Cromatografía de gases
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×
 

Cromatografía de gases

on

  • 10,584 views

Contenidos base para la presentación CURSO DE CG SP.pdf

Contenidos base para la presentación CURSO DE CG SP.pdf

Statistics

Views

Total Views
10,584
Views on SlideShare
10,584
Embed Views
0

Actions

Likes
5
Downloads
134
Comments
0

0 Embeds 0

No embeds

Accessibility

Categories

Upload Details

Uploaded via as Adobe PDF

Usage Rights

© All Rights Reserved

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Processing…
Post Comment
Edit your comment

Cromatografía de gases Cromatografía de gases Document Transcript

  • Instrumentación y Análisis Cromatografía.- Introducción INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFIA El método más general para tratar una interferencia, consisten en la separación física delanalito. Hoy en día el método más utilizado con este fin es la cromatografía.DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA CROMATOGRAFIA Abarca un grupo variado e importante de métodos de separación, que permiten alquímico separar, aislar e identificar componentes estrechamente relacionados presentes enmezclas complejas; muchas de estas separaciones son imposibles por otros medios. En todos estos métodos, se emplea una fase estacionaria y una fase móvil. Loscomponentes de una mezcla se transportan a través de una fase estacionaria por medio de unafase móvil que fluye; las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migraciónentre los componentes de la muestra.Tipos de fases estacionarias En la cromatografía los componentes que se desea separar deben ser solubles en la fasemóvil. Deben ser también capaces de interaccionar con la fase estacionaria ya sea disolviéndoseen ella, adsorbiéndose, o reaccionando con ella en forma química. Como consecuencia, durantela separación los componentes se distribuyen entre ambas fases.a) Cromatografía en columna La fase estacionaria es un sólido finamente dividido sostenido en un estrecho tubo devidrio o un metal. La fase móvil, que puede ser un líquido o un gas, se obliga a pasar a través delsólido bajo presión o bien se deja percolar por efecto de la gravedad.b) Cromatografía plana La fase estacionaria puede ser un papel poroso o un sólido finamente dividido que seaplica sobre una placa de vidrio. En este caso la fase móvil se desplaza a través del sólido ya seapor acción capilar o bajo la influencia de la gravedad. La fase estacionaria puede también ser un líquido inmovilizado inmiscible con la fasemóvil. Se emplean diferentes procedimientos para fijar en su lugar la fase estacionaria líquida.Por ejemplo, un sólido finamente dividido recubierto por una delgada capa de líquido puedecolocarse en un tubo de vidrio o metal, y a través de este se deja fluir o percolar la fase móvil.Por lo general, el sólido no tiene una función directa en la separación y actúa sólo para sosteneren su lugar la fase estacionaria por medio de la adsorción. Otro procedimiento, consiste enrecubrir las paredes internas de un tubo capilar con una delgada capa de líquido y hacer pasarentonces, una fase móvil gaseosa a través del tubo. Finalmente, la fase estacionaria puedesostenerse en su lugar sobre fibras de papel o sobre la superficie de partículas muy finasaplicadas sobre una placa de vidrio.Cromatografía lineal Todos los procedimientos cromatográficos, se basan en las diferencias en el grado con elcual los solutos sufren partición entre la fase móvil y la fase estacionaria. Los equilibriosUNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Cromatografía.- Introducciónrelacionados pueden describirse en forma cuantitativa por medio de una constante dependientede la temperatura, el coeficiente de partición K:donde Cs es la concentración analítica total de un soluto en la fase estacionaria y CM es suconcentración en la fase móvil. En el caso ideal, la razón de partición es constante en una ampliagama de concentraciones de soluto; es decir, Cs es directamente proporcional a CM. Pero, conmayor frecuencia no hay relaciones lineales. Las concentraciones en una columna cromatográfica son por lo general bajas. «Lacromatografía que se lleva a cabo bajo condiciones tales que K es constante, se denominacromatografía lineal». Aquí se considera sólo este tipo de cromatografía.Cromatografía de elución lineal En la cromatografía de elución, una única porción de la muestra disuelta en la fase móvilse introduce en la parte superior de una columna, después de lo cual los componentes de lamuestra se distribuyen entre ambas fases. El agregado de una cantidad adicional de fase móvil(el eluyente) hace avanzar columna abajo al disolvente que contiene una parte de la muestra,donde se produce un nuevo