Un repaso de los ensayos recientes de historia de la ciencia y la tecnología ...
Expo southern bolt
1. TÉCNICA DE BIOLOGÍA
MOLECULAR.
SOUTHERN BLOT
Universidad De Santander
INTEGRANTES
Silvia Pérez
Marcela J. chaustre
Leydi Rincón
Cielo Ramirez
Presentado a:
Henrry Bautista Amorocho
Docente – Biologia Molecular
2. Edwin Southern
Sir Edwin Mellor Southern.
Nació el 07 de junio 1938 en
Burnley , Lancashire y fue
educado en Burnley
Grammar School.
Premiado por la invención de
la transferencia de Southern.
3. Fue conocido durante muchos años.
Esta técnica se implemento por primera
ves en los años 1950 y 1960 en diversos
tipos de estudios de hibridación de ácidos
nucleídos.
En la década de 1970 se empezaron a
implementar los métodos de electroforesis
en gel Permiten la separación de los
fragmentos de ADN según su tamaño.
4. Metodología Original Del Southern Blot
Un gel de electroforesis de agarosa, se coloca en un papel de filtro, se
forma una conexión entre el gel y un depósito de tampón de alta
salinidad. La membrana de nitrocelulosa se coloca en la parte superior
del gel y se cubre con una torre de toallas de papel que se mantienen
en su lugar con un peso. la memoria intermedia pasa a través del gel y
los fragmentos de ADN se obtienen en la membrana.
8. ADN digerido con enzima de restricción.
Fragmentos son separados por tamaños
Electroforesis en gel.
9. Mecanismo de acción de la enzima
Rompe el ADN en la secuencia GGCC.
Corte entre 2 y 3 nucleótido. (G y C).
El ADNt conocido como fragmentos de restricción.
HaeIII corta las cadenas de ADN en la misma localización .
La desnaturalización caliente ocurre a los 80 °C después de 20 minutos.
13. Hibridación
La doble hebra de ADN se forma por
complementariedad SONDA-muestra
La doble hebra de ADN se forma por
complementariedad SONDA-muestra
Los nucleótidos de la sonda está marcados P 32
(radiactivos)
Los nucleótidos de la sonda está marcados P 32
(radiactivos)
Si al revelar hay marcador radiactivo presente, está
en la muestra analizada la secuencia complementaria
a la sonda Southern Blot
Si al revelar hay marcador radiactivo presente, está
en la muestra analizada la secuencia complementaria
a la sonda Southern Blot
14. Tipos De Sondas De Hibridación
Sonda Scorpion
Sonda Molecular Beacon
Sonda TaqMan
Sonda LNA (Locked Nucleic Acid)
Cycling Probe Technology (CPT)
15. Sondas Scorpion
Moléculas mixtas Contienen un cebador específico para
el amplicón unido a una horquilla similar a la sonda del tipo
beacon
Posee un elemento complementario al amplicón (Clon
molecular).
Conjunto de moléculas de ADN idénticas Resultado de
PCR.
Los fluoróforos se encuentran en la horquilla
Cuando se cierra no se produce emisión de fluorescencia.
Cuando se separan se produce fluorescencia Amplicón en la
horquilla.
16. Sonda Molecular Beacon
Son oligonucleótidos de cadena simple Poseen una zona
de apareamiento de bases internas, formando una horquilla.
En presencia del amplicón la sonda se abre y se unen
Formando una emisión de fluorescencia.
Según su estructura poseen:
La zona complementaria al amplicón en el giro de la
horquilla.
Complementariedad interna en el cuello.
Fluoróforos en extremos: Donador en el 5' y aceptor en
el 3'.
19. Que son los RFLPs ?
Descubiertos por Sir Alec Jefrreys en 1985.
RFLP Re strictio n Frag m e nt Le ng th Po lym o rphism o
polimorfismos en la longitud de los fragmentos de
restricción.
Son secuencias de nucleótidos en DNA reconocidas y
cortadas Por enzimas de restricción.
En humanos esta puede producir gran numero de cortes en
secuencias especificas.
22. Aplicaciones de la técnica
Utilizado para clonación basada en homología en base a
secuencia de aminoácidos de proteína producto del gen diana.
Se diseñan oligonucleótidos similares a la secuencia diana, se
sintetizan químicamente.
Usados para cribar biblioteca de ADN.
Identificación de sitios metilados en genes particulares.
