan daerah buried natural protein. Threonine : segmen flexible Lysine : pembentukan helix yang baik dan mengajukan pada C- terminal Leucine : Helices yang stabil, prefer buried region, ditemukan pada posisi tengah helix• Menemukan susunan Asam Amino yang terbaik untuk memastikan ikatan pada struktur yang dipilih (Alpha helical bundel atau Betha barrel dan mempunyai energi rendah untuk target struktur
    • LIMITASI STRATEGI DESAIN DE NOVOLimitasi/ Problem:• Ketersediaan struktur protein 3-D masih terbatas.• Pengetahuan yang terbatas terhadap ilmu ikatan protein, struktur terhadap fungsi biologsi protein protein tersebut. Protein architecture vs. Protein folding vs. Biological functions
    • STRATEGI DESAIN DE NOVODesain Komputasional Protein• Mengidentifikasi susunan dan geometrik asam amino yang optimal untuk stabilisasi geometry backbone• Mengembangkan algoritma yang powerful untuk solusi optimal•Desain komputasi proteindengan algoritmemenemukan susunan asamamino untuk mengidentifikasisusunan asam amino yangmemiliki energi energirendah untuk struktur target.
    • STRATEGI DESAIN DE NOVO• Mendesain dan merekonstruksi Protein Sintetik menggunakan informasi dari Struktur 3D• Menemukan susunan Asam Amino yang terbaik untuk memastikan ikatan pada struktur yang dipilih X-RAY KRISTALOGRAFI memberikan data resolusi tinggi tetapi tidak memberikan informasi waktu tergantung fleksibilitas konformasi protein. NMR (SPEKTROKOPI RESONANSI MAGNET) menyediakan data resolusi agak rendah dan terbatas untuk protein yang relatif kecil, tetapi dapat memberikan informasi waktu bergantung tentang gerak protein dalam larutan.
    • X-RAY KRISTALOGRAFI Sinar masuk (datang dari kiri atas) menyebabkan setiap scatterer memancarkan kembali sebagian kecil intensitas sebagai gelombang bola. Jika scatterers disusun simetris dengan pemisahan d, gelombang bola akan selaras (tambahkan konstruktif) hanya dalam arah perbedaan jalan-panjang 2d sin θ sama dengan multiple integer dari panjang gelombang λ. Dalam hal ini, bagian berkas yang masuk dibelokkan oleh 2θ sudut, memproduksi tempat refleksiWorkflow for solving the structure of amolecule by X-ray crystallography.
    • X-RAY KRISTALOGRAFIDiagram Pita ofmyoglobin struktur,menunjukkan alfa heliksberwarna. Protein panjang, molekul linierdengan ribuan atom, namun posisi setiapatom relatif telah ditentukan denganresolusi sub-atom dengan kristalografisinar-X.Karena sulit untuk memvisualisasikansemua atom sekaligus, pita menunjukkanjalan kasar polimer protein dari N-terminus (biru) ke C-terminus nya(merah).
    • APLIKASI X-RAY KRISTALOGRAFI X-ray diffraksi image untuk protein myoglobinStruktur kristal protein pertama dari mioglobin paus sperma,ditentukan oleh Max Perutz dan Kendrew Sir John Cowderytahun 1958, Hadiah Nobel dalam Kimia.Difraksi sinar-X analisis mioglobin awalnya dimotivasi olehobservasi kristal mioglobin di kolam kering dari darah di atasgeladak kapal dari perburuan paus.
    • NMR (SPEKTROKOPI RESONANSI MAGNET)NMR adalah pengetahuan stuktur biologi, yang diapalikasikan oleh NMR untukmenginvestigasi jenis protein protein Kurt Wüthrich, who won the Nobel prize in 2002, Pacific Northwest NMR National sample is Laboratorys high prepared in magnetic field a thin walled (800 MHz) NMR glass tube. spectrometer sample loaded. Protein NMR dilakukan pada sampel air dari protein yang sangat murni. Sampel terdiri dari antara 300 dan 600 microlitres dengan konsentrasi protein dalam rentang 0,1-3 milimol. Sumber protein dapat berupa alam atau dihasilkan dalam sistem ekspresi menggunakan teknik DNA rekombinan melalui rekayasa genetik.
    • NMR (SPEKTROKOPI RESONANSI MAGNET)Panah biru mewakili orientasi ikatan Penentuan Nuklir struktur magnetikpeptidaN - H obligasi yang dipilih resonansi menghasilkan ensembledengan menentukan orientasi yang struktur.relatif cukup obligasi terhadap medan Struktur hanya akan bertemu jikamagnet luar, struktur protein dapat data cukup untuk mendikte lipatanditentukan, dari catatan 1KBH PDB tertentu. Dalam struktur ini, hanya untuk menjadi bagian dari kasus struktur, dari PDB 1SSU.
    • APLIKASI STRATEGI DESAIN DE NOVOStruktur unik proteins menghasilkan rancangan :1. Susunan Potensial Protein dari 100 hundred amino acids ⇒ ~10130 susunan protein potensial Dilakukan dengan metode Komputasi atau eksperimental.2. Estimasi Energi pada desain protein ⇒ Memperlihatkan perubahan energi selama proses folding. Hipotesa Thermodinamic : struktur asli protein diberikan oleh konformasi asam amino yang meminimalkan energi bebas molekul. Estimasi energi memperlihatkan : -- Hot spot residu untuk adanya interaksi energi -- Data Statistik terhadap fungsi efektif energi (SEEFs)  database struktur protein -- Sifat sifat fisik terhadap fungsi efektif energi (PEEFs)  analisa komputasi. -- Sifat sifat empiris terhadap fungsi efektif energi (EEEF) analisa single termodinamik dan multiple site mutasi. -- Kestabilan protein  baris multiple ikatan dan daerah konservatis jenis protein (Current Opin. in Structural Biol. 2002, 12:441)
    • APLIKASI STRATEGI DESAIN DE NOVO
    • APLIKASI STRATEGI DESAIN DE NOVO Protein degradation:
    • APLIKASI STRATEGI DESAIN DE NOVO Disease and protein folding: Disease Exemple: Neurodegenerative diseases
    • APLIKASI STRATEGI DESAIN DE NOVODesain proses komputasional juga Mengidentifikasi susunan dan geometrik asamberguna untuk merancang model amino yang optimal dengan target terhadapfolding inverse bagian protein stabilisasi gemoteri backbone protein.kedalam rancangan untai yangdiasumsikan sebagai rotamer multipledan perancah tetap. Rotamer yangberbeda dari tritopan asam aminopada posisi tertentu dalam protein. Desain komputer untuk faktor tumor nekrosis (TNF) varian pada depicted gold. Mutasi, merah, mencegah desain varian dari ikatan TNF reseptor, biru. Penambahan mutan hasil TNF pada campuran hetrogen trimer, memilikiModel desain folding inverse (A) partisi protein aktivitas yang dikompromised. Penambahan mutatdidesign side-chains mengasumasikan multiple berlebih TNF menjanjinkan level renda homotrimer aktiverotamer (merah) dan scaffold tetap (biru). (B-D) native TNF. Gambar berdasarkan pada material suplemenrotamer berbeda tritopan asam amino pada reference 39. Struktur kristal 1TNR digunakan untukposisi tertentu di protein. menciptkan representatif struktur
    • STRATEGI DESAIN rasional
    • STRATEGI DESAIN RASIONAL PROTEIN• Mendapatkan produk produk gen yang baru dari protein yang ada• Menemukan hubungan antara struktur dan fungsi protein serta stabilitas Molekul melalui informasi dari struktur 3 Dimensi protein.• Mengidentifikasi susunan Asam Amino seperti mengetahui asam amino memiliki energi terendah untuk merubah struktur ikatannya.• Mengembangkan pengetahuan pengetahuan baru tentang karakteristik protein.• Merancang protein/enzym dengan sifat yang diinginkan melalui teknik Manipulasi berdasarkan penerapan/ peniruan teknik mutasi alam seperti : - Site Directed Mutagenesis , Error-Prone, PCR-based - Penambahan atau penghilangan : PCR-based, nuclease, Kloning - Perubahan Domain atau Fusions /penggabungan : Ligation, PCR- basedSehingga dapat dilakukan analisa terhadap interaksi antara protein-protein,Ikatan DNA , aplikasi karakteristik antibodi , eksplorasi susunan protein,kontruksi hybrid protein, probing promoter dan regulasi regions, serta analisaaktifitas Enzim .
    • LIMITASI STRATEGI DESAIN RASIONAL PROTEIN• Pengetahuan tentang ilmu ikatan protein, juga terhadap fungsi biologsi, atau struktur protein sangat terbatas dan sering tidak tersedia• Aplikasinya diperkirakan akan sangat sulit dilakukan untuk melihat efek efek dari variasi mutasinya.• Strategi desain Site Direkted Mutaganesis memiliki limitasi atau problem dengan Banyaknya librari pada mutan yang dihasilkan
    • TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI Studi Modern resolusi yang lebih tinggi Ini adalah metode eksperimental untuk dapatmemicu lipatan sampel unfolded protein, dan mengamati dinamika yang dihasilkan.Teknik cepat digunakan secara luas termasuk neutron hamburan, ultrafast,pencampuran solusi, fotokimia metode, dan spektroskopi laser suhu melompat.Komputasi juga memprediksi struktur tersier protein.Teknik initio De novo (memprediksi struktur protein berhubungan dengan komputasi),Sangat berbeda dengan Metode lipatan Dinamika Molekul protein.(MD) merupakan perangkat penting mempelajari pelipatan protein dan dinamika disilico. Karena biaya komputasi, simulasi MD lipat dengan air eksplisit hanya terbataspada peptida dan protein yang sangat kecil.MD simulasi protein yang lebih besar tetap terbatas pada dinamika struktureksperimental atau berlangsung pada temperatur tinggi.Untuk mensimulasikan prosees lipat yang lama (diluar sekitar 1 mikrodetik), sepertiprotein lipat ukuran kecil (sekitar 50 residu) atau lebih besar, beberapa pendekatanatau penyederhanaan dalam model protein perlu diperkenalkan.
    • TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSITeknik untuk mempelajari Protein FoldingCircular Dichroism Spektroskopiadalah salah satu alat paling umum dan dasar untuk mengukur penyerapan cahayaterpolarisasi sirkular.Dalam protein, struktur seperti lembaran helicies alpha dan beta yang kiral, dandengan demikian menyerap cahaya tersebut.Penyerapan cahaya ini bertindak sebagai penanda tingkat foldedness dari ansambelprotein.Teknik digunakan untuk mengukur keseimbangan protein dengan mengukurperubahan serapan sebagai fungsi konsentrasi denaturant atau suhu.Jenis spektroskopi juga dapat dikombinasikan dengan perangkat cepat-pencampuran,untuk mengukur protein kinetika lipat dan untuk menghasilkan plot chevron.Perkembangan dichroism lingkaran getaran (VCD) melibatkan Fourier Transform (FFT)instrumen, untuk menentukan konformasi protein dalam larutan bahkan untukmolekul protein sangat besar. VCD studi protein sering dikombinasikan dengan difraksi sinar X-kristal protein, FT-IRdata untuk solusi protein dalam air berat (d2O), atau perhitungan kuantum ab initiountuk memberikan tugas struktural ambigu yang tak dpt diperoleh dari CD
    • TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI Spektrometri Circular Dichroism (CD) -- Mengukur struktur sekunder protein -- Teknik standar untuk mengukur aktifitas optikal protein -- Mengukur perbedaan absorbansi pada struktur sirkular bagian kanan dan kiri – melalui cahaya polarisasi dari sample protein The far-UV atau amide region (170-250 nm) untuk ikatan peptida The Near-UV region (250-300 nm) – aromatik asam amino
    • TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI Cahaya linier Terpolarisasi adalah cahaya osilasi terbatas untuk pesawat tunggal. Semua bagian terpolarisasi cahaya dapat digambarkan sebagai jumlah dari dua bagian linear terpolarisasi tegak lurus satu sama lain, sebagai cahaya terpolarisasi vertikal dan horizontal. Vertically Polarised Light Horizontally Polarised Light
    • TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI Amplitudo terpolarisasi Horisontal dan vertikal pada gelombang cahaya yang sama di fase satu sama lain: gelombang cahaya yang dihasilkan (biru) adalah linear terpolarisasi pada 45 derajat. Jika kedua polarisasi keluar dari fase, gelombang resultan berhenti menjadi terpolarisasi linier. Misalnya, jika salah satu terpolarisasi keluar dari fase oleh gelombang-kuartal, resultan akan heliks dan dikenal sebagai cahaya terpolarisasi sirkular (CPL). Heliks dapat berupa- kanan (R-CPL) atau kidal (L-CPL) dan non-gambar cermin superimposable. Unsur optik yang mengkonversi cahaya terpolarisasi linier dan cahaya terpolarisasi sirkular disebut piring seperempat-gelombang. Piring seperempat-gelombang birefringent, yaitu indeks bias dilihat oleh horizontal dan vertikal terpolarisasi cahaya berbeda. Pelat berorientasi akan mengkonversi cahaya terpolarisasi linier ke sirkular cahaya terpolarisasi dengan memperlambat salah satu komponen linier balok sehubungan dengan yang lain sehingga menjadi fase keluar seperempat-gelombang . Menghasilkan berkas CPL kiri atau kanan.
    • TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI Left Circularly Polarised (LCP) Light Right Circularly Polarised (RCP) Light Ketika pesawat berpotongan yang dilihat dari depan maka gambar berikut terlihat :
    • TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI
    • TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI
    • TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI Spektrometri Fluorosense-- Pengukuran yang sempurna untuk memperkirakan perubahankonformasi dari protein
    • TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN STRUKTUR/FUNGSI Spektrometri Fluorosensea. Penglabelan Serotonin N acetiltransferasi (AANAT) dengan fluoresen (FL) danrhodamin (Rh) , yang mengharapkan terjadinya transfer resonansi energifluoresen (FRET) untuk AANAT sebagai monomer (no FRET) dan sebagaioligomer (FRET).b . Pelabelan in vivo pada Glutatione S-transferasi (GST) yang mengandungresidue sistein N-terminal dengan membran permiable tetrametilrhodaminthioester (TMR).
    • TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN SITE DIRECTED MUTASI Susunan Asli Asam Amino ->Missense atau silent mutasi yaitu Perubahan susunan nucleotide tanpa adanya perubahan susunan protein ->Nonsense, perubahan asam amino yang merubah terminal atau ujung-C protein -> Penambahan susunan amino yang merubah terminal atau ujung-C protein -> Pemotongan susunan amino yang merubah terminal atau ujung-N protein
    • TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN SITE DIRECTED MUTASIPrimer extension Dalam pengembangannya Digunakan double sebagai(the single-primer ganti rantai DNA primermethod)is a simple methodfor site-directedmutationMetode lama yangdigunakan pertamakali,Dengan sintesaOligonucleotide yangdi masukkan ke dalamplasmidKeterbatasan :Banyaknya Librarypada Mutan
    • TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN SITE DIRECTED MUTASITeknik Mutasi Deletion atau insertion
    • TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN SITE DIRECTED MUTASITeknik Mutasi Penghilangan dengan menggunakan enzim restriksi
    • TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN SITE DIRECTED MUTASI Oligonucleotide /Saturation mutagenesis GCTAATTGGCGCAGCTAGTCGATGAAATTTGATGCCATACCCGGG GCTAATTGGCGCAGCTAGGAAATGAAATTTGATGCCATACCCGGG Mutagenesis in vitro - Teknik Mutasi Perubahan Domain (Fusion) dengan Enzim Ligasi dan Multiplikasi PCR-BasedKloning gen dapat bermutasi secara khususMemungkinkan adanya mutasiTertentu •Komponen Utama- DNA template- Primer mutasi- DNA pol, dNTP• Ada banyak variasi sehinggaDapat meningkatkan efisiensi
    • TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN SITE DIRECTED MUTASI Oligonucleotide /Saturation mutagenesisDNA Mismatch Repair Protein, MutH,pRoses untuk mengoreksi kesalahanreplikasi organisme hidup; meningkatkankeakuratan replikasi DNA sampai faktor1000The first method of site-directed mutagenesis to be developed was the single-primer method (Gillam et al. 1980, Zoller & Smith 1983). Asoriginally described the method involves in vitro DNA synthesiswith a chemically synthesized oligonucleotide (7–20 nucleotides long) that carries a base mismatch with the complementary sequence. themethod requires that the DNA to be mutated is available in single-stranded form, and cloning the gene in M13-based vectors makes this easy.However, DNA cloned in a plasmid and obtained in duplex form can also be converted to a partially single-stranded molecule that is suitable(Dalbadie- McFarland et al. 1982).
    • APLIKASI STRATEGI DESAIN RASIONAL PROTEIN•Melakukan analisa terhadap interaksi antara protein protein, dan folding/unfoloding protein•Melakukan permodelan struktur protein.•Melakukan analisa terhadap interaksi ikatan DNA,•Melakukan eksplorasi susunan protein,•Melakukan kontruksi hibrid protein, dan probing promoter•Mengekspresikan Protein dan Regulasi region•Menganalisa aktifitas enzim.•Melakukan modifikasi sifat sifat kimia protein•Memproduksi obat dengan misalnya mengefektifkan Ribonukelasi yang digunakan pada terapi tumor.•Menghasilkan aplikasi dalam mengkarakteristik jenis antibodi.
    • APLIKASI STRATEGI DESAIN RASIONAL PROTEINPenelitian ekstensif dan studi daerah ikatan 02 (ligand) protein hemoglobin.Dengan struktur hemoglobin terlarut pada kristalografi X-ray , asam aminoyang bertugas untuk mengikat ligand pada protein, bersama dengan helixspesifik dan posisinya ditentukan dan dapat ditampilkan. Residu residuyang bekerja pada konjunksi dengan cincin heme porpirin. Gambar ini memperlihatkan peledakan di kawasan yang mengikat ligan. Rantai samping dari asamMemperlihatakn tetramer hemoglobin dengan empat amino asam amino kunci pada ikatan ligan (O2 dalamdaerah yang mengikat ligan dengan distal dan gambar) dan cincin heme porpirin ditunjukkan dalamproksimal histidines dalam model tongkat biru model tongkat. Ruang kuning penuh molekulcerah. Cincin heme porfirin ditampilkan dalam merupakan heliks sekitarnya yang membentukmodel tongkat merah dan putih. hemoglobin.
    • APLIKASI STRATEGI DESAIN RASIONAL PROTEINMenggunakan strategi desain rasional dapat menyarankan mutasi yang mungkin untuk asamamino kunci yang bertanggung jawab atas pengikatan hemoglobin pada ligan. Sebagai contoh, jikadiinginkan sterically menghalangi situs pengikat jika hemoglobin, direncanakan membuat situs-mutasi untuk memperkenalkan mutasi yang akan memberikan sifat fisik dan elektrokimia yangdikehendaki. Memilih fenilalanin untuk menggantikan leusin pada posisi 29 akan mengisi situsdengan rantai samping aromatic yang besar. Hasil ini dapat dilihat pada gambar berikut A dan B. Gambar B. memperlihatkan daerah yangGambar A. menggambarkan daerah yang mengikat atau mengikat setelah leusin wild type telah"saku" dari subunit hemoglobin. Spasi warna hijau diisidomain memperlihatkan residu leusin wild type dan digantikan oleh sebuah fenilalanin. Strategiorientasinya pada pocket. Molekul berwarna merah rasional fenilalanin mengisi saku hemoglobinadalah iksigen dan ditampilkan berikatan terhadap grup dikonfirmasi pada gambar yang didasarkanheme porfirin (molekul flat pada model tongkat). dari x-ray kristalografi.
    • APLIKASI TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEINBanyak diaplikasikan pada pembuatan obat, seperti :-Keefektifan Ribonuclease (Rnase) yang digunakan pada therapiAnti tumor, dapat diimproved dengan teknik site directed mutagenesis
    • APLIKASI TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEINSistem Ekspresi untuk memfungsikan protein aktifE. coli expression sistem: Protein processing dan foldingpET sistem:36 tipe vector , 15 hoststrain yang berbeda(developed by Studier et al., 1986)-λDE3 lysogne:T7 RNA Pol gene, padakontrol Promoter lacUV5-pLysS or pLysE:T7 lysozyme, Inhibitor/penghabat T7RNA Pol,u/pengkontrolan lebihketat. e.g.,BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS atau E
    • Polymer chain reaction METODE MULTIPLIKASIPENDUKUNG desain protein
    • REAKSI RANTAI POLIMER (PCR)Polymerase chain reaction untuk mengisolasi fragmen DNAsecara cepat  PCR (polymerase chain reaction) mencapai akumulasi eksponensial dari target DNA  Berdasarkan urutan DNA yang telah ditentukan sebelumnya, oligonucleotides pendek (~ 20bp) dikembangkan dan dilengkapi untuk menyusun DNA target yang diapit .  Oligonucleotides bertindak sebagai primers untuk menyalin DNA yang serupa (Replikasi DNA).
    • REAKSI RANTAI POLIMER (PCR)Primer Oligonucleotide mulai menyalin DNA.