proceso de partición entre la fase móvil y las porciones nuevas de lafase estacionaria. Simultáneamente, la partición entre el nuevo disolvente y la fase estacionariatiene lugar en el sitio de colocación inicial de la muestra. Las continuas adiciones de disolventedesplazan a las moléculas del soluto a lo largo de la columna en una serie de transiciones entre lafase móvil y estacionaria. Debido a que el movimiento del soluto puede tener lugar sólo en lafase móvil, la velocidad media a la que migra el soluto, depende de la fracción de tiempo en elque permanece en esa fase. Esta fracción es pequeña para los solutos con relaciones de particiónque favorecen la retención en la fase estacionaria y grande para aquellos en los que la retenciónen la fase móvil es más importante. En condiciones ideales las diferencias resultantes en estasvelocidades hacen que los componentes de una mezcla se separen en bandas localizadas a lolargo de la columna. El aislamiento puede lograrse entonces haciendo pasar suficiente fasemóvil por la columna para hacer que estas distintas bandas sobrepasen el extremo, donde puedenrecogerse; alternativamente, el contenido de la columna puede ser extraído y dividido enporciones que contienen los distintos componentes de la mezcla. El proceso por el cual el soluto es lavado en la columna añadiendo nuevo disolvente sellama elución. Si se coloca al final de la columna un detector que responda a los solutos y serepresenta gráficamente su señal como una función del tiempo (o del volumen de la fase móvilagregada), se obtiene una serie de picos, a lo que se llama cromatograma y útil para el análisiscualitativo y cuantitativo. La posición de los picos sirve para identificar los componentes de lamuestra. Las áreas de los picos pueden relacionarse con la concentración.Teorías de la elución cromatográfica Es evidente que el movimiento de los solutos a través de la columna aumenta la distanciaentre las zonas ocupadas por un tipo de sustancia en particular, pero al mismo tiempo tiene lugarun ensanchamiento de las zonas ocupadas (bandas), lo que disminuye la eficiencia de lacolumna como dispositivo de separación. El ensanchamiento de la zona es inevitable; sinUNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Cromatografía.- Introducciónembargo, afortunadamente este proceso es más lento que la separación de la zona. De esta formaes posible la separación neta de ambas especies, siempre que la columna posea una longitudsuficiente. Una teoría útil de la cromatografía debe ser capaz de explicar no sólo la velocidad a lacual migran los solutos, sino también la velocidad de ensanchamiento de la zona durante lamigración, dado que la limpieza de una separación depende igualmente de ambos fenómenos.a) Teoría de los platos Teoría original de la cromatografía, fue capaz de describir las velocidades de lamigración en forma cuantitativa; pero no logró describir los efectos de las numerosas variablesque dan lugar al ensanchamiento de las zonas. La teoría de los platos, desarrollada originalmente por Martin y Synge considera que unacolumna cromatográfica está compuesta por una serie de estrechas capas horizontales ycontiguas separadas, denominadas platos teóricos. Se supone que en cada plato tiene lugar elequilibrio del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria. El movimiento del soluto y deldisolvente, ocurre como una transferencia de un plato al siguiente. La eficiencia de una columna cromatográfica como dispositivo de separación mejora amedida que aumenta el número de equilibrios es decir, a medida que se incrementa el número deplatos teóricos. En consecuencia el número de platos teóricos N, se utiliza como una medida dela eficiencia de la columna. Un segundo término, la altura equivalente de un plato teórico H,también sirve para este fin. La relación entre ambos parámetros es L N Hdonde L es la longitud del empaque de la columna. Esta ecuación se sigue aplicando, sinembargo un plato como una entidad física no existe en una columna. En consecuencia, el plato ysu altura deben ser considerados como criterios de eficiencia de una columna.b) TEORIA CINETICA DE LA CROMATOGRAFIA La teoría cinética de la cromatografía describe con éxito los efectos de las variables queafectan el ancho de una banda de elución así también su momento de aparición en el extremo deuna columna.Formas de las zonas La forma gaussiana típica de un cromatograma puede atribuirse a la combinación aditivade los movimientos al azar de los miles de partículas del soluto en la banda o zonacromatográfica. Ciertas partículas individuales, viajan rápidamente en virtud de su inclusiónaccidental en la fase móvil durante la mayor parte del tiempo. Otras por el contrario, puedenretardarse debido a que se incorporan en la fase estacionaria durante un tiempo mayor que elpromedio. La consecuencia de estos procesos individuales al azar, es la distribución simétrica delas velocidades alrededor del valor medio, que representa el comportamiento de la partículamedia más común. El ancho de la zona aumenta a medida que ésta se desplaza por la columna debido a queha existido más tiempo para la migración. En consecuencia, el ancho de la zona estádirectamente relacionado con el tiempo de residencia de la columna e inversamente relacionadoUNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Cromatografía.