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manual de cromatografia
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manual de cromatografia

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  • 1. CROMATOGRAFÍA-2011Página 1INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍAINTRODUCCIÓNLa cromatografía es una técnica que permite la separación de loscomponentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos.a) Retención. Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por unafase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a unsoporte sólido.b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla poruna fase móvil, que puede ser un líquido o un gas.El fenómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo largode la fase estacionaria, impulsados por la fase móvil, recibe el nombre deelución. La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionaría, mientras quela móvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la mezcla adistinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativascon ambas fases. Las dos fases se eligen de forma que los componentes de lamuestra se distribuyan de modo distinto entre la fase móvil y la faseestacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la faseestacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrariolos componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven conrapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de lamuestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativay/o cuantitativamente.
  • 2. CROMATOGRAFÍA-2011Página 2TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil sepueden distinguir distintos tipos de cromatografíaa) Cromatografía sólido-líquido. La fase estacionaria es un sólido y lamóvil un líquido.b) Cromatografía líquido-líquido. La fase estacionaria es un líquidoanclado a un soporte sólido.c) Cromatografía líquido-gas. La fase estacionaria es un líquido novolátil impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas.d) Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la móvilun gas.Según el tipo de interacción que se establece entre los componentes de lamezcla y la fase móvil y estacionaria podemos distinguir entre.a) Cromatografía de adsorción. La fase estacionaria es un sólidopolar capaz de adsorber a los componentes de la mezclamediante interacciones de tipo polar.
  • 3. CROMATOGRAFÍA-2011Página 3b) Cromatografía de partición. La separación se basa en lasdiferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en lasfases estacionaria y móvil, que son ambas líquidas.c) Cromatografía de intercambio iónico. La fase estacionaria es unsólido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuyacarga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en lafase móvil.CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓNLa adsorción es la propiedad que tienen ciertos sólidos de aumentar laconcentración en su superficie de otras sustancias. La separación se debe a lasdiferencias de adsorción de los componentes de una mezcla sobre la faseestacionaria. La fase estacionaria ha de ser un sólido polar de gran superficie(adsorbente). La fase móvil puede ser un gas o un líquido dando lugar a lacromatografía gas-sólido (CGS) o líquido-sólido (CLS).El grado de adsorción varía según la naturaleza y superficie específica delos adsorbentes y naturaleza de los solutos. Los enlaces entre moléculasadsorbidas y el adsorbente han de ser débiles para que su fijación sea reversible,las uniones son debidas a fuerzas intermoleculares (interacciones dipolo-dipoloo puentes de hidrógeno). Como regla general, las polaridades del adsorbente yde los solutos han de ser opuestas.Cromatografía líquido-sólido (CLS).La fase estacionaria está constituida por un sólido polar poroso y que estafinamente granulado. La superficie específica contiene centros polares aptospara la adsorción de las moléculas polares presentes en la fase móvil. Al
  • 4. CROMATOGRAFÍA-2011Página 4disminuir el tamaño de las partículas, el número de centros activos por unida esmayor, y la capacidad de adsorción se incrementa. El adsorbente más utilizadoes gel de sílice aunque también se emplea alúmina activada. En el caso del gelde sílice la interacción se establece entre los grupos Si-OH y Si-O-Si, y losgrupos funcionales polares de los compuestos orgánicos.La fase móvil está constituida por un disolvente en el que loscomponentes de la mezcla deben ser al menos parcialmente solubles. Lavelocidad de elución de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad dela fase móvil y se puede utilizar un gradiente de polaridad aumentando con eltiempo la proporción del disolvente más polar.Propiedades de los disolventes más comunes.Disolvente Fórmula químicaPunto deebulliciónConstantedieléctricaDensidadDisolventes no polaresHexano CH3-(CH2)4-CH3 69 °C 2,0 0,655 g/mlBenceno C6H6 80 °C 2,3 0,879 g/mlTolueno C6H5-CH3 111 °C 2,4 0,867 g/mlÉter dietílico CH3CH2-O-CH2-CH3 35 °C 4,3 0,713 g/mlCloroformo CHCl3 61 °C 4,8 1,498 g/mlAcetato de etilo CH3-C(=O)-O-CH2-CH3 77 °C 6,0 0,894 g/mlDisolventes polares apróticos1,4-Dioxano CH2-CH2-O-CH2-CH2-O 101 °C 2,3 1,033 g/ml