    • REAKSI RANTAI POLIMER (PCR)Setiap siklus replikasi menggandakan jumlah target DNA.
    • REAKSI RANTAI POLIMER (PCR) Amplifikasi Exponential
    • REAKSI RANTAI POLIMER (PCR) Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required to reproduce or display
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR – Media MutagenesisMutagenesis Oligonukleotida mismatch (site pre-determined) dengan molekul DNAklone. Sel-base oligonukleotida mismatch (alternative PCR-base site directedmutagenesis). Penggunaan mutagenetik oligonukleotide langsung pada nukleotidatunggal yang disubstitusi pada gene. Gene dikloning pada M13 menciptakanrekombinasi DNA rantai tunggal. Primer oligonukleotida melengkapi susunan gen yangdimutasi (A) dan mengandung base non-komplementari yang diinginkan (C).Annealing primer mutagenik, sintesa rantai kedua diperpanjang dengan polimerasi DNAserta celah/gap ditutup dengan DNA ligase. Hasil heteroduplek ditransformasikan ke E-coli, dua populasi rekombina dapat dikembalikan menjadi wilde type dan mutanthomoduplek, yang kemudian diidentifikasikan dengan hibridisasi molecular (denganprimer mutagenic sebagai probe oligonuklotida alel spesifik).
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR BASED – SITE DIRECTED MUTAGENESIS
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR BASED – SITE DIRECTED MUTAGENESIS
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR Based – Turunan Primer – Saturated Mutagenesis
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR Based – Turunan Primer – Saturated Mutagenesis
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR – MUTAGENESIS UJUNG 5’Primer dimodifikasi pada ujung 5‘ untuk memulai proses, sebagaicontoh, Group yang telah dilabelkan, susunannya mengandungsite restriksi yang sesuai, atau promoter phage untukmenggerakkan ekspresi gen.
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR – MUTAGENESIS SITE SPESIFIKMutagenesis menghasilkan produkamplifikasi dengan menglokasikanmutasi pre-determinasi spesifik padasegmen central.Reaksi PCR A dan B dihadapkan padasegmen overlapping yang diamplifikasipada DNA mengandung mutasi(mempertimbangkan mismatching basedengan primer mutant – 1M atau 2M).2 produk dikombinasikan, denaturasidan reanneal, polimerasi DNA dapatmemperpanjang ujung 3‘ heteroduplekdengan ujung 3‘ yang tersembunyi.Produk panjang penuh dengan mutasisegmen central diamplifikasi denganhanya primer outer 1 dan 2.
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR - Mutasi site-directed – Base Tunggal mismatched amplifikasi primer dan templateDua primer reaksi PCRmemproduksi reaksi denganoverlapping dua fragmen DNA,menampung mutasi yang samapada daerah overlap .Susunan overlap merubahfragmen menjadi hibridisasi.Dua hibrid diperpanjang denganDNA polymerase memproduksiduplex fragment.1 Hibrid recessed 5′ ends hilangdari percampuran reaksi.
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR – Metode Exsite TM Kedua rantai vektor membawa target gen menggunakan PCR tetapi satu dari primer membawa mutasi yang diinginkan. Hasil produksi populasi liner duplex membawa gen mutasi yang dikontaminasikan dengan tingkat rendah pada siklus template DNA aslinya. Template DNA diturunkan dari Sel E-coli dengan sistem modifikasi restriksi intak , kemudian dimetilasi dan disensitifkan untuk restriksi dengan DpnI Endonuklease. DNA linear diproduksi dengan amplifikasi resistan terhadap pembukaan Dpnl dan setelah sirkulasi ligasi blunt-end dikembalikan dengan transformasi ke E-coli. Setiap molekul hibrid mengandung rantai tunggal template metilasi DNA dan unmetilasi amplifikasi yang akan dihancurkan dengan Endonuklease. Metode Exsite TM untuk menghasilkan mutasi menggunakan PCR. Plasmid parental membawa target gen yang diturunkan dari rantai restriksi-profisien E-coli dan dimetilasi. Sensitivitas dengan Dpnl endonuklease dan dielminasi secara selektif dari hasil pencampuran akhir PCR
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR – Metode Gen Tailor Menargetkan DNA yang dimetilasi in vitro sebelum langkah mutagenesis dan overlapping primer digunakan. Linier amplifikan yang diproduksi, membawa mutasi yang diinginkan tetapi saat ditransformasikan langsung pada E-coli, Sel Host memperbaiki sirkulasi enzim mutasi DNA linear, sementara Endonukleas McrBC menguraikan Metilat- tempate DNA, meninggalkan hanya un-metilat, produk mutasi.
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR – ReverseRT-PCR, salah satu metode sensitif Transkripsiuntuk mendeteksi dan menganalisatranskripsi mRNA atau RNA lainnyapada porsi yang rendahRNA tidak dapat digunakan sebagaitemplate PCR, sehingga harusditranskripsikan dahulu menjadi cDNAdengan reverse transcriptase dariMoloney murine leukemia virus atauAvian myeloblastosis virus, dan duplikatcDNA kemudian diperbanyak.Teknik ini diawali dengan pencampuranmixing short (12-18 base) polymersthymidine (oligo dT) dengan messengerRNA, dan anneal RNAs polyadenylatetail. Reverse transcriptase ditambahkandan menggunakan oligo dT sebagaiprimer untuk sintesa first strand cDNA. Roche Molecular Biochemicals: PCR Application Manual. RT-PCR
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR – Gene Sekuensi untuk Mutasi Produk PCR untuk Mutasi gen yang disaring didapatkan dari Genome DNA menggunakan primer intron-spesfik yang mengapit exon atau dengan Reverse Transkripsi PCR.•(A) Genome DNA, Exons 1-4 dapat diamplifikasi secara terpisah dari GenomeDNA menggunakan pasangan primer intron yang spesifik (1F + 1R, 2F + 2R)•(B) Reverse Transkripsi PCR. mRNA yang dipresentasikan pada sel secaramudah diakses seperti sel darah, memungkinkan konversi ke cDNA. cDNAkemudian digunakan sebagai template pasangan primer exon spesifkmenciptakan Fragmen DNA yang overlapping/tumpang tindih.
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR – Perpanjangan Polimorphism Fragmen Restriksi Metode untuk mendeteksi daerah restriksi polimorp. Alleles 1 dan 2 dibedakan dengan polimorph yang merubah susunan nukleotida dari daerah resktriksi spesifik untuk restriksi nuklease.Allele 1 mempunyai daerah, alelle 2 mempunyai nukleotida yang telah dirubah.PCR primer didesain sederhana dari susunan mengapit daerah restriksi untukmemproduksi produk pendek. Penghancuran Produk PCR dengan enzime Rdan fraksinasi ukuran menghasilkan penulisan sederhana dua alelles.
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR – STRPSPCR dapat digunakan untuk menghasilkan tandem pendek polimorps yang berulang(STRPs). Penulisan dari dinukleotida CA/TG mengulang polimorphs yang mempunyaitiga alel sebagai hasil variasi pada jumlah pengulangan CA. Pada autoradiographsetiap alel direpresentasikan dengan band utama bagian atas dan dua minor „bandbayangan“. Setiap A dan B mempunyai genotipe A (1,3) dan B (2,2).
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR – Spesifik AlelDasar dari PCR spesfik alel :koreksi pasangan base pada ujung 3‘ Primer PCR.Spesik alel oligonukleotida primer ASP1 dan ASP2 dirancang untukmenyamakan susunan dua alel terhadap posisi daerah sebelumnya padavarian nukleotida, sampai dengan dan berakhir pada varian itu sendiri. ASP1 mengikat sempurna, melengkapi susunan rantai alel 1, amplifikasi dengan primer yang dilindungi. Namun, ujung C-3‘ pada ASP2 primer mismatched dengan T susunan alel 1, sehingga amplifikasi tidak dapat dilakukan. Serupa dengan ASP2 mengikat sempurna alel 2 dan memulai amplifikasi, tidak seperti ASP1.
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR – Metode Taqman AssayMetode sensitif untuk mendeteksi spesifik Alel menggunakan aktifasi exo 5‘ dan3‘ dan primer ketiga dengan Fluor dan Quencher Penambahan 2 primer PCR konvensional, P1 dan P2, spesifik untuk susunan target, primer ketiga P3, didesain mengikat spesifik susunan target downstream P1. Pelabelan P3 dengan dua fluorophores,. reporter dye (R) pada ujung 5’ dan quencher dye pada reporter dye yaitu pada ujung 3’. Ujung 3’ diblok/dihalangin, P3 primer ketiga tidak dapat dengan sendirinya prime pada setiap sintesa DNA baru. Selama reaksi PCR, Polimerasi Taq DNA mensintesa rantai prima DNA baru dengan P1 dan enzim mendekati primer ketiga, aktifitas proses dari arah 5’  3’ menurunkan P3 dari ujung 5’. Hasil akhir rantai DNA melebihi daerah ikatan P3 reporter serta quenche dye tidak lagi mengikat molekul sama. Reporter dye tidak lagi dekat pada quencher, meningkatkan emisi intensitas reporter yang dengan mudah dideteksi
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR – DOPKloning cDNA untuk porcine urate oksidase mneggunakan turunan oligonukleotida yangberhubungan dengan susunan asam amino yang diketahui. Primer sensedikonstruksikan terhadap kodon 7-11 dan dua base yang pertama dari kodon 12, danprimer antisense berhubungan dangan kodon 34-38 (Lee et.al, 1980). Susunan asamamino dipilih untuk mengkonstruksikan primer yang dipilih dari basis kandungan tinggiasam amino yang dispesifikan dengan hanya dua kodon (Asp, Tyr, Lys, Asn, His).Primer mempunya perpanjangan 5‘ mengandung susunan yang dikenali untuk restriksinukleases, untuk memfasilitasi kloning subsekuen sel base.
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR – Linked Primer PCR link primer memungkinkan amplifikasi in- diskriminate susunan DNA pada target DNA yang rumit/kompleks.Molekul Linked (adaptor) adalah rantai ganda oligonukleotida dibentuk dengan ligasidua rantai tunggal oligonukleotida dilengkapi pada susunan kecuali yang memilikikompatible tergantung 5‘ dengan retriksi nuklease tergantung/overhang (kasus ini,GATC 5‘ tergantung diproduksi oleh Mbol). Setelah ligasi linker terhadap target fragmenrestriksi, primer linked-spesifik mengamplifikasi semua fragmen dengan mengikat duamolekul linker yang mengapit.