- Introduccióncon la velocidad a la cual fluye la fase móvil. Fig. 4.1. Determinación de la desviación estándar de un pico cromatográfico. En este caso, W = 4 ; tR es el tiempo de retención para un soluto retenido por el empaque de la columna, y tM es el tiempo para uno que no lo es. En consecuencia tM es aproximadamente igual al tiempo necesario para que una molécula de la fase móvil pase a lo largo de la columna. Desviación estándar como una medida del ancho de zona. El ancho de una zonagaussiana se relaciona en forma conveniente con un único parámetro llamado desviaciónestándar ; aproximadamente el 96% del área bajo esta curva se encuentra dentro de unintervalo de más menos dos desviaciones estándar (± ) de su máximo. Entonces, una desviaciónestándar deducida de un cromatograma sirve como una medida cuantitativa adecuada delensanchamiento de la zona. Es útil emplear un símbolo para indicar que unidades se emplean; de esta forma se usará para una desviación estándar en unidades de longitud, y t cuando se trata de unidades detiempo. En la figura 4-1 se ilustra una forma simple para obtener un valor aproximado de yen un cromatograma experimental. Se trazan las tangentes a ambos lados de la curva de Gauss yse extienden para formar un triángulo con la abscisa. Las intersecciones se producenaproximadamente a ±2 del máximo; es decir, W = 4 . Cálculo de H y N a partir del ancho de la zona. El ensanchamiento de la zonacromatográfica se expresa adecuadamente en términos del cuadrado de la desviación estándar (lavarianza) por unidad de longitud de la columna. Por definición, 2 H Ldonde H representa la altura del plato teórico en centímetros, es la medida de la eficiencia y L esla longitud de la columna, expresada también en centímetros ( debe estar en cm). Otra formade escribir características de separación de una columna, es reemplazando el valor H dado por laecuación del número de platos teóricos, en la última ecuación y despejar para N, L2 N 2UNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Cromatografía.- Introduccióndonde N es el número de platos contenidos en una columna de longitud L. Evidentemente, laeficiencia de una columna aumenta a medida que aumenta el número de platos y disminuye laaltura de cada uno de ellos. Causas del ensanchamiento de la zona. Los picos cromatográficos se ensanchan por logeneral, debido a tres procesos bajo control cinético, la difusión en remolino, la difusiónlongitudinal, y la transferencia de masa fuera del equilibrio. Las magnitudes de estos efectosestán determinadas por variables controlables tales como la velocidad de flujo, el tamaño de lapartícula del material de empaque, las velocidades de difusión y el grosor de la fase estacionaria.La relación entre la eficiencia de las columnas cromatográficas y la magnitud de estos tresfactores es la ecuación de van Deemter (izquierda) y su versión moderna (derecha), querelaciona la velocidad de flujo u y la altura del plato. B B H A Cu ; H CS u CM u u uEn este caso, la magnitud A se relaciona con la difusión en remolino, B con la difusiónlongitudinal y C con la transferencia de masa fuera del equilibrio. ANALISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO POR MEDIOS CROMATOGRAFICOS La cromatografía se ha desarrollado como el principal método de separación paraespecies químicas estrechamente relacionadas. Además, puede utilizarse para la identificacióncualitativa y la cuantificación de las especies separadas.Análisis cualitativo Un cromatograma proporciona sólo una única pieza de información cualitativa acerca decada especie en una muestra, es decir, su tiempo de retención o su posición en la faseestacionaria después de un cierto período de elución. Sin embargo la información cualitativaobtenible por medio de la cromatografía es pequeña en comparación con los espectros IR,además la precisión de la abscisa en un espectro es mejor que la del equivalente cromatográfico(tR). Sin embargo constituye una herramienta muy utilizada para identificar los componentesde mezclas que contienen un número limitado de especies posibles cuyas identidades seconocen. Por ejemplo se puede comprobar la presencia o ausencia de 30 o más aminoácidos enun hidrolizado proteínico con un grado de certeza relativamente grande en base a las posicionesde estas especies después de separarlas sobre una placa de cromatografía en capa delgada. Además la identificación espectroscópica positiva, es por lo general imposible sobre unamezcla tan compleja como la del ejemplo anterior sin una separación cromatográfica preliminar.Así, muchas veces, la cromatografía constituye un precursor esencial de los análisisespectroscópicos cualitativos.UNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Cromatografía.