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2003 97 pps_extracción y purifiación de proteínas
 

2003 97 pps_extracción y purifiación de proteínas

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Técnicas de trabajo con proteínas

Técnicas de trabajo con proteínas

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    2003 97 pps_extracción y purifiación de proteínas 2003 97 pps_extracción y purifiación de proteínas Presentation Transcript

    • Técnicas de trabajo con Proteínas
    • Trabajando con Proteínas Análisis de Proteínas Puede ser Cualitativo Cuantitativo midiendo su Actividad sabiendo su Ecuación Rendimiento Rx Proporción entre enzima y cofactor pH óptimo Tiene varias etapas Extracción Fraccionamiento Extracto crudo Centrifugación diferencial mediante Solubilidad Diálisis Cromatografía Electroforesis Enfoque isoeléctrico Electroforesis de 2D Intercambio catiónico Exclusión por tamaño De afinidad HPLC Normal Reversa Puede ser de fase
    • Progreso de purificación de una enzima hipotética Extracción y purificación de proteínas ¿Es la muestra apta para Cristalografía?
    • Definición de actividad específica Extracción y purificación de proteínas Las canicas rojas constituyen la enzima de interés. Las canicas de otros colores son otras enzimas. La actividad de la enzima de interés es mucho mayor respecto al resto en el vaso de la derecha que respecto al resto en el vaso de la izquierda. En el vaso de la derecha hay mayor actividad específica para la enzima de interés, puesto que está más pura.
      • Fraccionamiento por Desnaturalización.
      Fraccionamiento
    • Fraccionamiento
      • Fraccionamiento por sales.
    • Extracción por lisis osmótica
    • Centrifugación diferencial
    • Cromatografía en fase normal
    • Cromatografía en fase reversa
    • Cromatografía de columna Funcionamiento General Hay cromatografías de columna isocrática y en gradiente
    • Gránulos de polímero con grupos de carga negativa Cromatografía de columna Intercambio Catiónico Cargas muy positivas Cargas netas positivas Cargas netas negativas Cargas muy negativas Las proteínas se mueven a través de la columna a ritmos determinados por sus cargas netas y el pH usado. Si hay intercambio catiónico, las proteínas con mayor carga negativa se mueven y eluyen más rápido.
    • Gránulos porosos de polímero La mezcla de proteína se agrega a la columna que contiene polímero entrecruzado Moléculas de proteína separadas por tamaño, las moléculas más grandes pasan con mayor libertad, apareciendo en las primeras fracciones. Cromatografía de columna Exclusión por tamaño
    • HPLC Cromatografía de columna
    • Cromatografía de columna Cromatograma de HPLC Picos de anchura reducida son preferibles Inyección Elución
    • Cromatografía de columna Width Base Ancho de base tR = tiempo de elución – tiempo de inyección
    • Cromatografía de columna tR ht = altura del pico W1/2 = anchura del pico en ht/2 Wb = W1/2 * 1,70 Aceptable de 1,70 en adelante
    • Cromatografía de columna Resolución Rs Rs = Δ tr/Wavg Wavg = (Wbx + wby)/2 Rs > 1,5 para un 1% de solapamiento Resolution
    • Cromatografía de columna Factor de Asimetría Assimetry Factor As As = B/A Simetría perfecta en As = 1,0 Aceptable hasta 1,5
    • Cromatografía de columna Factor de acercamiento Tailing Factor TF = B/2A Simetría perfecta en TF = 1,0 Aceptable hasta 1,5
    • Cromatografía de columna Cuantificación
    • La mezcla de proteínas se agrega a la columna que contiene polímero con los ligandos específicos de la proteína de interés. Mezcla de proteínas Proteínas de menor importancia son eluídas primero. La proteína de interés es eluída mediante adición de más solución de ligando. Solución de ligando Proteína requerida ligando Afinidad Cromatografía de columna
    • Prueba de ELISA Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay Una molécula específica de anticuerpos se adsorbe sobre las paredes de una microgradilla. Método directo
    • Prueba de ELISA Método directo Una suspensión de suero que contenga los antígenos específicos del anticuerpo es agregada Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Como control se agrega una suspensión que no contiene el antígeno específico Método directo Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método directo Si el espécimen contiene los antígenos específicos para los anticuerpos adheridos a las paredes, se produce la unión entre estos en el pozo donde está la muestra. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método directo Se retira la suspensión para que posibles antígenos específicos remanentes no interfieran en el resultado. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método directo Se repone el solvente. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método directo Se repone el solvente. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método directo Se agrega una alícuota del anticuerpo, pero esta vez modificado. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA El anticuerpo trae consigo una enzima reportadora, diseñada para cambiar de color si reacciona con su sustrato. Método directo Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método directo La suspensión con el anticuerpo modificado también es agregada al pozo de control. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método directo En un pozo con una muestra de un espécimen con el antígeno, los anticuerpos modificados se unirán a ellos. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método directo Nuevamente se retira el solvente , y de esta manera ; los anticuerpos modificados en el pozo control, y en el pozo de la muestra, en caso de que el espécimen sea negativo en cuanto al antígeno de interés. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método directo Se repone el solvente por última vez. Aquí permanecen, en caso de positivo, los complejos de anticuerpos conjugados, ya que están adheridos a la fase estacionaria. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método directo Se agrega el sustrato de la enzima reportadora a ambos pozos Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método directo Si el espécimen es positivo, habrá en el pozo aún anticuerpos con enzima reportadora. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Estos responderán cambiando de color. Método directo Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método directo Al cabo de un período específico de tiempo, la suspensión total en el pozo se teñirá, si en este está el antígeno de interés. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método indirecto La microgradilla debe estar diseñada para adsorber un antígeno específico para un anticuerpo de interés. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método indirecto Tanto en el pozo control como en el pozo para la muestra ,se pone el antígeno específico para el anticuerpo de interés. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método indirecto Al agregar la muestra, habrá formación de conjugado si en ella está presente el anticuerpo de interés. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método indirecto Se retira el remanente para evitar que otros anticuerpos provoquen interferencias. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método indirecto Se repone con nuevo solvente. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método indirecto Si la muestra tiene contenido de la anticuerpo de interés, este puede detectarse mediante la adición del mismo anticuerpo conjugado con una enzima. Estos anticuerpos reportadores se unen a las inmunoglobinas, generalmente IgG.. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método indirecto Como este pozo conteine anticuerpos humanos, se usa la enzima conjugada a un anticuerpo inmunoglobina anti-humana IgG Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método indirecto También se agrega el anticuerpo conjugado a la enzima a el pozo de control. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método indirecto En caso de positivo para el anticuerpo de interés, la IgG se unirá a aquellos que estén adsorbidos en las paredes del pozo. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método indirecto Y en caso de negativo, los anticuerpos con la enzima reportadora serán eluídos, como en el pozo de control. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método indirecto Se repone el solvente para la adición del sustrato de la enzima reportadora. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método indirecto El sustrato de la enzima reportadora se agrega. Originalmente, se basaba esta técnica en la coloración. Recientemente se desarrollaron técnicas que usan el fenómeno de fluorescencia. Estas tienen mayor sensibilidad. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método indirecto En caso de que la muestra contuviera el anticuerpo de interés, la enzima reaccionará con el sustrato y provocará tinción de la suspensión en el pozo. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Prueba de ELISA Método indirecto La suspensión coloreada significa positivo para el anticuerpo de interés. Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Método competitivo Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay Prueba de ELISA El antígeno se adhiere a la fase sólida del microplato. Antígeno de peste Bovina, incubado a 37ºC , 1h
    • Se agrega tanto la muestra como un anticuerpo que competirá con aquél que se está buscando, en caso de que esté presente. Método competitivo Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay Prueba de ELISA Anticuerpos del suero del espécimen (la muestra). Anticuerpos Ab monoclonales (Mab) para peste bovina La muestra fue incubada a 37ºC, 1h.
    • No hay anticuerpo de interés en la muestra o su concentración es insuficiente, el anticuerpo que se une es el competidor, al que se une una enzima marcada. La adición del sustrato de esta, produce coloración o fluorescencia. Método competitivo Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay Prueba de ELISA Negativo HRPO anti-ratón conjugada Mab unida al antígeno