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR – Genome Walking Target komplek DNA terdiri dari banyak fragmen dimana susunan anchor (labuhan) dilampirkan, contoh: linker rantai ganda oligonukleotida. Ide untuk menggunakan spesifik primer susunan anchor dan satu susunan spesifik X diketahui dapat untuk membebaskan fragmen fragmen mengandung susunan X dan mendapatkan akses susunan yang tidak teridentifikasi sebelumnya yang berdampingan terhadap X. Pada contoh ini, susunan anchored ditunjukkan hanya pada sisi kiri dari amplifikasi yang jelas dan dimungkinkan dari susunan karakterisasi N1 sebelumnya yang berdekatan dengan susunan X yang diketahui. Variasi metode derivatif telah disusun, seperti PCR buble-linker.
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR – Hot Start Teknik mengubah cara campuran PCRdengan pemanasan awal. Polimeraseaktif, tapi target belum didenaturasi danPrimer mengikat ke lokasi non-spesifik(atau satu sama lainnya).Teknik dilakukan manual memanaskankomponen reaksi pada suhu pencairan(mis. 95 ° C) sebelum menambahkanpolimerase . Atau, sistem yang menghambataktivitas polimerase pada suhulingkungan, oleh pengikatanantibodi, atau inhibitor terikat kovalenyang hanya terdisosiasi setelah langkahaktivasi temperatur tinggi. ‘Hot-start/cold-finish PCR dicapai denganpolimerase hibrida baru yang tidak aktifpada suhu lingkungan dan hanyadiaktifkan pada temperatur tinggi.
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR Based – Error ProneMenentukan varians baru proteinBerdasarkan prinsip Annelaing Taq Polymerase pada pasangan base yang tidakkompatibel satu sama lain selama proses amplifikasi / penguatan dalam kondisiPCR yang tidak sempurna. PCR dengan ketelitian yang rendah! Dicapai dengan: - Peningkatan konsentrasi ion Mg2 + - Penambahan Mn2 + - Konsentrasi yang tidak sama pada keempat dNTPs - Penggunaan dITP - Meningkatkan jumlah Taq polimerase (Polymerase tanpa bukti fungsi pembacaan)
    • APLIKASI PCR PADA PROTEIN ENGINEERING PCR Based – Error ProneMenentukan varians baru proteinERROR PRONE PCR:- Taq Polymerase berannealing pada pasangan base yang tidak kompatibel satu sama lain selama proses amplifikasi / penguatan dalam kondisi PCR yang tidak sempurna
    • STRATEGy directed evolusi
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKANTeknik ini tidak memerlukan pengetahuan struktur, susunan, ataumekasnisme protein, melainkan penerapan pengetahuan dalam : - Random Mutagenesis untuk menciptakan perbedaan genetik - Seleksi atau Screening/penyaringan untuk memilih varian yang memiliki kualitas yang diinginkan.Beberapa tahapan Mutasi dan Seleksi, meniru evolusi alam.Digunakan untuk Menghilangkan mutasi neutral dan merusak.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKANFaktor yang menentukan keberhasilan strategiadalah :- Kualitas dan desain Pustaka/Library- Pemilihan metode Evolusi- Pemilihan Rekombinasi DNA- Metode Seleksi atau Penyaringan/Screening
    • LIMITASI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN- Susunan protein yang dikembangkan memiliki sifat yang hampir mirip dengan susunan induk/parental, sepanjang path evolusinya- Kapasitas metode untuk menciptakan susunan fungsional yang baru sangat terbatas dan membutuhkan libraries yang besar.
    • PERBEDAAN DESAIN RASIONAL vs DIRECT EVOLUSI
    • PERBEDAAN DESAIN RASIONAL vs DIRECT EVOLUSI
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN RANDOM MUTASI
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE NONKOMBINASI DOMAIN SWAPPINGKonstruksi aktual dari desain rasio genes domain-swapped genesdapat diselesaikan dengan beberapa teknik.Metode cassette mutagenesisSusunan site restriksi mengapit susunan DNA tertentu untukditempatkan dan dihancurkan dengan enzim restriksi dan penggantiansusunan dengan memasukkannya di antara sitesnya (Wells et.al.1985).Metode Gene splicing by overlap extension polymerasechain reactionMolekul DNA direkombinasikan tanpa menggunakan pembatasanendonuklease (Horton et al 1989).Fragmen gen yang akan direkombinasikan (gen orangtua) dapatdihasilkan dalam polimerase terpisah rantai reaksi (PCRs).
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE KASET MUTAGENESISPembatasan situs terjadi secara alami atau artifisial dimulai padalokasi diinginkan pada gen target dengan oligonukleotida-directedmutagenesis.Pemilihan pembatasan situs didasarkan pada keunikannya terhadapplasmid dan konservasi asam amino akhir urutan pengkodean.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE SPLICING GEN PCR OVELAPPED EXTENSION Primer didesain hingga ujung produk mengandung urutan komplementer. Ketika produk PCR dicampur, alur memiliki urutan sesuai ujung rantai 3 ‘yang tumpang tindih dan primer satu sama lain. Ekstensi polimerase DNA menghasilkan urutan asli dihubungkan untuk menggabungkan dua fragmen dalam satu langkah kloning, langkah kloning multiple dibutuhkan untuk melakukan swap domain internal. Variasi metode, Protokol PCR tiga langkah membentuk protein chimeric, hanya satu langkah kloning dibutuhkan untuk bertukar dari domain internal (Grandori et al 1997). Metode digunakan untuk menggantikan domain tertentu protein A oleh domainGene splicing by overlap extension polymerase chain reaction analog protein B. Studi tentang hibrida(PCR). Arrows represent primers (1–4), the solid line and dottedlines represent DNA sequences from two different parent genes domain-bertukar dapat dihasilkan .
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE KOMBINASI Kadang-kadang sulit diketahui mutasi seperti apa yang dapat menghasilkan sifat tertentu pada suatu protein Misalnya, untuk meningkatkan termostabilitas suatu protein masih sulit untuk dilakukan hanya dengan melakukan prediksi pada struktur 3 dimensi (3-D) untuk menentukan asam amino mana yang menentukan sifat ini Dengan metoda ini dapat dilakukan mutasi pada berbagai tempat untuk kemudian dilakukan identifikasi protein mutan yang mana yang dapat menghasilkan fungsi yang diinginkan
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE KOMBINASIPendekatan in vitro acak , tidak perlu prediksi fragmen protein danposisi crossoverMetode ini memiliki beberapa teknik pendekatan yaitu :•Pendekatan chimeragenesis acak Metode penyisipan urutan DNA ke lokasi acak gen target. Investigasi hibrida yang dihasilkan untuk mengidentifikasi situs yang menerima insersi fungsional domain protein menjadi perancah.•Pendekatan Permutasi melingkar protei Menghasilkan relokasi N-dan C-Termini. Metode digunakan untuk memahami jalur evolusi dan mengidentifikasi situs permisif secara sistematis untuk permutasi melingkar, informasi mengungkapkan modularitas scaffold/perancah.•Pendekatan Rekombinasi Homolog•Pendekatan Rekombinasi Nonhomolog.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE CHIMERAGENESIS ACAKMetode sebenarnya dapat melalui Teknik Pendekatan Kombinasiataupun Nonkombinasi, dengan keuntungan dan kerugian:
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE CHIMERAGENESIS ACAKHybrid proteins segments (domains / subdomains) dari paling sedikitdua natural yang berbeda /protein dari orang tua lelaki .Domains dan subdomains struktural motif variasi ukuran dankekomplekanTipe HIBRID:-Single crossover hybrids terdiri dari bagian N-terminal satu protein danbagian C-terminal protein lainnya.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE CHIMERAGENESIS ACAKTipe HYBRID:-Multiple crossover hybrids, Satu atau lebih internal stretches dari susunan asam amino ditempatkan pada segmen yang berhubungan dari enzim lain.-Fusion hybrids, Domain fungsional protein yang terhubung dengan domain protein lainnya, menciptakan produk gabungan/fuse yang lebih besar dari parentnya.Hybrid dapat menyebabkan mutasi, penghilangan dan penambahanasam amino.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE CHIMERAGENESIS ACAKHybrids between human GSTT1-1 and rat GSTT2-2. Susunan Asam amino dari manusiaGSTT1-1 dan tikus GSTT2-2 ditunjukkan pada daerah hitam dan abu abu. Segmentsberhubunganan terhadap G site dan H site diidenkasi. R-h rat–human, H-r human–rat
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE REKOMBINASI HOMOLOGRekombinasi homolog fragmen DNA  DNA beberapa orang tua Produk akhir gen.Mekanisme reassembly:Urutan DNA homologi dan gen homologi rendah (< 70%) tidak dapatdikombinasikan.  Bias inheren homolog libraries:(posisi crossover pada Daerah tinggi, bukan rendah, kesamaan DNA)Metode berguna dalam domain swapping Gen orangtua berbagihomologi tingkat tinggi.Rekombinasi homolog  Menggabungkan fragmen >> dua gen induk, menjelajahi urutan seluruh keluarga enzim dalam satu percobaan.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE REKOMBINASI HOMOLOG“Knockouts”gen yang dihasilkan oleh rekombinasi homolog
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE KOMBINASI Metoda untuk memisahkan protein dengan sifat yang diinginkan dan mengidentifikasi mutasi penyebab perubahan: 1. Penelusuran (Skrining): semua pustaka yang ada diperiksa secara acak untuk mencari protein dgn sifat yang diinginkan 2. Metoda seleksi: Pustaka diseleksi sedemikian rupa sehingga hanya yang memiliki perbaikan sifat yang ditelusuriProtokol diterapkan pada metoda kombinatorial: 1. Metoda pembuatan pustaka kombinatorial dengan keragaman yang tinggi sehingga meningkatkan kemungkinan diperoleh protein dengan sifat yang diinginkan 2. Penentuan metoda yang digunakan untuk memisahkan protein dengan sifat yang diinginkan dan mengidentifikasi mutasi penyebab perubahan
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE REKOMBINASI HOMOLOGProtokol dasar in vitro homolog gen orangtua DNA Shufflingyaitu Teknik evolusi dengan karakterisik berbeda meniruproses desain atau rekombinasi alami reproduksi seksual danmempercepat proses perancangan melalui seleksi langsung invitro dengan mencampurkan dan menyesuaikan protein(match) untuk menghasilkan varian lebih,mempertimbangkan : Teknik ikatan/Folding ProteinTermostabilitasAktivitas Enzim