- Introducción ANALISIS CUANTITATIVO La cromatografía cuantitativa se basa en una comparación ya sea de la altura o del áreade los picos cromatográficos producidos por los analitos en comparación con uno o máspatrones. Si las condiciones están perfectamente controladas, ambos parámetros varíanlinealmente con la concentración. Análisis basado en la altura de los picos. La altura de un pico cromatográfico se obtieneconectando la línea de base de cada lado del pico por medio de una línea recta y midiendo ladistancia perpendicular entre esta línea y el pico. Esta medida puede tomarse generalmente conuna precisión razonablemente grande y proporciona buenos resultados siempre que lasvariaciones en las condiciones de la columna no alteren el ancho de los picos durante el períodonecesario para obtener los cromatogramas de la muestra y los patrones. Las variables que sedeben controlar cuidadosamente son la temperatura de la columna, la velocidad de flujo deleluyente y la velocidad de inyección de la muestra. Además, es necesario tener cuidado en evitarla sobrecarga de la columna. El efecto de la velocidad de inyección de la muestra esparticularmente crítico para los picos iniciales de un cromatograma. En estos casos, en que seutiliza una jeringa, los errores relativos van de 5 a 10%.Calibración con patrones Un método más directo para los análisis cromatográficos cuantitativos consiste en lapreparación de una serie de soluciones patrón cuya composición se aproxima a la del problema.Se realizan los cromatogramas para los patrones y se grafican las alturas de las áreas de los picosen función de la concentración. Una gráfica de estos datos debe proporcionar una línea recta quepasa a través del origen; los análisis se basan en esta gráfica. Para lograr la máxima precisión esnecesario repetir con frecuencia las calibraciones. Obtenido el cromatograma, se puede medir la altura o el área del pico cromatográfico:ALTURA. Cuando el pico es bien definido.AREA. Para lo cual se debe realizar los trazos que se indican en la figura, el área se determina con la fórmula: bh AREA 2Análisis basados en el área de los picos Las áreas de los picos son independientes de los ensanchamientos debidos a latemperatura, velocidad de inyección o de flujo. Por lo tanto, desde este punto de vista, las áreasde los picos constituyen un parámetro analítico mucho más satisfactorio que sus alturas. Por otraparte, la altura de los picos se mide con mucho más facilidad y en el caso de los picos estrechosse obtiene una mayor precisión. Muchos instrumentos cromatográficos modernos, están equipados con integradoreselectrónicos, que permiten una estimación precisa del área de los picos, con una desviaciónestándar de 0.44%.UNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Cromatografía.- Introducción Figura 4.2. Análisis cromatográfico cuantitativoProcedimiento de calibracióna) Calibración directa.- Se prepara patrones y obtiene los cromatogramas.Inconvenientes:1 La seguridad de la cantidad de muestra inyectada.2 La sensibilidad del detector, debe permanecer constante en cada prueba.b) Método del estándar interno (estandarización directa). Usado en análisis biomédico: etanol en sangre y esteroides en suero u orina. Se tiene que disponer de una norma o patrón interno; que debe cumplir con los requisitos: 1 tR cercano al componente de interés. 2 Resolución: R > 1.25; si R = 1, están separados. Si se cumple con tales, el análisis es muy útil. Figura 4.3. Procedimientos de calibración.UNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Cromatografía.