26. • Mutación en el gen FMR1 ubicado en el sitio 27.3
del brazo largo del cromosoma X.
• Codifica para la proteína FMRP Desarrollo
cerebral.
Fragile Mental Retardation Protein
Casi todas las personas tienen 29
repeticiones, y los diferentes alelos se
clasifican en cuatro categorías.
• Alelos normales 5 - 44
• Alelos intermedios 45 – 54
• Alelos con pre-mutación 55 - 200
• Alelos con la mutación completa
201
Introducción
28. Metilación anormal de los islotes
CpG.
Bloquea la expresión de los genes.
Las alteraciones moleculares
fundamentales consisten Aumento en el número de
repeticiones CGG en la región 5’
del locus FMR1.
PREVENCION FUNDAMENTAL: Asesoramiento
genético oportuno a los miembros de la familia
afectada.
PREVENCION PRIMARIA: Opciones reproductivas,
que se realizan mediante diagnóstico precoz,
embrionario o fetal.
PREVENCION TERCIARIA: Estudio de los pacientes con éste
síndrome ha permitido plantear estrategias específicas para
mejorar su funcionamiento intelectual y su adaptación social.
29. Se estudiaron 8 familias SFX - 39
miembros, se realizaron 4 diagnósticos pre-
natales.
Se estudiaron 8 familias SFX - 39
miembros, se realizaron 4 diagnósticos pre-
natales.
Se aislaron muestras de ADN a partir de sangre o liquido
amniótico Empleando precipitación salina.
Se aislaron muestras de ADN a partir de sangre o liquido
amniótico Empleando precipitación salina.
Muestras analizadas mediante Southern
blot.
Muestras analizadas mediante Southern
blot.
Se tomaron 7 µg de DNA genómico Digeridos por
16 horas con 50 U de enzimas Hind III Eag I.
Se tomaron 7 µg de DNA genómico Digeridos por
16 horas con 50 U de enzimas Hind III Eag I.
Metodología
30. Se realizo electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % a 40 volt por 22
horas Fraccionar los fragmentos de ADN.
Se realizo electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % a 40 volt por 22
horas Fraccionar los fragmentos de ADN.
ADN se fija a membrana de nylon Hibridado
con sonda Pp2, marcada con isotopo p32.
ADN se fija a membrana de nylon Hibridado
con sonda Pp2, marcada con isotopo p32.
Incubado a 16 horas en baño termóstatado a 65 °C.Incubado a 16 horas en baño termóstatado a 65 °C.
Se realizaron 2 placas radiográficas en casette,
expuestas a la membrana en refrigeración por 3 días
hasta su revelación.
Se realizaron 2 placas radiográficas en casette,
expuestas a la membrana en refrigeración por 3 días
hasta su revelación.
31. Se confirmo diagnostico de alelo causante de SFX.
Resultados
32. 61% de los individuos tenían las expansiones CGG
aumentadas.
Inestabilidad meiotica en madres portadoras Tienen
hijas e hijos con aumento en el numero de
expansiones.
33. En 4 casos la expansión fue por línea materna.
34. En 1 caso el abuelo paterno era el transmisor del alelo.
35. Conocer las causas moleculares de la enfermedad
ayudan a garantizar el asesoramiento genético a
pacientes y familiares en riesgo.
La transmisión dada por el alelo del abuelo paterno fue
la responsable del retraso mental en dicha familia.
Al resto de las familias no se les realizo este análisis ya
que algunos miembros estaban fallecidos.
Discusión
36. Se reporto pre-mutación en hombres como estable en la
espermatogénesis, aunque se segrega a sus hijas –
Estas son fenotípicamente normales.
En ellas es inestable en la ovogénesis Pueden tener
hijos afectados.
La pre-mutación se expande a mutación completa en
mujeres portadoras Riesgo de 30% de padecer el
síndrome.
37. Esta técnica es una de las mas precisas y exactas, de
gran utilidad para verificar los casos positivos de SFX y
diagnostico pre-natal.
Estudia el tamaño de la expansión (CGG)n y el estado
de metilación de los islotes CpG adyacente al gen
FMR1 No se logra mediante PCR.
38. Aplicaciones
Aplicaciones de la técnica Southern blot en medicina.
1. En el diagnóstico y caracterización de diversas inmunodeficiencias.
2. En la distrofia muscular de Duchenne.
3. En la hipoplasia adrenal congénita la deficiencia de glicerol-quinasa.