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKANMETODE REKOMBINASI HOMOLOG–DNA SHUFFLINGAplikasi teknik :Rekombinasi homolog invitroBeberapa seleksi Pool Gen melalui Fragmentasi acakRandom menjadi fragmen kecil dengan penghancuran oleh Enzimrestriksi Dnasel. Fragmen dipasang kembali dengan Teknik PCRdan berfungsi sebagai template dan primer.Fragmenmenyelaraskan dancross-prime satu samalain untuk replikasimemberikan untai DNAhibrida denganbeberapa komponendari gen induk yangasli.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKANMETODE REKOMBINASI HOMOLOG–DNA SHUFFLINGHal hal yang diperlukan :- Penerapan pada susunan susunan > 1 Kb- Keberadaan daerah Homologous memisahkan daerah daerah yang berbeda (perbedaan wilayah)- Struktur Scafford-like Protein yang memungkinkan proses yang sesuai untuk Shuffling / Pencampuran
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKANMETODE REKOMBINASI HOMOLOG–DNA SHUFFLING DNase I treatment (Fragmentasi 10-50 bp,Mn2+) Reassembly (PCR tanpa Primers, Extension dan Recombinasi) Pemanasan dan Renature secara random PCR amplification
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKANREKOMBINASI HOMOLOG– FAMILY SHUFFLING Genes berasal dari gen famili yang sama -> homologous Tinggi -> Family shuffling
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKANREKOMBINASI HOMOLOG – FAMILY SHUFFLING High DNA sequence similarity is required
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN REKOMBINASI HOMOLOG– FAMILY SHUFFLINGSHUFFLING-COMBINATORIAL LIBRARIES ENHANCED byRECOMBINATION IN YEAST (CLERY)Famili shufling dengan Efisiensi Tinggi berdasarkan multi-step PCR danRekombinasi DNA in vivo pada yeast:Statistik dan Analisa fungsi dari Pustaka kombinasi antaraHuman cytochrome P450 1A1 and 1A2Valérie Abécassis, Denis Pompon and Gilles Truan* Centre deGénétique Mol?culaire du CNRS, UPR 2137, Avenue de la Terrasse,91198 Gif-sur-Yvette Cedex, France Nucleic Acids Res. 2000, 28: e88
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKANREKOMBINASI HOMOLOG– FAMILY SHUFFLING
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING – ENZIM RESTRIKSI SHUFFLINGKeuntungan Enzim Restriksi Shuffling:Menghasilkan frekuensi chimeras yang lebih tinggi karena tidakmenggunakan DNaseI.(Hidrolisis DNaseI pada DNA beruntai ganda lebih memilih lokasiberdekatan nukleotida pirimidin dan akibatnya bisa memulai urutan biaske rekombinasi tersebut.Kelemahan Enzim Restriksi Shuffling :Situs crossover bias bertepatan dengan pembatasan situs-situs yangsudah ada.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKANDNA SHUFFLING – ENZIM RESTRIKSI SHUFFLING
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING–STAGGERED EXTENSION PROSES (StEP)Staggered extension proses (StEP) adalah variasi lain dari DNAyang menggunakan terminal primer untuk meniru DNA target melaluiPCR dengan ekstensi waktu yang sangat singkat untuk menghasilkanuntai pendek DNA yang direplikasi.Rantai tumbuh DNA bertindak sebagai primer dalam siklus berturut-turut dan perubahan template direplikasi beberapa kali,mengumpulkan Komponen dari gen induk yang berbeda.Pada proses ini dibutuhkan susunan DNA homolog tinggi
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKANDNA SHUFFLING–STAGGERED EXTENSION PROSES
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKANDNA SHUFFLING–STAGGERED EXTENSION PROSES Gen hibrid dikonstruksikan dari dua gen homolog. Cloning dari gen hibrid menghasilkan produksi protein hibrid. Hanya satu rantai dari setiap gen ditunjukkan setelah langkah denaturasi awal.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING-REKOMBINASI PRIMING ACAKRekombinasi priming acak :-Reassembli /pengumpulan kembali DNA oleh Sintesainteruppting /penyelaan- Chimeragenesis acak pada tempalte transiens (RACHITT)Aplikasi praktis di bidang rekayasa protein hasilnya seringkali sulit untukmerasionalisasi karena chimeras yang dihasilkan memiliki banyakparents dan beberapa posisi crossover.Tidak signifikan bila tujuannya adalah produk akhir,yaitu enzim direkayasa dengan sifat yang diinginkan.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING- (RACHITT)
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING-INCREMENTAL TRUNCATION for THE CREATION HYBRID ENZYMES (ITCHY)Teknologi pemotongan Tambahan chimeragenesis menghasilkanhubungan struktur dan fungsi protein yang lebih sesuai.Strategi pertama:-Pemotongan incremental untuk pembuatan enzim hibrida(ITCHY-Incremental truncation for the creation Hybrid Enzymes(ITCHY) menghasilkan perpustakaan protein hibrida single crossover antara duagen induk.- Hasil ITCHY pada perpustakaan gen melalui pemotongan tambahanpada positi crossover yang didistrusi acak.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKANDNA SHUFFLING-INCREMENTAL TRUNCATION for THE CREATION HYBRID ENZYMES (ITCHY) Tambahan pemotongan (arrow pertama) dan penambahan pemotongan enzim hibrida (ITCHY) (Seluruh diagram). Dalam ITCHY, perpustakaan pemotongan inkremental dihasilkan oleh penghancuran DNA oleh exonuclease III. Fragmen yang dihasilkan kemudian diligasikan bersama-sama untuk menghasilkan perpustakaan akhir
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKANDNA SHUFFLING-INCREMENTAL TRUNCATION for THE CREATION HYBRID ENZYMES (ITCHY)
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKANDNA SHUFFLING-INCREMENTAL TRUNCATION for THE CREATION HYBRID ENZYMES (ITCHY) Thio-ITCHY, dengan Analog nukleotida trifosfat Pada PCR, dNTP α-phosphothioate digabung acak pada frekuensi rendah ke wilayah target pemotongan DNA. Internucleotide phosphothioate yang dihasilkan menghubungkan ketahanan terhadap hidrolisis exonuclease 3-5 , memberi ketahanan DNA target terhadap degradasi dalam pembuatan ExoI berikutnya. Thio-ITCHY berhasil digunakan untuk menggabungkan kembali gen dengan urutan identitas dengan hanya 36% untuk menghasilkan chimeras aktif Keterbatasan utama ITCHY dan Thio-ITCHY adalah Crossover hibrida tunggal hanya dapat dihasilkan dari dua orang tua , membatasi potensi keanekaragaman urutan.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING – MIX ITCHY DAN DNA SHUFFLING (SCRATCHY)Metode rekombinasi homolog berhasil digunakan kombinasi padametode lain untuk menentukan faktor penentu spesifisitas substrat danaktifitas enzim pada variasi family protein.Metode digunakan mencari hubungan struktur-fungsi dan mekanismeevolusi protein.Ketika dikombinasikan dengan skrining genetik /teknik pilihan, dapatdigunakan untuk mendapat area baru pada enzim.“SCRATCHY“ adalah teknik membuat perpustakaan crossover denganmenggabungkan ITCHY dan DNA Shuffling secara berurutan.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING – HOMOLOGI URUTAN INDEPENDEN PROTEIN (SHIPREC)Sieber,et al. mengembangkan teknik untuk menciptakan crossover satuperpustakaan chimeric antara dua gen parental tanpa bias untuk posisicrossover .Metode rekombinasi homologi urutan independen protein(SHIPREC), dimulai dengan produksi dimer gen yang kemudian terpecah-pecaholeh DNaseI.Fragment ukuran orangtua dipulihkan dan dibalikkan oleh ligasimelingkar dan restriction menghancurkan untuk menghasilkan sebuahperpustakaan enzim hibrida dengan distribusi yang merata dari posisicrossover.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING – HOMOLOGI URUTAN INDEPENDEN PROTEIN (SHIPREC)Libraries of Hybrid proteins dari distantly related sequencesVolker Sieber, Carlos A Martinez & Frances H Arnold, Nature Biotech, 2001,19,p456-460
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN DNA SHUFFLING – EXON SHUFFLING In vitro exon shuffling merupakan exon domain encoding atau set dari exon pada target gen dan homolog dari yang lainnya. Gen yang berhubungan diamplifikasi dengan chimeric oligonukleotide pada primer dan template pada reaksi seperti PCR yang menyusun kembali Gen dengan panjang penuh. Step terakhir melibatkan penyaringan Pustaka Exon shuffling untuk fungsi atau property yang diinginkan.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE REKOMBINASI NON HOMOLOGMetode rekombinasi non homolog tidak bergantung padaurutan homologi gen orang tuaKarena tidak melakukan hibridisasi fragmen homolog ,melainkan membuat langkah ligasi berujung tumpul (blunt-ended)yang digunakan untuk membawa gen fragmen bersama.Akibatnya, tidak ada bias terhadap komposisi fragmen genditemui.Dengan metode rekombinasi nonhomolog,Memungkinkan untuk membuat perpustakaan chimerasdari dua gen yang sepenuhnya tidak berhubungan.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE REKOMBINASI NONHOMOLOGMetode rekombinasi nonhomolog didasarkan pada pemotonganinkremental, bentuk paling sederhana menciptakan perpustakaanprotein yang memiliki satu atau lebih asam amino , dihapus baik dari C-atau N-terminus .(Ostermeier et al 1999a).Pemotongan Tambahan dan metode terkait tergantung padaexonuclease III (ExoIII) protein dan sifat-sifatnya.ExoIII mengkatalisis pencernaan fragmen gen dari 3 ke ujung 5 padadikontrol, seragam, dan sinkron tingkat (Wu et al 1976).Aliquots Kecil campuran reaksi dihapus selama langkah pencernaanuntuk membuat perpustakaan gen dengan nomor berbeda daripasangan basa DNA yang dihapus.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN Dipandu oleh informasi struktur dan biokimia (independen pada homologi)– dihalangi kompleksiti struktur protein & fungsinya • Random mutagenesis: (-) perlu pengetahuan detail • DNA shuffling: (-) perlu ilmu detail menciptakan enzim hybrid oleh multiple crossover (homolog dependen bersusun tinggi) • StEP: Homologi dependen susunan tinggi • ITCHY & SHIPREC: Homology- Independent tetapi terbatas padaIncreased possible crossovers single crossovers.(the darkness of the bar)
    • APLIKASI REKAYASA PROTEINSTRATEGI DESAIN RASIONAL- DIRECTED EVOLUTION
    • APLIKASI REKAYASA PROTEINSTRATEGI DESAIN RASIONAL- DIRECTED EVOLUTIONMeningkatkan enzyme fitness untuk aplikasi yang ditentukan Enzyme adaptasi: • Meningkatkan aktifitas Substrat Baru • Substrate specificitas -- Multiple substrates affinity • Thermostabilitas-- melting point (Tm) • Adaptasi Temperatur: Activitas pada suhu yang berbeda -- Psychrophilic vs. Mesophilic vs. Thermophilic • Stabilitas atau aktifitas pada linkungan artificial/buatan -- Solvent vs. aqueous solutions -- Metal ions (protease) • Antibiotic resistansi
    • APLIKASI REKAYASA PROTEIN STRATEGI DESAIN RASIONAL- DIRECTED EVOLUTION• Antibiotic resistansiLibrari generasi mutan acak enzim TEM-1menggunakan P dan 8 -oxoG mutagenesisKanan: A-TEM 1 mutan (3D.5) yang dihasilkanoleh random mutagenesis dengan 2.500 kalilipat aktivitas hidrolisis yang lebih tinggiterhadap antibiotic sefalosporin (dari Zaccolodan Gherardi, J mol Biol 1999).