- IntroducciónEjemplos:1) Determinar testosterona (T) en orina, usando androstano (A) como referencia interna o norma. Los datos aparecen en la siguiente tabla: Se gráfica la relación de área del componente a ser cuantificado al área de la norma Vs. la relación de peso del componente al peso de la norma. Así aparece en la figura 2.b. La relación de áreas de la alícuota de muestra a la norma, permite determinar una relación peso de muestra (pTx) a peso de norma; igual a 0.5 (pTx/pA) = 0.5 De allí, al utilizar los 50 g de norma se obtiene: pTx = 0.5 x 50 g = 25 g de Testosterona.2) Determinar Alcohol Etílico, con Detector de Ignición de Flama (FID) y usando como patrón interno la metiletilcetona. Se usa este compuesto porque nos se encuentra en bebidas alcohólicas y sale junto al etanol. No interesa el volumen, tampoco la fluctuación del detector.c) Normalización interna Se usa cuando se necesita información aproximada y se asume que todos los componentes han sido eluidos y que el porcentaje (%) de composición de un componente es: Area Pico % Area Total Figura 4.4. Método de Normalización internaUNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Cromatografía.- Introducción Se asume también que: % Area = % en peso En la práctica, la anterior es una ecuación muy útil. Además cada componente tiene una respuesta característica; primero se debe corregir mediante: Factor de corrección = (área/peso) Ejemplo: A la muestra desconocida se le añadió 5 mililitros de una solución conteniendo la norma cuya concentración es de 100 g/mL. Al cromatografiar la mezcla se encontró que la razón de área era 8, por lo tanto la razón de peso es 7; calcular la concentración del desconocido. (Peso componente/peso norma) = 7 (1) Peso norma = 5 mL x 100 g/mL = 500 g (2) Despejando de (1): Peso componente = 7 x peso norma Peso componente = 7 x 500 g = 3,500 g o 3.5 mg.UNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Cromatografía gas-líquido CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO En la cromatografía gaseosa los componentes de una muestra vaporizada se fraccionancomo consecuencia de la partición entre una fase móvil y una fase estacionaria mantenida en unacolumna. La cromatografía gas-sólido (CGS) representa una subclasificación en la que la fasefija es un sólido; el proceso de partición supone entonces equilibrios de adsorción gaseosa. En lacromatografía gas - líquido(CGL) la fase estacionaria es un líquido sostenido sobre una matrizsólida inerte; aquí son importantes los equilibrios gas-líquido.PRINCIPIOS DE LA CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO El concepto de cromatografía gas-líquido fue descrito en 1941 por Martin y Synge, aquienes se debe también la cromatografía de partición entre líquidos. El principio de la cromatografía de partición gas-líquido y líquido- líquido difieren sóloen el detalle de que la fase móvil de la primera es un gas, en vez de un líquido. La muestra seintroduce como un gas en la cabeza de la columna; los componentes que tienen una solubilidadfinita en la fase líquida estacionaria se distribuyen entre esta fase y la fase gaseosa, según la leydel equilibrio. Se logra entonces la elución forzando un gas inerte, como nitrógeno o helio através de la columna. La velocidad de los distintos componentes a lo largo de la columnadepende de su tendencia a disolverse en la fase líquida estacionaria. Un coeficiente dedistribución que favorezca al disolvente da por resultado una baja velocidad; por el contrario,aquellos componentes cuya solubilidad en la fase líquida es despreciable se desplazanrápidamente por la columna. Teóricamente, se obtienen curvas de elución en forma de campanade Gauss.APARATOS Existen diferentes cromatógrafos de gases de diferente grado de complejidad.Fuente de gas transportador Los gases transportadores deben ser químicamente inertes: helio, argón, nitrógeno ehidrógeno. El helio es el más utilizado. Las velocidades de flujo se controlan por medio de un regulador de presión. Laspresiones de entrada varían entre 0,7 a 3,5 Kg/cm2 (por encima de la presión ambiental), lo queda lugar a velocidades de flujo de 25 a 50 mL/min. Se pueden establecer las velocidades de flujopor medio de un rotámetro en la cabeza de la columna; pero es más preciso un medidor deburbujas.Sistema de inyección de la muestra La eficiencia de la columna requiere que la muestra sea de un tamaño adecuado y seintroduzca como un "tapón" de vapor; la inyección lenta o las muestras de excesivo tamañoproducen ensanchamiento de las bandas y empobrecen la resolución. Se utiliza una microjeringapara inyectar las muestras a través de un diafragma de caucho o de silicona dentro de unaentrada para muestras previamente calentada (50 C por encima del punto de ebullición delanalito), en la cabeza de la columna. En columnas analíticas comunes el volumen va de unaspocas décimas de L hasta 10 L. En las columnas capilares el volumen aproximadamente es10-3 L en este caso se utiliza un sistema divisor de la muestra, para liberar hacia la cabeza de lacolumna, sólo una pequeña fracción de la muestra es inyectada, el resto se desecha.UNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Cromatografía gas-líquido Las muestras de gas se introducen mejor por medio de una válvula de muestreo. Lasmuestras sólidas se introducen como soluciones.Columnas