    • El anticuerpo buscado se une al antígeno. La enzima marcada no puede unirse. No hay coloración/fluorescencia al adicionar el sustrato de la enzima marcada. Método competitivo Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay Prueba de ELISA Positivo Anticuerpo para peste bovina del suero (la muestra) unido al antígeno.
    • Prueba de ELISA Vista de los resultados de una prueba de Elisa Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay
    • Ezyme –Linked ImmunoSorbent Assay Prueba de ELISA Prueba de embarazo
    • La unión Ag – Ac causa la precipitación del complejo. ACCIÓN DE LOS ANTICUERPOS Inmunoprecipitación Separación por
    • Electroforesis de papel Separación por
    • Electroforesis en gel poliacrilamida Muestras diferentes son cargadas en pozos en el borde de una capa de gel de poliacrilamida. Las proteínas se mueven hacia dentro del gel cuando se aplica un campo eléctrico Separación por
    • Peso de una proteína Determinación del
    • Isoelectroenfoque Separación por
    • 2D Electroforesis Las proteínas se separan primero por enfoque isoeléctrico en un gel cilíndrico. El gel se pone horizontal sobre una nueva plancha de gel, y las proteínas se separan por electroforesis de gel SDS poliacrilamida. Separación por
    • Análisis mediante Western Blot
    • Análisis mediante Dicroísmo Circular ¿Es la muestra apta para Cristalografía?
    • Determinación de proteínas Cristalografía Relación entre las longitudes de onda y los objetos para los que resultan convenientes en su microscopía
    • Cristalografía Determinación de proteínas
    • Cristalografía Determinación de proteínas
    • Cristalografía Determinación de proteínas
    • Determinación de proteínas Cristalografía Sólo la amplitud de onda de las difracciones puede ser determinada experimental mente. Antes de calcular la fase, lo que se conoce es un molde de la proteína desprovisto de densidad electrónica, pero con coordenadas.
    • Determinación de la fase Sustitución Isomórfica Una proteína con amplitudes similares es comparada con la muestra, teniendo en cuenta matrices de rotación y vectores de traslación. Los cálculos se hacen mediante transformada de Fourier en un software.
    • Determinación de la fase Sustitución Molecular Un átomo pesado se introduce en el modelo obtenido. Se compara la intensidad de sus puntos de difracción X (provenientes de su densidad electrónica) con los de la muestra. Se determina la fase mediante prueba y error.
    • Cristalografía Modelado y Refinado
    • Cristalografía Determinación de proteínas
    • Reacción en Cadena de Polimerasa Método de Amplificación
    • Método de Amplificación Reacción en Cadena de Polimerasa en Tiempo Real
    • La Proteína Verde Fluorescente GFP, por cuyo descubrimiento y desarrollo, recibieron el premio Nobel de Química en Octubre de 2008 , Osamu Shimomura, Marty Chalfie & Roger Tsien.
    • La Proteína Verde Fluorescente La Aequorea Victoria y otros portadores Aequorea, Renilla [Sea Pansy] , Obelia y Phialidium.
    • La Proteína Verde Fluorescente Usos Marcador de Fusión Planta de canola marcada con GFP para seguimiento de GM (cultivos modificados genéticamente) Marcador de Expresión Indicador
    • Artículo Uso de la GFP para estudiar la ruta de infección de la en modelos de peces, in vivo e in vitro. Edwardsiella Tarda
    • Uso de la GFP para estudiar la ruta de invasión de la E tarda en peces Gourami azul T richogaster trichopterus (izquierda) y Carpa Cyrpinus Carpio (abajo) In vivo In vitro Modelos usados
    • Uso de la GFP para estudiar la ruta de invasión de la E tarda en peces Tabla 1
    • Tabla 2 Uso de la GFP para estudiar la ruta de invasión de la E tarda en peces Se registraron los valores como media ± error estándar de cuatro ensayos. La adherencia se expresa como % de bacteria todavía adherida después de lavar las monocapas (sin gentamicina). La internalización se expresa como % de bacterias ingresadas que sobrevivieron al tratamiento con gentamicina.
    • Uso de la GFP para estudiar la ruta de invasión de la E tarda en peces Tabla 3 y Figura 1 Evidencia de la internalización de la E tarda en las EPC obtenidas mediante microscopía confocal
    • Uso de la GFP para estudiar la ruta de invasión de la E tarda en peces Figura 2 Cinética de la infección con E tarda en el Gourami azul Sangre Músculo intestino Corazón Vesícula biliar Hígado Corazón Bazo
    • Uso de la GFP para estudiar la ruta de invasión de la E tarda en peces Figura 3 Secciones de músculo e hígado del Gourami a, b, d y e, microfotografías., c y f microfotografías de fluorescencia
    • Uso de la GFP para estudiar la ruta de invasión de la E tarda en peces Se postula que
      • El mecanismo que usa la E tarda para ingresar a la célula parece depender de la polimerización de la actina.
      • El aprovechamiento de otras vías de señalización , que tienen como común denominador la producción de ión calcio; indica que la E tarda necesita a la proteína cinasa C, activada. Estas cascadas de señalización previas son las de tirosina cinasa y fosfolipasa C.
      • hay factores de virulencia no conocidos para la E tarda dadas las diferentes cinéticas de infección en los modelos utilizados y las diferentes medidas de replicación halladas.
    • ¡Gracias!