    • APLIKASI REKAYASA PROTEINSTRATEGI DIRECTED EVOLUTION
    • APLIKASI REKAYASA PROTEINSTRATEGI DIRECTED EVOLUTION
    • APLIKASI REKAYASA PROTEINSTRATEGI DESAIN RASIONAL- DIRECTED EVOLUTIONAPLIKASI METODE REKOMBINASI•Rancangan rekombinan Hemoglobin manusia digunakan untuk menentukan pengganti darah.Looker D, Abbott-Brown D, Cozart P, Durfee S, Hoffman S,Mathews AJ, Miller-Roehrich J, Shoemaker S, Trimble S, FermiG, et al Nature 356:258-60 , (1992)•Efek Penanaman allosterik unik dari buaya kepada hemoglobin manusia, Komiyama NH, Miyazaki G, Tame J, Nagai K Nature 373:244-6 (1995)•Merekayasa mutan HGF/SF dengan ikatan yang dikurangi untuk heparin sulfat proteoglikan dan meningkatkan aktifitas in vivo. Hartmann G., Prospero T., Brinkmann V., Ozcelik O., Winter G., Hepple J., Batley S., Bladt F., Sachs M.
    • APLIKASI REKAYASA PROTEINSTRATEGI DIRECTED EVOLUTION
    • APLIKASI REKAYASA PROTEIN STRATEGI DIRECTED EVOLUTIONSusunan Asam amino Alignment pada Subtilisin S41(Davail, et.al 1992), S39 (Narinx, 1992), SSII (Wati,1997),BPN (Wells, 1983), E (Stahl Ferrari ,84’),Carlsberg (Jacobs,85’) dan Termitase (Meloun, 85’). Alignmenmultiple dilakukan dengan CLUSTAK W (Thompson,94’). Residu ditemukan frekuen >50% pada posisi(hitam). Mutasi pada 3-2G7 dilabelkan dengan Kotak terisi. Gap pada susunan (0)
    • APLIKASI REKAYASA PROTEINSTRATEGI DIRECTED EVOLUTION Lineage substilisin varian S41. Varian generasi pertama Yang didapat sebelumnya. (Miyazaki&Arnold, 1999). Tujuh mutasi didapat dari Generasi pertama direkombi- nasikan oleh StEO dan varian terbaik, 2-6C5 didapat pada generasi Pustaka kedua. Diparentkan /dihubungkan dengan gen orangtua untuk Menciptakan generasi pustaka ketiga oleh PCR Error prone. Hanya nonsinonim mutasi ditunjukkan.
    • APLIKASI REKAYASA PROTEIN STRATEGI DIRECTED EVOLUTIONSubtilisin dari struktur yang diketahui. Tujuh mutasi termostabli diidentifikasi padadvarian 3-2G7. Kalsium Ca hitam menindikate site ikatan Ca2+ yang ketat dan indikateCa abu abu site mengikat Ca2+ yang lemah, yang dilokasikan dibelakang loop yangmengandung Ser175 Model diciptakan menggunakan MOLSCRIPT (Kraulis, 1991).Dependasi Temperatur aktifitas spesifik subtilisin S41, 3-2G7, dan SS11.
    • APLIKASI REKAYASA PROTEIN STRATEGI DIRECTED EVOLUTION Sebuah trade off antara aktivitas katalitikDivergent evolution leads untuk pada suhu dan thermostabililt rendahAdaptasi pada lingkungan yang berbeda
    • APLIKASI REKAYASA PROTEIN STRATEGI DIRECTED EVOLUTIONDirected evolution Enzim psychrophilic, Subtilisi S41 Ar, Aktifiti residu; 3-2G7: 7 mutasi asamAssays pada temperatur Ai, activitas inisial amino setelah jumlah siklusyang berbeda Red dots: wild-type shuffling clones Menunjukkan reprodukibilitas J. Biological Chemistry, 2000, 275: 31635
    • APLIKASI REKAYASA PROTEINSTRATEGI DIRECTED EVOLUTION Rekayasa Stabilitas Enzim – T4 Lysozye Dengan Introduksi pada Iktan S-S
    • APLIKASI REKAYASA PROTEIN STRATEGI DIRECTED EVOLUTIONRekayasa Stabilitas Enzim – Triosephospate isomerase dari Yeastdengan menggantikan Asn (deaminasi pada temperatur tinggi)
    • APLIKASI REKAYASA PROTEIN STRATEGI DIRECTED EVOLUTIONRekayasa Aktifitas Enzim – Tyrosyl-tRNA synthetase dari B.Stearothermophilus dengan menggantikan Thr 51 (meningkatkanaffinitas ATP)
    • APLIKASI REKAYASA PROTEIN STRATEGI DIRECTED EVOLUTIONRekayasa Pengaruh Ca – menganalisa Independensi Subtilisin Saturasi mutagenesis -> 7 dari 10 daerah ditemukan untuk memberikan peningkatan stabilitas Mutan: 10x lebih stabil daripada enzim asli dalam ketiadaan Ca 50 % lebih stabil daripada enzim asli dengan adanya Ca
    • APLIKASI REKAYASA PROTEINSTRATEGI DIRECTED EVOLUTION
    • APLIKASI REKAYASA PROTEINSTRATEGI DIRECTED EVOLUTION
    • APLIKASI REKAYASA PROTEINSTRATEGI DIRECTED EVOLUTION
    • APLIKASI REKAYASA PROTEIN STRATEGI DIRECTED EVOLUTION Mengurangi Sensitifitas Protein•Streptococcus streptokinase, 47 kDa protein yang melarutkan clot darah•Komplex dengan plasminogen untuk merubah ke plasmin, yang menurunkan serat pada clot,Plasmin juga menurunkan streptokinase [feedback loop]•Membutuhkano administer streptokinase pada 30-90 min infusi[heart attacks]•A long-lived streptokinase diadministered sebagai single injection•www-s.med.uiuc.edu; JMorrissey: Med Biochem 10/30/06
    • APLIKASI REKAYASA PROTEIN STRATEGI DIRECTED EVOLUTION Mengurangi Sensitifitas Protein•Streptococcus streptokinase, plasminsensitivity domain•Attacks at Lys59 and Lys382, near eachend of protein•Resultant 328 AAc peptide has ~16%activity•Mutate Lys to Gln•Gln has similar size/shape to Lys also nocharge•Single mutations similar to double tonative in binding and activatingplasminogen;•In plasmin presence, half-lives increasedwith double as 21x more resistant tocleavage•TBD…(2003) longer life wanted•www-s.med.uiuc.edu; JMorrissey: Med Biochem 10/30/06
    • APLIKASI REKAYASA PROTEIN STRATEGI DIRECTED EVOLUTION Mushroom peroxidase•Peroxidase, ink cap mushroom; dye transfer inhibitor•Wash conditions:bleach-containingdetergents, pH 10.5,50C, high peroxideconcentration(inactivates peroxidas)•Random mutagenes orerror-prone PCR,followed by DNAshuffling•One construct had 114xincrease in thermalstability, 2.8x increase inoxidative stability
    • APLIKASI REKAYASA PROTEIN STRATEGI DIRECTED EVOLUTIONMolecular analysis hybrid peroxidase •ex., Coprinus cinereus heme peroxidase (ink cap mushroom); 343 AAc, heme prosthetic gr •Multiple rounds directed evolution to generate mutant for dye transfer inhibitor in laundry detergent •Native form or WT is rapidly inactivated under laundry conditions at pH 10.5, •50C and high peroxide concentrations (5-10mM) •Combined mutants from site-directed and random mutagenesis led to mutant with •110x thermal stability, 2.8x oxidative stability •Additional in vivo shuffling of pt mutations -> 174x thermal stability and 100x oxidative stability •Cherry…Pedersen. 99. Nat Biotech “Directed evolution of a fungal peroxidase”
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE MUTASI KIMIA POST TRANSLASIGlycosylation PEGylation as a Mimic of Glycosylation Lipidation1 Thiol Tag (X: –SH) 1 Amine Tag (X: –NH2) 1 NCL Assembly2 Amine Tag (X: –NH2) 2 Azide Tag (X: –N3) 2 Hydroxyl Tag (X: –OH)3 Carbonyl Tag (X: –C=O) 3 NCL Assembly 3 Thiol Tag (X: –SH)4 Olefin Tag (X: –=) 4 Hydroxyl Tag (X: –OH) 4 Olefins (X: –=)5 Azide Tag (X: –N3) 5 Thial Tag (X: –SH)6 Alkyne Tag (X: –≡) . 6 Disulfide Tag (X: –SS)Modifikasi bentuk kualitatif kimia , misalnya, biotinylation untuk tag afinitas,fluoresensi label untuk visualisasi, sering mengabaikan isu-isu strategis utamaTingkat Konversi - beberapa modifikasi metode kimia protein yang dipakaisekarang telah dioptimalkan untuk tingkat yang memungkinkan konversi lengkap.Partial konversi menciptakan kembali kebutuhan untuk pemurnian dimodifikasi dariyang tidak dimodifikasi.Selektivitas - metode yang dirancang untuk chemoselectivity jarang dilakukandalam konteks protein, yang seringkali mengandung banyak kelompok fungsionalsebagai potensial, kompetitif, reaktif partner.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE MUTASI KIMIA POST TRANSLASI-Teknologi dengan cara: - Menghilangkan atau menambahkan daerah Glycosylation - Merubah sifat biokimia atau aktifitas Protein - Meningkatkan kestabilan proteinDengan Merubah Daerah Glycosylation:-Menggunakan teknik Mutagenesis Site-Directed untuk menetapkanDaerah glycosylation yang baru. Sebagai contoh Erythropoietin.-Hubungan direct/langsung antara Karbohidrat yang mengandung AsamSialik dan serum half-life nya dan aktifitas biologi in vivo.-Hubungan Inverse/berlawanan antara ikatan Reseptor (contoh:Glycosylation yang lebih banyak menyebabkan lemahnya ikatan)
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE MUTASI KIMIA POST TRANSLASIGlycosidase:Glikosida digunakan utnuk mendapatkan informasi tentang groupkarbohidrat yang dilampirkan pada glikoprotein dan glikopeptida.Glikosida ada pada dua variasi :=Endoglikosida yang memotong seluruh group karbohidrat dariprotein dan exoglikosida yang menghilangkan monosakarida dariujung nonreduced pada karbohidrat.Pengurangan ujung diciptakan oleh endoglikosidaEndoglikosida diikuti oleh satu atau lebih eksoglikosida dantmenganalisa produk menggunakan SDS-PAGE atau beberapa tipekromatografi cair.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE MUTASI KIMIA POST TRANSLASIPengobatan Anemia dengan perlakuan awal•Hypothesis : Glikosilasi yang lebih banyak menyebabkan: ‐‐> half life yang lebih panjang ‐‐> Lebih aktif ‐‐> mengurangi afinitas ikatanProduk pemrosesan : HyperglycosylatedEPO (Aranesp)Hasil In vivo Tidak adanya kehilangan pada fungsi obat Penambahan serum half‐life (3‐fold lebih panjang) Mengurangi frekuensi administrasi