En este tipo de cromatografía se utilizan dos tipos de columnas:a) Capilares. Fabricadas de tubos capilares con diámetro interno entre 0,3 a 0,5 nm, cuya superficie interna está cubierta con una película muy delgada ( 1 m) de fase líquida. Presentan una caída de presión despreciable, por lo que pueden tener de 10 a 100 m o más; la relación VS/VM varía de 100 a 300, lo que explica en parte sus elevadas eficiencias. Se han descrito columnas de varios cientos de miles de platos teóricos. La capacidad para la muestra es baja (<0,01 L), lo que se puede aumentar recubriendo la superficie interior del tubo con un material poroso como el grafito, un óxido metálico o un silicato. Así se aumenta la superficie interna para soportar mayor cantidad de fase estacionaria (líquido); como también la capacidad de la columna.b) Empacadas. Se construyen de tubos metálicos o de vidrio de 1 a 8 mm de diámetro interno, diseñadas para sostener empaques sólidos desde 2 hasta 20 m de longitud. Los tubos están plegados o enrollados de modo que se puedan acomodar en forma adecuada dentro de un termostato del instrumento. Son comunes las columnas que poseen relaciones de VS/VM de 15 a 20 y contienen de 30 a 300 platos teóricos por decímetro. Las mejor empacadas poseen un total de 20000 platos teóricos o más. Soporte sólido para las columnas empacadas. El soporte sólido ideal consistiría en partículas esféricas, pequeñas y uniformes, con buena resistencia mecánica y un área superficial específica de por lo menos 1 m 2/g. Además, el material deberá ser inerte a temperaturas elevadas y humedecerse con facilidad con la fase líquida para producir un recubrimiento uniforme. Los soportes más comunes provienen de las tierras de infusorios. Existen dos tipos de materiales de esta clase, el polvo de ladrillo refractario, comercializado como Chromosorb P, C 22, Sterchamol; posee la mejor resistencia mecánica y la mayor superficie específica ( 4 m2/g); con la desventaja de ser muy reactivo lo que impide ser utilizado para compuestos polares. La tierra silícea (Kieselgur) es más frágil y con menor superficie específica ( 1 m2/g) pero es menos reactiva; se comercializa como Chromosorb W, Celite, Embasel y Celatom. Fase líquida. Las propiedades deseables para la fase líquida en una columna cromatográfica gas-líquido son 1) baja volatilidad: idealmente, su punto de ebullición debe ser por lo menos 200 superior a la temperatura máxima de operación para la columna; 2) estabilidad térmica; 3) inercia química y 4) características de disolvente de tal naturaleza que los valores de y k, para los solutos que han de resolverse, se encuentren dentro de límites apropiados.UNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Cromatografía gas-líquidoTermostatización de la columna. La temperatura de la columna es una variable importante por lo que para el trabajo deprecisión debe ser controlada dentro de las décimas de grado. Por tal motivo está dentro de unhorno termostatizado. La temperatura óptima de la columna depende del punto de ebullición dela muestra y del grado de separación requerido. En general, la resolución óptima se asocia con la temperatura mínima; pero estoincrementa el tiempo de elución y de término de un análisis.Sistema de detección Los aparatos de detección de un cromatógrafo gas -líquido deben responder rápida yreproduciblemente a las bajas concentraciones de los solutos emitidos por la columna. Dado quela concentración del soluto en el gas portador en cualquier instante es sólo unas pocas partes pormil, el detector debe responder a concentraciones uno o dos órdenes de magnitud menores (omás); además el paso de un pico por el detector puede durar un segundo o menos, el detectordebe en tal breve período responder adecuadamente. Conviene además que el detector tenga respuesta lineal, buena estabilidad en períodosprolongados y respuesta uniforme a una variedad de compuestos.Detectores de conductividad térmica.Catarómetro. Se basa en los cambios de conductividad térmica de la corriente de gas; el sensor consiste enun elemento calentado eléctricamente cuya temperatura, a una potencia eléctrica constante,depende de la conductividad térmica del gas circundante. El elemento calentado puede ser unhilo fino de platino, oro o tungsteno, o tambien, un termistor semiconductor. La resistencia delhilo o del termistor da una medida de la conductividad térmica del gas; a diferencia del detectorde hilo, el termistor tiene un coeficiente de temperatura negativo En los instrumentos para cromatografía se utilizan dos detectores gemelos uno delante(entrada) de la columna y otro detrás (salida); así sus resistencias incorporadas en un puente deWheatstone se comparan para eliminar la conductividad del gas