  • 5. CROMATOGRAFÍA-2011Página 5Tetrahidrofurano (THF) CH2-CH2-O-CH2-CH2 66 °C 7,5 0,886 g/mlDiclorometano (DCM) CH2Cl2 40 °C 9,1 1,326 g/mlAcetona CH3-C(=O)-CH3 56 °C 21 0,786 g/mlAcetonitrilo (MeCN) CH3-C≡N 82 °C 37 0,786 g/mlDimetilformamida(DMF)H-C(=O)N(CH3)2 153 °C 38 0,944 g/mlDimetil sulfóxido(DMSO)CH3-S(=O)-CH3 189 °C 47 1,092 g/mlDisolventes polares próticosÁcido acético CH3-C(=O)OH 118 °C 6,2 1,049 g/mln-Butanol CH3-CH2-CH2-CH2-OH 118 °C 18 0,810 g/mlIsopropanol (IPA) CH3-CH(-OH)-CH3 82 °C 18 0,785 g/mln-Propanol CH3-CH2-CH2-OH 97 °C 20 0,803 g/mlEtanol CH3-CH2-OH 79 °C 24 0,789 g/mlMetanol CH3-OH 65 °C 33 0,791 g/mlÁcido fórmico H-C(=O)OH 100 °C 58 1,21 g/mlAgua H-O-H 100 °C 82 1,000 gLa retención se realiza en base a la competencia que se establece entre elsoluto a separar (S) y las moléculas de la fase móvil (M) por adsorberse a loscentros activos polares (X) de la fase estacionaria. Así las moléculas de soluto seadsorben a los centros activos de la fase estacionaria y van siendo desplazadospor las moléculas polares presentes en la fase móvil.
  • 6. CROMATOGRAFÍA-2011Página 6Los tiempos de retención y la selectividad en la separación dependerán dela polaridad de los compuestos a separar (S), la naturaleza del adsorbente (X) yla naturaleza de los disolventes que componen la fase móvil (M).Cromatografía en capa fina.La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa,uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser devidrio, aluminio u otro soporte. La fase móvil es líquida y la fase estacionariaconsiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y eleluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma quelos componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.La mezcla a analizar se deposita a una pequeña distancia del bordeinferior de la placa y se introduce en una cubeta que contiene la fase móvil, queasciende a lo largo de la placa por capilaridad, desplazando a los componentesde la mezcla a diferentes velocidades, lo que provoca su separación. Cuando elfrente del disolvente se encuentra próximo al extremo superior de la placa estase saca y se visualiza.La relación entre la distancia recorrida por un compuesto y por eldisolvente desde el origen se conoce como Rf (rate factor).Rf= Distancia recorrida por el compuestoDistancia recorrida por el disolvente
  • 7. CROMATOGRAFÍA-2011Página 7La búsqueda del eluyente requiere probar con varios disolventes dediferente polaridad o con mezclas. Para compuestos poco polares, que sedesplazan con mucha facilidad, se debe utilizar un disolvente apolar como elhexano y en el caso de compuestos de polaridad media, mezclas de hexano yacetato de etilo.La mayoría de las placas de cromatografía llevan un indicadorfluorescente que permite la visualización de los componentes activos a la luzultravioleta (254 nm). En el caso de componentes que no absorban a la luzultravioleta, la visualización requiere utilizar un agente revelador. El reveladorreacciona con los productos proporcionando productos coloreados.Cromatografía preparativa en placa.La cromatografía preparativa se lleva a cabo en placas de gel de sílice de1-2 mm de espesor sobre un soporte de vidrio. Se utiliza para la separación yaislamiento de los componentes de una mezcla en cantidades comprendidasentre 100-200 mg.
  • 8. CROMATOGRAFÍA-2011Página 8En la superficie del adsorbente (gel de sílice), mediante una pipetaPasteur, se traza una línea continua con la muestra disuelta y se introduce laplaca en posición vertical en una cubeta. Durante la elución debe permanecertapada para evitar la evaporación del disolvente. Una vez se han separado losproductos que componen la muestra, se marca con una cuchilla el contorno delcompuesto a aislar y con ayuda de una espátula se desprende del soporte devidrio el gel de sílice con el compuesto adsorbido. Una vez transferido a unerlenmeyer se añade un disolvente en el cual sea soluble el producto, se filtra elgel de sílice y una vez eliminado el disolvente tenemos el producto puro.Chromatotron.