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE MUTASI KIMIA POST TRANSLASIGlycan dimulai dari penggabungan daerah baru yang untuk kebutuhantarget sintesis reagen glycan kompleks dengan strategi untuk memulaisitus-selektif.Meskipun peran glycans tersebar luas daam fungsi protein , ia hanyamuncul pada kasus-kasus dasar. Metode untuk mengakses glycoformsmurni atau meniru nya, saat ini mulai memainkan peranan kritis dalamaspek unpicking yang tepat untuk fungsi glycan. Amine Tag (X: –NH2)Fig. 5 Modification of a protein with a generic 2-methoxy-2-imino activated monosaccharide.a four equivalents of sodium methoxide; b pH 9.5, 2 h, 41 of 59 residues modified. BSA bovineserum albumin
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE MUTASI KIMIA POST TRANSLASI Modification ketone handle introduced in the Z- domain of staphylococcal protein AModification of HSA using squarate- with oxyamine-functionalized N acetylglucosamine.mediated coupling. a DMF, Et3N, 40%; Conditions are a NaOAc buffer, pH 5.5 and b (1)b HSA, HCO3 buffer, pH 9.0, 25% of UDP-Gal, β-1,4-GalT, (2) CMP-Sia, α-2,3-SiaTlysine residues modified (Olefin Tag)
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE MUTASI KIMIA POST TRANSLASIProtein Kinases:Penambahan reversible gugus fosfat pada protein penting untuk transmisi sinyaldalam sel eukariotik dan, sebagai akibat, fosforilasi protein dan dephosphorylationbanyak mengatur proses seluler yang beragam. Karena jumlah kinase protein yangdikenal telah meningkat dengan kecepatan yang terus meningkat, maka menentukanprotein kinase yang berinteraksi dengan substrat dalam sel dapat dilakukan.Penentuan motif situs konsensus fosforilasi oleh urutan asam amino selaras darisubstrat yang dikenal telah terbukti bermanfaat dalam pengerjaan ini.Motif ini dapat membantu untuk memprediksi situs fosforilasi untuk kinase proteintertentu dalam substrat protein potensial.Protein Phosphatases:Protein fosforilasi memainkan peran dalam regulasi fungsi dan aktivitas faktor proteindan enzim.Protien fosforilasi dapat ditemukan pada tirosin, serin dan threonie residu. Analisisadanya fosforilasi tersebut, dan efek petugas nya, sering dibantu oleh penghapusankelompok protein fosfat oleh fosfatase.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE MUTASI KIMIA POST TRANSLASI-PEGylation (monomethoxypolyethyleneglycol)-Kovalen lampiran polimer, poli (ethylene glycol) (PEG) secara khusus,untuk protein terapeutik adalah metode mapan (Harrisdan Catur 2003).-Digunakan untuk meniru beberapa efek alam glikosilasi dalam rangkameningkatkan perlindungan protein terhadap degradasi enzimatik,memperpanjang sirkulasi setengah hidup dan meningkatkan dayalarut.Prinsip serupa dengan Glycosylation:Aplikasi pada Protein Drugs menghasilkan :- Secara relatih memiliki half-lives yang singkat- Distribusi tissue/jaringan yang lebar- Potensial untuk Immunogenicity
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN REKAYASA PROTEIN METODE MUTASI KIMIA POSTMIMIK POST TRANSLASI KIMIA TRANSLASIMETODE LIPIDASITipe dominan : myristoylation, prenylation dan palmitoylation.Protein prenilasi alam mengacu pada lampiran pasca-translasi rantai lipid farnesyl (C-15) atau geranylgeranyl (C-20) urutan tertentu pada tulang punggung protein dandimodifikasi di C-terminal protein.Proses ini dikatalis oleh tiga enzim berbeda: protein farnesyltransferase dan proteingeranylgeranyltransferase tipe I dan II.Prenylation memiliki efek dramatis pada lipophilicity target protein, membantumembran menahan protein, Ex.Ras G-protein membentuk kompleks dengan proteinpendampingnya,REP, selanjutnya terprenilasi .Farnesylation Protein dan geranylgeranylation memainkan peran penyakit , sepertiosteoporosis, penghambatan geranylgeranylation mencegah pembentukan dan fungsinormal osteoklas, sel-sel terlibat dalam penghancuran jaringan tulang, dan progeriaHutchinson-Gilford, penyakit dimana pasien mengalami penuaan cepat.
    • STRATEGI TEKNIK EVOLUSI YANG DIARAHKAN METODE MUTASI KIMIA POST TRANSLASI Modification of a tyrosine residue with farnesyl or rhodamine by palladium- mediated π-allyl coupling of an allyl acetate or carbamate precursor. Conditions are a Pd(OAc)2, Triphenyl phosphine trisulfonate (TPPTS), H2O/dimethyl sulfoxide, pH 8.5–9.0Carbenoid reactions with tryptophan as an aromatic tag. Although currently nonselective,these reactions highlight a useful new reaction type for protein modification
    • TEKNIK PENGGABUNGAN PROTEIN (FUSI)Teknik ini adalah rekayasa protein baru / novel dengan menggabungkanatau menyatukan susunan protein protein berkode pada satu genterhadap susunan protein berkodekan gen yang berbeda.Contoh yang ada adalah penggunaan An untuk meracuni langsungdaerah target.Seperti Denileukin diftitox (Ontax) – yaitu terapi yang disetujui FDAuntuk Kanker, dengan hasil 30% pasien menglami penguranganpembesaran tumor sebesar 50%.Ontak berasal dari Fusion Protein : IL‐2 + diptheria toxix dan aa 2nd‐133human IL‐2 +1st‐389 aa of diptheria toxintargets IL‐2 receptors padaCTCLs untuk membunuh sel.Denileukin diftitox (Ontak) telah disetujui FDA pada terapi kankerOntak mengikat permukaan sel lymphoma melalui reseptor IL‐2Saat Internalisasi, diptheria toxin membunuh sel sel.
    • TEKNIK ISOLASI PROTEIN Protein ekstraseluler  Tahapan isolasi  Sentrifugasi cairan sel/ medium kultur menghasilkan :  Supernatan (crude extract)  Pelet (sel & komponen non-protein) Protein intraseluler  Tahapan isolasi :  Cuci jaringan/ sel dengan bufer salin : untuk menghilangkan pengotor/ bahan ekstraseluler  Sel mikroba : sentrifugasi & resuspensi dalam bufer  Lisis sel memecah/membuka sel ekstrak : homogenat  Menggunakan mortar/pestle, homogenizer, sonicator, tissue grinder, cell disruptor, blender  Menghasilkan : homogenat  Sentrifugasi menghasilkan :  pelet (mengandung protein membran)  supernatan (crude extract)
    • KLASIFIKASI METODE ISOLASI PROTEIN vs JARINGANKlasifikasi Metode Isolasi Protein Berdasarkan JenisJaringan Protein
    • TUJUAN PEMISAHAN PROTEINTujuan dari Pemisahan Protein adalah kemurnian,  penggunaan bentuk aktif jumlah langkah minimum Memungkinkan waktu yang singkatJANGAN MEMBUANG BAHAN BAHAN MURNI PADA IMPUPRE PROTEINPEMISAHAN DILAKUKAN BERDASARKAN KELARUTAN, UKURAN, MUATAN, DAN IKATAN AFINITAS
    • TEKNIK PENGHILANGAN KOMPONEN NON-PROTEIN
    • METODE PEMISAHAN PROTEIN Metode Kromatografi  Protein protein membedakan bentuk dan charge Ion exchange Kromatografi  Anion and Cation Gel Filtrasi (size exclusion)  Memisahkan berdasarkan ukuran Metode Afinitas  Affinitas terhadap ligands  Rekayasa afinitas sites, e.g. histidine tag
    • TEKNIK PEMISAHAN PROTEIN - KROMATOGRAFIKromatografi gel filtrasi.Campuran protein dalam volume kecil diterapkan pada kolom yang diisi dengan manik-manik berpori.Karena protein yang besar tidak bisa masuk volume internal manik-manik, merekamuncul lebih cepat daripada yang kecil.
    • TEKNIK PEMISAHAN KELARUTAN / SOLUBILITAS Metode Penggaraman/Salting out Kelarutan sensitif terhadap kekuatan ion. Awal "salting in" dan kemudian "salting out" pada kadar garam tinggi. Pelarut terikat dengan berinteraksi pada garam sehingga tidak cukup untuk melarutkan protein. Kadar garam maksimal pada target protein larut, sentrifuge dan membuang pelet. Tambahkan cukup garam untuk menurunkan protein. Kumpulkan pelet. Pelarut organik Mempunyai prinsip sama dengan penggaram; mengambil keuntungan dari kelarutan yang berbeda. Menghindari total protein denaturasi. pH Protein memiliki kelompok berionisasi berrentang pKs. Ketika muatan total protein nol (titik isoelektrik/pI). Protein paling larut pada pl karena interaksi mereka untuk meminimalkan muatan muatan. Kristalisasi Metode kelarutan dimana protein adalah ppt dapat digunakan untuk menumbuhkan kristal protein. Terjadi ketika protein relatif murni.