portador y reducir al mínimo losefectos de la variación de la velocidad de flujo y la presión en la columna, así como de la energíaeléctrica. Las conductividades térmicas del hidrógeno y del helio son seis a diez veces mayores quelas de la mayoría de compuestos orgánicos. Así la presencia de pequeñas cantidades de talesmateriales reducen la conductividad térmica del gas efluente y el detector registra una elevaciónde la temperatura. Estos son sencillos, fuertes, baratos, no selectivos, precisos y no destruyen la muestra perono son tan sensibles comparados al detector de ionización de flama (DIF), o al detector decaptura de electrones (DCE).UNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Cromatografía gas-líquido AVANCES EN CG LA NOMENCLATURA EN CROMATOGRAFÍA DE GASES La cromatografía de gases se clasifica primero por el tipo de columnas que se emplean ydespués por las categorías de fases estacionarias. En la cromatografía de gases con columna empacada, la fase estacionaria de partículasempacadas dentro de una columna de acero inoxidable y de vidrio que generalmente tiene undiámetro interno (DI) de 2 a 4 mm. La fase estacionaria puede estar formada de diversosmateriales sólidos porosos –cromatografía gas-sólido (GSC, gas-solid chromatography)- yel retraso de los analitos se debe a un equilibrio que incluye adsorción sobre la superficie ydesorción de la misma. Otra alternativa es que las partículas de la fase estacionaria esténrecubiertas de algunos de los diversos líquidos de alto punto de ebullición –cromatografíagas-líquido (LGC, liquid-gas chromatography)- La separación de los analitos depende de lasdistintas fracciones de tiempo que pasen disueltos en la fase líquida estacionaria. Loscomponentes más solubles son retenidos mas tiempo ya que tardan menos viajando en el gasde arrastre. Los métodos de cromatografía de gases con columna empacada se emplean menos en laactualidad que la cromatografía de gases capilar. Las columnas capilares tienen diámetrosinternos (DI) de menos de 1 mm y las paredes internas de las columnas suelen estarrecubiertas con una película de fase estacionaria. Las columnas con DI de 530 μm se llamande megaporo; y las más pequeñas, con DI de 100 μm se llaman de microporo. La razón másevidente por la cual la cromatografía de gases capilar ha reemplazado a la cromatografía degeases en columna es porque la eficiencia cromatográfica característica de la primera es dehasta 200 000 platos teóricos en comparación con sólo 10 000 o menos para columnasempacadas. Como el número de platos teóricos se traduce a una mejor resolución, lascolumnas capilares permiten separar los componentes con más rapidez y correr más muestrasen el instrumento, o sea, aumentan la velocidad de proceso de la muestra. Las columnas capilares se clasifican, a su vez, dependiendo de la fase estacionaria conque están rellenas. Cuando la fase estacionaria es una película de material en la superficieinterna de la columna, se dice que es una columna tipo tubular abierta con recubrimientode paredes (WCOT, wall-coated open tubular). Para aumentar la capacidad de la columna,el área superficial se aumenta uniendo material de empaque a la pared. Actualmente, hay dosformas de llevar a cabo esto. La columna tubular abierta recubierta con soporte (SCOT,support-coated open tubular) tiene partículas de soporte en la pared. Asu vez, éstas estánrecubiertas de la fase líquida. La columna tubular abierta de capa porosa (PLOT, porous-layer open tubular) tiene una delgada capa de polímero poroso depositado sobre la superficieinterna. Las columnas WCOT y SCOT se emplean para cromatografía gas-líquido. Lascolumnas SCOT se emplean con más frecuencia que las WCOT por su mayor capacidad. Lascolumnas PLOT se emplean para cromatografía gas-sólido. La cromatografía de gases capilar es una de las técnicas de separación más poderosas queexisten actualmente para resolver los componentes de mezclas complicadas.Análisis de muestras La cromatografía de gases es el método de elección para separar y analizar compuestosorgánicos con puntos de ebullición inferiores a 250°C y los gases fijos; ambos grupos tienenpresión de vapor suficientemente altas de manera que pueden ser transportados por la fasemóvil gaseosa. Sin embargo, no es la presión de vapor baja lo que impide el uso de lacromatografía de gases, sino la descomposición. Cuando se separan materiales de alto puntoUNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Cromatografía gas-líquidode ebullición, los compuestos pueden descomponerse en la columna a las temperaturasnecesarias para obtener el cromatograma en un tiempo razonable. Por otra parte la descomposición térmica antes de la cromatografía puede ser de utilidad.En la CG con pirólisis, el