  • 9. CROMATOGRAFÍA-2011Página 9Cromatografía en columna.Es el método más utilizado para la separación de compuestos orgánico aescala preparativa. La fase estacionaria se deposita en el interior de una columnade vidrio que termina con una placa porosa que impide su paso y en unestrechamiento con una llave. La mezcla se deposita sobre la parte superior de lafase estacionaria mientras que la fase móvil atraviesa el sistema. Loscompuestos van saliendo por separado de la columna y se recogen en fracciones,los más polares quedan más retenidos y para que salgan generalmente hace faltaaumentar la polaridad del disolvente. El tiempo necesario para eluir uncompuesto de la columna se llama tiempo de retención.El adsorbente más utilizado para cromatografía de columna es gel desílice, aunque también se puede emplear alúmina y florisil. La elución de la
  • 10. CROMATOGRAFÍA-2011Página 10cromatografía puede realizarse por gravedad o mediante presión (Flashchromatography), la diferencia en ambos casos está en el tamaño de laspartículas de gel de sílice (0,063-0,200 nm, sílice de columna, 0,040-0,063 nm,sílice flash). Debido a que la disminución del tamaño de las partículas deadsorbente conduce a una separación más eficaz, la cromatografía a mediapresión (flash) proporciona mejores resultados, además de ser más rápida.Las variables que más influyen en la eficacia de la separación encromatografía de columna y utilizando gel de sílice como adsorbente son lassiguientes;a) Diámetro de la columna y cantidad de gel de sílice. La altura deladsorbente está relacionada con la diferencia de Rf de los componentesde la mezcla. El diámetro de la columna con la cantidad de producto aseparar.b) Elección del disolvente. El disolvente tienen que conducir a una buenaseparación de los componentes de la mezcla en capa fina, utilizándoseen muchos casos mezclas de disolventes y se realiza una elución engradiente. Una de las mezclas más utilizadas es hexano/acetato deetilo.Cromatografía en papel.Es la más sencilla de las técnicas, pero sólo nos dará resultadoscualitativos. Está casi en desuso. El método se basa en un mecanismo de reparto,y consiste en depositar una pequeña cantidad de muestra en el extremo de unatira de papel de filtro, que se deja evaporar. Luego se introduce la tira en unacubeta que contenga el disolvente, de manera que éste fluya por la tira porcapilaridad.
  • 11. CROMATOGRAFÍA-2011Página 11Cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo, se retira elpapel y seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen colorpropio se verán las manchas de distinto color separadas. Cuando loscomponentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado.Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz: laelección del disolvente y la del papel de filtro.CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN.La cromatografía líquido-líquido, también llamada de partición secaracteriza por emplear una fase estacionaria líquida, anclada a un soportesólido, y una fase móvil también líquida. El soporte sólido por lo general es gelde sílice, sobre cuya superficie se ha anclado una fase líquida con laincorporación de una cadena hidrocarbonada larga, mediante la transformaciónde los grupos silanol (Si-OH) de la gel de sílice en grupos siloxano (Si-O-Si-R),lo que proporciona una fase líquida estacionaria térmicamente estable y difícilde hidrolizar en condiciones normales.
