Descripción y diferenciación de los distintos tipos de cromatografía

1. HPLC Y
FPLC

2. ¿QUE ES EL HPLC?
La cromatografía de líquidos de alto
rendimiento (HPLC) es una técnica de
química analítica muy amplia que se
utiliza para separar compuestos en
una mezcla de sustancias químicas.
Se hace uso del caudal de una fase
móvil que pasa a presión a través de
una columna empaquetada con una
fase estacionaria.

3. FUNDAMEN
TO
La fase móvil transporta una muestra líquida a
través de la columna hasta el detector y los
compuestos o analitos se separan debido a los
distintos grados de interacción con la fase
estacionaria.
El detector mide los analitos después de la elución
de la columna, y un sistema de datos de
cromatografía (CDS) traduce la señal que se ha
detectado.
Los datos traducidos del análisis mediante HPLC se
presentan en un cromatograma, donde el eje «x» es
una medida del tiempo y el eje «y» mide una señal
específica generada por el detector.

4. PRINCIPIO
S
BASICOS
Analito: compuesto(s) de interés para la detección mediante análisis de
HPLC
Fase móvil: fase en movimiento compuesta por disolventes o eluyentes
que fluyen desde que se introducen hasta que finaliza la detección
Fase estacionaria: fase fija en la que se produce la separación física de
los analitos
Caudal: rapidez a la que fluye la fase móvil con respecto al tiempo
Tiempo de retención: tiempo entre la inyección de las muestras y la
señal de picos máxima del analito en un cromatograma
Eficacia: expresada como el número de placas teóricas, una medida
clave para cuantificar la eficacia de una separación
Resolución: capacidad para distinguir entre picos y el principal aspecto
que tener en cuenta en cualquier separación
Selectividad: capacidad para separar dos analitos
Volumen de vacío: todo el volumen de una columna que no está
ocupado por la fase estacionaria
Límite de detección: cantidad más pequeña de un analito que se puede
detectar de forma fiable
Límite de cuantificación: cantidad mínima o máxima de un analito que
se puede cuantificar de forma fiable

5. ¿QUIEN LO INVENTO?
En 1901, presentó un método de cromatografía
de adsorción para separar los pigmentos
vegetales con éter de petróleo en un tubo de
vidrio estrecho y lleno de carbonato de calcio.
Tsvet publicó su trabajo en 1903 y probó 126
adsorbentes en polvo diferentes. Fue la primera
persona en utilizar el término «cromatografía»
en sus artículos publicados en 1906.

6. OTRAS APORTACIONES
Publicaron un nuevo tipo de cromatografía de
partición que utilizaba gel de sílice en las columnas
para mantener el agua inmóvil mientras el
cloroformo fluía a través de la columna con el fin de
separar los aminoácidos.
Este experimento fue el comienzo del desarrollo de
la HPLC, aunque aún se necesitarían 30 años más
para empezar a utilizar bombas que empujaran la
fase líquida a través de la columna empaquetada. Richard Lawrence Millington
Synge y Archer John Porter
Martin

7. FACTORES
QUE
AFECTAN A
LAS
SEPARACIO
NES EN LA
HPLC
Propiedades fisicoquímicas
del analito, como el tamaño,
la carga, la polaridad y la
volatilidad
Propiedades fisicoquímicas
de la fase estacionaria,
como la polaridad, la carga y
la viscosidad
Propiedades fisicoquímicas
de la fase móvil y su
interacción con el analito y
las fases estacionarias

8. ¿SEPARACIONES
ISOCRÁTICAS O DE
GRADIENTES?
En los métodos isocráticos las separaciones se realizan
mediante el uso durante el análisis de un eluyente de
composición uniforme, como acetonitrilo al 100 % o una
mezcla 50:50 de acetonitrilo y agua.
Por su parte, en los métodos de gradiente suelen emplear
dos disolventes, denominados A y B. El ciclo comenzará con
un cierto porcentaje de A frente a B como, por ejemplo, un
60 % de agua frente a un 40 % de acetonitrilo. A
continuación el porcentaje de los disolventes irá cambiando
a lo largo de la separación.

9. UHPLC
Los métodos de cromatografía de líquidos de rendimiento
ultralto (UHPLC) se utilizan con partículas de fase
estacionaria de <2 µm y alcanzan presiones de
funcionamiento de entre 600 y 1200 bar a caudales de
entre 0,2 y 0,7 mL/min. Este mayor intervalo de presión
ofrece mejor resolución y sensibilidad, mayor capacidad de
procesamiento y menor uso de disolventes que los sistemas
de HPLC estándar. La UHPLC amplía las posibilidades de la
HPLC tradicional al permitir que los usuarios utilicen
partículas y columnas de menor diámetro interior y finalicen
los análisis más rápidamente.
Los métodos de cromatografía de líquidos de alto
rendimiento se utilizan con partículas de fase estacionaria
de entre 3 y 5 µm y alcanzan presiones de funcionamiento
de hasta 600 bar a caudales de entre 1 y 2 mL/min. La
HPLC estándar es el tipo de cromatografía de líquidos más
utilizada en los distintos sectores.

10. ¿QUE ES EL
FPLC?
FPLC es un tipo de cromatografía líquida que purifica
biomoléculas grandes como proteínas, nucleótidos y péptidos.
Que cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC)
A menudo se utiliza para analizar o purificar mezclas de
proteínas.
Esto se basa en el principio de la afinidad de los componentes de
la muestra con un líquido en movimiento (fase móvil) y un sólido
poroso (fase estacionaria).
En FPLC, la fase móvil es un tampón y la fase estacionaria es una
resina en perlas. Por lo general, consiste en agarosa reticulada
empaquetada en una columna cilíndrica de vidrio o plástico.

11. POSTERIORMENTE, LA SOLUCIÓN (ELUYENTE QUE CONTIENE LA PROTEÍNA DE INTERÉS)
SE PASA A TRAVÉS DE DOS DETECTORES QUE MIDEN LA CONCENTRACIÓN DE SAL Y LA
CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA. A MEDIDA QUE ELUYE CADA PROTEÍNA, APARECE COMO
UN "PICO" DURANTE LA DETECCIÓN Y SE PUEDE RECOLECTAR PARA SU USO
POSTERIOR.

12. ¿CUÁL ES LA
DIFERENCIA
ENTRE FPLC
Y HPLC?

13. REFERENCIAS
Cromatografía líquida de proteína rápida". News-Medical.net, 25 de enero de 2019.
Conceptos básicos de la HPLC | Thermo Fisher Scientific - MX. (2015). Thermofisher.com.
https://www.thermofisher.com/mx/es/home/industrial/chromatography/chromatography-
learning-center/liquid-chromatography-information/hplc-basics.html#:~:text=Contact%20us-
,What%20is%20HPLC%3F,packed%20with%20a%20stationary%20phase.
Facultad de Química. (2022, August 4). Facultad de Química.
https://quimica.unam.mx/investigacion/servicios-para-la-investigacion/usaii/purificacion-de-
proteinas-por-
fplc/#:~:text=La%20cromatograf%C3%ADa%20l%C3%ADquida%20de%20prote%C3%ADnas,colu
mnas%20cromatogr%C3%A1ficas%20de%20diversos%20tipos
Ashkan Madadlou, Siobhán O’Sullivan, & Sheehan, D. (2010). Fast Protein Liquid
Chromatography. Methods in Molecular Biology, 439–447. https://doi.org/10.1007/978-1-
60761-913-0_25

14. GRACIAS