    • TEKNIK PENGENDAPAN AMONIUM SULFAT (SALTING OUT) Ketika konsentrasi garam yang tinggi hadir, protein cenderung terkumpul dan mengendap keluar dari solusi: "salting out / penggaraman keluar" Endapan protein yang berbeda pada konsentrasi garam berbeda. pH, suhu dan kemurnian protein memainkan peran menentukan titik salting out. Amonium sulfat adalah garam yang dipilih karena menggabungkan banyak fitur yang berguna:  Efektifitas penggaraman / Salting out  pH versalitas  Kelarutan tinggi  Larrutan dengan temperature panas  Harga yang rendah Amonium sulfat konsentrasi: persentasi kejenuhan Persamaan sederhana untuk perhitungan gram amonium sulfat yang dibutuhkan untuk membuat suatu solusi X% dari% Xo: 515 (X-Xo) G=------------------------- 100-0,27X
    • TEKNIK ISOLASI PROTEIN DIALISIS
    • TEKNIK ISOLASI KROMATOGRAFI ION EXCHANGE Low salt P+ + Na+ Na+ + P+ High salt IONIC ELUTION pH ELUTION
    • TEKNIK ISOLASI KROMATOGRAFI ION EXCHANGE
    • TEKNIK PEMURNIAN PROTEIN ION EXCHANGE STRONG CATION STRONG ANION─SO3- ─ Sulpho ─ CH2N+(CH3)3 ─ Triethylaminomethyl─ CH2SO3- ─ Sulphomethyl ─ C2H4N+(C2H5)3 ─ Triethylaminoethyl─ C3H6SO3- ─ Sulphopropyl ─ C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3 ─ Diethyl-2-hydroxy- propylaminoethyl WEAK ANION WEAK CATION ─ C2H4N+H3 ─ Aminoethyl─ COO- ─ Carboxy ─ C2H4N+H(C2H5)2 ─ Diethylaminoethyl─ CH2COO- ─ Carboxymethyl
    • TEKNIK PEMISAHAN PROTEIN – FILTRASI GEL  Porous beads yang terbuat dari material yang berbeda. Ukuran pores dapat dikontrol.  Molekul kecil cukup mudah untuk melalui beads yang lebih besar ukurannya dan berkeliling kemudian mengalir lebih cepat. Pengecualian pada semua protein yang terlalu besar untuk melalui pores.  Dapat digunakan sebagai metode preparasi atau digunakan untuk menentukan ukuran molekul.  Gels terbuat dari deekstran, agarose or polyacrylamide
    • TEKNIK PEMISAHAN PROTEIN – METODE AFINITAS  Ligan yang memiliki ikatan kuat terhadap protein ditempatkan pada matriks :  Protein dengan ikatan yang diinginkan tetapi yang lain dapat melalui.  Elute menggunakan larutan ligan.  Selain molekul kecil, juga dapat menggunakan antibody  Kemajuan biologi molekuler memerlukan rekayasa grup poli-nya yang mengikat Ni atau menggunakan bagian dari protein lain dan kolom yang mengikat ke protein lain
    • TEKNIK PEMISAHAN PROTEIN – METODE AFINITAS
    • TEKNIK ISOLASI PROTEIN dan VISUALISASI•Protein bermigrasi pada medan listrik pada tingkat yangtergantung pada muatan total, ukuran, dan bentuk•Elektroforesis gel merupakan teknik pemisahan oleh muatan(pemisahan dalam media sebagai gels) pada media Gel berpori(pati / poliakrilamida): gel & pewarnaan•Fokus isoelektrik *: protein dipisahkan dalam gel gradien pHberkelanjutan, protein berpindah ke titik pada gel yang samauntuk pl nya, yaitu tak ada muatan.•SDS-PAGE *: Sodium Dodecil Sulfat - elektroforesis gelpoliakrilamida yang memperlakukan protein dengan deterjen ionikyang memisahkan berdasarkan ukuranSDS mengikat protein @ 1 SDS / 2 aas sehingga proporsionalterhadap massa jenis protein.
    • TEKNIK ISOLASI PROTEIN – SDS PAGE
    • TEKNIK IDENTIFIKASI PROTEIN DAN QUANTIFIKASI Identification – biasa dilakukan dengan spectrophotometry spectrophotometers mengukur intensitas cahaya beam sebelum dan sesudah cahaya melewati larutan solveent dengan sampel terlarut padanya, (in a cuvette)... Membandingkan intensitas dua cahaya terhadaap panjang gelombang yagn dilewati. Percent transmittance... Rasio dari intensitas cahaya melewati sampel terhadap intensitas cahaya yang bersinar pada sampel dikalikan 100%. Absorbance... adalah logaritma transmittans Instruments... Spectronic 20/ spectrophotometer UV/ Vis
    • TEKNIK DETEKSI PROTEIN METODE SPEKTROFOTOMETRI UV absorbance at 280 nm. (measures aromatic aas) Colorimetry reactions - colored dye binds to amino acids Ninhydrin reaction - rxs w amino = blue color (10-9 M) Biuret test = mg quantities… based on Copper ion binds stiochiometrically = violet color Bradford test = ug amounts based on dye Coomassie blue - binds to peptide Fluoroescamine dye = pg quantities... (10-12 M) Quantifikasi jumlah protein ditampilkan berdasarkan hukum BEER- LAMBERT linear relationship antara... light Absorbance vs. Conc Protein Standard Curve
    • TEKNIK QUANTIFIKASI KONSENTRASI PROTEIN DENGAN AKTIFITAS ENZIMBerkaitan jumlah protein &aktivitas enzim1 (internasional) UNIT KEGIATAN Enzimjumlah protein yang mengubah 1 micromole dariSubstrate ke produk per menit pada 250C pada pH yang optimal UREASE - 1 unit (IU) akan membebaskan 1,0 μmole amonia dariurea per menit pada pH 7,0 pada suhu 25 ° C[Equivalent untuk 1.0 I.U.]1UNIT KEGIATAN KHUSUSjumlah micromoles dikonversi per min per mg proteinyaitu, Unit (seperti di atas) aktivitas enzim per mg protein1 UNIT KEGIATAN MOLEKULjumlah unit aktivitas enzim per μmole
    • TEKNIK PURIFIKASI PROTEINProtein Purification
    • TEKNIK PURIFIKASI PROTEIN
    • APLIKASI TEKNIK FUSION PROTEINE. coli tidak dapat digunakan untuk menghasilkan beberapa protein terutama yangmembutuhkan modifikasi pasca-translasi untuk aktivitas biologis dan beberapakompleks protein lain yang mengandung beberapa ikatan disulfida.Selain itu, banyak protein disajikan dalam E. Coli adalah akumulasi intra dalam bentuklarut, inklusi bodies tidak aktif, dari aktivitas biologis yang harus dipulihkan olehdenaturasi rumit dan mahal serta proses refolding.Kelemahan E. coli menyebabkan perkembangan penggunaan sistem ekspresi dengansel hewan / sel tumbuhan.Namun, meskipun sistem tersebut telah terbukti mampu menghasilkan protein aktifyang otentif, sering ditemui kegagalan untuk mengembangkan metode yangsederhana dan efisien, hasil tinggi, biaya rendah untuk produksi protein dalam jumlahbesar.Kemajuan dalam protein refolding, translokasi dan peran chaperons molekul danfoldases telah memungkinkan desain strain E. coli rekombinan yang menumpukprotein dalam bentuk terlarut, protein mensekresikan ke periplasm, ekspor kemedium, dan protein langsung ke membran luar sel untuk menampilkanpermukaan. Kemajuan ini akan diperkuat lebih lanjut status dominan E. coli sebagaihost untuk produksi protein rekombinan.
    • APLIKASI TEKNIK FUSION PROTEIN Figure 2. Keuntungan dan Kerugian produksi pretin pada setiap kompartemen Escherichia coli untuk menargetkan ekspresi protein ke kompartemen selular tertentu, yaitu, dengan ruang sitoplasma, ruang periplasmic atau medium, terletak pada keseimbangan keuntungan dan kelemahan dari masing-masing kompartemen (Gambar 2).
    • APLIKASI TEKNIK FUSION PROTEIN Expression Systems: Overview Dalam vektor ekspresi pMal Fusion ™ dan Sistem PemurnianbProtein, kloning gen dimasukkan ke dalam vektor vektor ekspresi pMal turun dari gen laki-laki, yang menyandikan protein-pengikat maltosa (MBP). Hal ini menyebabkan ekspresi protein fusi MBP-yang kemudian dimurnikan oleh pemurnian afinitas satu langkah khusus untuk MBP.
    • APLIKASI TEKNIK FUSION PROTEINSecreted protein processing with K. lactis. In the nucleus, an integratedexpression vector encoding a fusion between the α-MF domain (blue)and a desired protein (black) is expressed.A signal peptide in the α-MF domain directs entry of the fusion proteininto the endoplasmic reticulum (ER) and is removed by signalpeptidase (SP). The fusion protein is transported to the Golgi where theKex protease removes the α-MF domain. The protein of interest is thensecreted from the cell.
    • APLIKASI TEKNIK FUSION PROTEIN Purifikasi step tunggal chromatographic Target penggabungan protein pada setiap terminal C- or N -Tidak memerlukan proteasis -- T7 promotor menjadmin level ekspresi yang tinggi -- Hasil protein dengan susunan native - Eluted protein dengan C-terminal thioester dapat menjadi ligase untuk ptptida atau protein (Intein Mediated Protein Ligation, IPL Kit memungkinkan fusi dari Tag yang terdiri dari ikatan intein dan domain chitin domain (CBD), pada C-terminus (pTXB1) atau N-terminus (pTYB21) target protein. Dengan adanya thiols, seperti DTT, intein menjalanin pemotongan sendiri yang sepesik yang melepaskan target protein dari ikatan Tag chitin-intein
    • APLIKASI TEKNIK FUSION PROTEIN•In Vitro Protein Sintesa Kit:Sistem Transkripsi/Translasi Sel Bebas•Rekonstitusi dari komponen murni seperti translasi E. coli•Komponen Recombinant bebas mengkontaminasi exonucleases, RNases dan proteases•Hasilnya protein yang bebas untuk dimoddifikasi dan degradasi•Reaksi satu langkah membutuhkan pencampuran hanya dua tabung diikuti oleh penambahanTemplate DNA hanya beberapa jam•Sintesa protein divisualisasikan dengan Pewarnaan Gel Coomassie
    • APLIKASI TEKNIK FUSION PROTEINMagnetic AffinityIdeal untuk skrining proteomic throughput yang tinggi, isolasi protein kecil , isolasiimmunomagnetic atau percobaan pemisahan sel- Memurnikan tagged protein, antigen, antibodi atau asam nukleat- Pemisahan cepat fase-padat dari larutan- Substrat immobil tetap aktif secara biologis- Elute dalam volume kecil atau digunakan sebagai ligan dalam interakasi pull-down atau target percobaan yang melibatkan DNA atau proteinMagneticSeparation Racks
    • APLIKASI TEKNIK FUSION PROTEIN Protein Tools and Glycomics Overview