  • 12. CROMATOGRAFÍA-2011Página 12Tabla. Cadenas hidrocarbonadas ancladas a la gel de sílice en cromatografíalíquido-líquido.Funcionalidad Estructura Polaridad TipoDiamino -(CH2)3-NH(CH2)2-NH2 Muy alta NormalAminopropilo -(CH2)3-NH2 Alta NormalNitrilo -(CH2)n-CN Media NormalNitro -(CH2)n-NO2 Media NormalDiol (CH2)3-OCH2-CH(OH)-CH2OH Débil NormalDimetilamino -(CH2)3-N(CH3)2 Débil NormalPropilo -(CH2)2-CH3 Baja InversaFenilo -(CH2)n-Ph Baja InversaOctilo -(CH2)7-CH3 Baja InversaOctadecilo -(CH2)17-CH3 Muy baja InversaLa polaridad de la fase estacionaria puede modificarse en función de lanaturaleza de las cadenas hidrocarbonadas introducidas en la gel de sílice, lo quepermite disponer de fases estacionarias con selectividad diferente. La separaciónen la cromatografía líquido-líquido se basa en la diferencia de solubilidad de loscomponentes de la mezcla entre las dos fases líquida o en las diferentesinteracciones de los componentes de la mezcla con los grupos funcionalespresentes en la cadena enlazada al gel de sílice. En función de la polaridad de lafase líquida estacionaria, se distingue entre:a) Cromatografía en fase normal. La fase estacionaria está constituida por unlíquido de carácter polar. Como fase móvil se emplean mezclas dedisolventes apolares (hexano, pentano), con disolventes polares (cloroformo,diclorometano, T.H.F., etanol, metanol o acetonitrilo). Se utiliza para laseparación de compuestos muy polares que quedarían demasiado retenidosen una cromatografía sólido-líquido. En este tipo de cromatografía el ordende elución está gobernado por interacciones de tipo polar: los solutos máspolares quedan más retenidos, igual que en la cromatografía de adsorción.
  • 13. CROMATOGRAFÍA-2011Página 13b) Cromatografía en fase reversa. La fase estacionaria está constituida por unlíquido de carácter apolar. Como fase móvil se emplean mezclas de agua condisolventes polares miscibles, como metanol o acetonitrilo siendo la fasemóvil más polar que la fase estacionaria. Se emplea para la separación demezclas de compuestos de polaridad baja, que se retienen muy poco en unacromatografía sólido-líquido, y para la separación de compuestos de unamisma serie homóloga. La retención se explica en base a una adsorciónpreferencial del disolvente menos polar de la fase móvil a la superficie de lascadenas apolares que constituyen la fase estacionaria, de manera que seestablece un mecanismo complejo que supone una combinación deequilibrios de solubilidad (partición) de la mezcla que se cromatografía entrela fase líquida adsorbida a la fase estacionaria y la fase móvil.La separación ocurre como consecuencia de las diferencias en la superficieapolar de los componentes de la muestra, los compuestos menos polaresserán más solubles en la fase estacionaria que los más polares. Por tanto, alcontrario que en la fase normal, los compuestos más polares estarán menosretenidos que los menos polares. Los tiempos de retención disminuyencuando menor sea la proporción de agua, cuando menos polar sea eldisolvente empleado.Cromatografía de intercambio iónico.La cromatografía de intercambio iónico (cromatografía iónica) es unproceso que permite la separación de iones y moléculas polares basado en laspropiedades de carga de las moléculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo demolécula cargada, incluyendo grandes proteínas, pequeños nucleótidos yaminoácidos. La solución que se inyecta es usualmente llamada muestra y los
  • 14. CROMATOGRAFÍA-2011Página 14componentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada amenudo en purificación de proteínas, análisis de agua o control de calidad.La fase estacionaria (resina de intercambio) muestra en la superficiegrupos funcionales iónicos que interactúan con iones de carga opuesta. Este tipode cromatografía se subdivide a su vez en la cromatografía de intercambiocatiónico y cromatografía de intercambio aniónico:La cromatografía de intercambio catiónico retiene cationes cargadospositivamente debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcionalcargado negativamente (SO3-, CO2-). Las resinas cuyo grupo funcional activo esun sulfonato (SO3-) se consideran resinas intercambiadoras ácidas fuertes,mientras que aquéllas cuyo grupo funcional activo es un ión carboxilato (CO2-)se consideran resinas ácidas débiles.R-A-H++ M++ B-<--> R-A-M++ H++ B-La cromatografía de intercambio de aniones retiene aniones usandogrupos funcionales cargados positivamente, como un catión de amoniocuaternario (R4N+).R4-N+L-+ M++ B-<--> R4-N+B-+ L-+ M+
  • 15. CROMATOGRAFÍA-2011Página 15R-H++ M+<--> R-M++ H+ Kd= [M+]R[H+] / [M+] [H+]REste tipo de cromatografía se basa en el equilibrio de intercambio iónicoentre una fase sólida que contiene grupos sulfónicos o carboxílicos (para laseparación de cationes) o grupos amino cuaternarios, ternarios o secundarios(para la separación de aniones) y los iones presentes en la fase móvil. Porejemplo, para la separación de cationes se puede utilizar una resina de ácidodébil donde se producirá el siguiente equilibrio:R-CO2H + M+ R-CO2M + H+En este caso, el catión M+puede ser eluido de la columna por un ácidofuerte en una concentración capaz de desplazar el equilibrio representado en laecuación anterior hacia la izquierda. El desarrollo de esta técnica al estado de
  • 16. CROMATOGRAFÍA-2011Página 16cromatografía de alta resolución, llamada cromatografía iónica, fue posible apartir de la década del 70 cuando se desarrollaron recubrimientos que contienenlos materiales típicos para el intercambio (grupos sulfónicos para cromatografíacatiónica y grupos aminos cuaternario para cromatografía aniónica). Estosrecubrimientos se depositan sobre pequeñas esferas de sílice, vidrio o de algúnpolímero que son capaces de soportar las altas presiones comúnmente utilizadasen cromatografía líquida de alta resolución.PRÁCTICA DE CROMATOGRAFÍA EN COLUMNAEn todo procedimiento en química orgánica reconocemos las etapas quese muestran en el siguiente esquema para el aislamiento y caracterización de losproductos orgánicos.Esquema: Esquema general de las etapas de aislamiento y purificación delos productos preparados en un proceso sintético en química orgánicaReactivos Mezcla de reacciónOtrosProductos de reacciónA + B C + DPurificación CaracterizaciónExtracción SeparacióncromatográficaCristalizaciónDestilaciónPfPebRMN
  • 17. CROMATOGRAFÍA-2011Página 17Una vez ha concluido la reacción, la mezcla resultante se extrae paraseparar los sustratos que nos interesan. A continuación la mezcla obtenida, quegeneralmente es el producto de reacción, productos secundarios, reactivos y/oalgo del producto de partida, se separa por cromatografía de columna.Finalmente los productos, para caracterizarlos correctamente, y por reglageneral, requieren de una purificación adicional que se lleva a cabo medianteotra cromatografía más cuidadosa y/o cristalizaciones-destilaciones, según elcaso.En ocasiones y por necesidades de tiempo en los laboratorios de prácticasno se lleva a cabo la separación cromatográfica, aunque sea una operaciónnecesaria en el trabajo de síntesis, como hemos indicado en párrafos anteriores.Por esta razón hemos considerado oportuno incluirla como ejemplo en un cursointroductoria, de esta manera damos una visión real del trabajo sintético enquímica orgánica.En esta experiencia se propondrá la separación de los componentes de unamezcla hipotética de reacción por cromatografía de columna. Las mezclasestarán constituidas realmente por dos sustancias. Por ello, y como en casosanteriores, se sugiere tener conocimiento de las características de los sustratosantes de comenzar.Las mezclas estarán constituidas por 0.2 g de cada uno de los productos yantes de proceder a su separación habrá que decidir eluyente más adecuado parapoder desarrollar una separación aceptable.Procedimiento generalPara el proceso de separación-purificación por cromatografía de columna se
  • 18. CROMATOGRAFÍA-2011Página 18siguen los siguientes pasos:A) Se sujeta la columna a unsoporte y se rellena con la fase estacionariaen forma de papilla o en seco según se nosindique.B) Opcionalmente se puede añadirarena hasta obtener una franja de unos 2-5mm de espesor, para proteger el frente de lafase estacionaria.C) Se deposita la muestra endisolución o adherida a una pequeñacantidad de adsorbente sobre la arena,procurando tener una franja horizontal.D) Opcionalmente se puede ponerotra franja de arena como la primera o unpoco de lana de vidrio.E) Añadir la fase móvil concuidado por la pared de la columna hastallenarla.
  • 19. CROMATOGRAFÍA-2011Página 19F) Los componentes de la mezcladeben eluirse manteniendo un flujo continuode disolvente.G) Las fracciones recogidasdeberán analizarse mediante una técnicacromatográfica analítica: cromatografía decapa fina para comprobar su contenido ypureza. Las fracciones que tengan semejantecontenido se juntan en el mismo matraz,previamente pesado y el disolvente seelimina en el rotavapor.