analito se descompone deliberadamente a altas temperaturas y seefectúa la cromatografía de los productos de descomposición. Los picos que aparecen en elcromatograma de gas por pirólisis constituye una “huella digital” del analito. Es difícilrealizar análisis cuantitativos con CG por pirólisis, pero este método se emplea de manerarutinaria para comprobar lotes de materiales complejos como pinturas, fracciones pesadas depetróleo o plásticos. En el otro extremo de temperaturas, las columnas de CG pueden enfriarse para efectuarseparaciones de materiales de bajo punto de ebullición, como metano o H2. Se efectúa lacromatografía de gases de estos materiales en condiciones que van desde la temperaturaambiente hasta la del hielo seco, -80° C. También es posible realizar análisis cromatográficos de ciertos grupos de compuestostanto por CG como por CL. Algunos ejemplos son azúcares, ácidos grasos y aminoácidos.Como para realizar cromatografía de gases se requieren muestras volátiles es necesarioderivatizar este tipo de compuestos. Esto se lleva a cabo mediante una reacción con losgrupos químicos que ocasionan presión de vapor baja (punto de ebullición alto) para producircompuestos que se vaporicen más fácilmente. Un ejemplo sencillo de derivatización es latransformación de un ácido carboxílico en su éter metílico: por ejemplo, el ácido hexanoico,C5H11COOCH3 (p.eb. 127,3° C). También se emplea la derivatización haciendo reaccionarlos componentes para dar grupos químicos que producen respuestas fuertes en el detector delinstrumento. Un ejemplo es agregar cloros (como el grupo CCl 3) al emplear un detector decaptura de electrones que es altamente sensible a los halógenos. Tanto la CL como la CG se pueden emplear para separar productos orgánicos de puntode ebullición moderadamente alto (<200° C). Para compuestos con punto de ebulliciónsuperior a 200° C, es más probable que se elija la cromatografía de líquidos.Muestras e introducción de muestras Las muestras para cromatografía de gases pueden ser gases, líquidos o sólidos. Lasmuestras sólidas y líquidas deben vaporizarse de alguna forma. Cuando las muestras sólidasse vaporizan con facilidad se efectúa la cromatografía de los componentes moleculares. Sinembargo, si los sólidos se descomponen, sólo será posible analizar los productos dedescomposición para caracterizar la muestra. Para lograr mejores separaciones las muestras deben inyectarse en el menor tiempoposible. Un tiempo de inyección mayor provoca bandas más anchas al inicio de la separación.El tiempo de inyección para una muestra líquida o sólida también incluye todo el periodo quetarde la muestra en vaporizarse. El tiempo de vaporización se reduce inyectando las muestrasen una región que está más caliente que la columna, y lo suficientemente caliente paravaporizar las muestras líquidas con rapidez sin pirólisis. Esta región más caliente y las partesasociadas en la cabeza de la columna se llaman el inyector y la evaporación rápida de lamuestra se llama evaporación instantánea. La temperatura óptima para el inyector sedetermina experimentalmente, pero en general es igual o mayor que la temperatura máximaque la columna alcanza durante la separación. Usualmente las muestras se inyectan con unajeringa. El émbolo de ésta se empuja a mano (inyección manual) o empleando un impulsoreléctrico o neumático (inyección automática). La inyección automática suele ser más precisay permite desviaciones estándar relativas de tan sólo 0,1 por ciento. La mezcla se introduce con la jeringa al inyector, o bien otra alternativa es introducirlaUNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Cromatografía gas-líquidodirectamente a la parte superior de la columna (inyección directa en columna). La elecciónentre estos dos métodos a menudo depende del diámetro de la columna. Cualquiera de elloses eficaz para columnas empacadas, pero la introducción de la muestra es un procesodelicado en columnas capilares de menos de 1 mm de diámetro por dos motivos: primero, elcorte transversal abierto del capilar es muy pequeño y, segundo, la muestra debe ser pequeñapara no sobrecargar la fase estacionaria y provocar distorsión en la banda. Debe haberpresente suficiente fase estacionaria para interaccionar con todos los componentes de lamezcla de analitos a la vez. Para mantener la cantidad de muestra dentro del nivel correcto, se emplea un tipoespecial de inyector que reduce la cantidad de muestra que llega a la cabeza de la columnacapilar: el inyector divisor o sin división (split/splitless inyector). Las muestras conconcentración de analito adecuadamente baja se inyectan en el modo no divisor (splitless), yson transportadas a la columna por el gas de arrastre como en un inyector normal. Cuando seemplea el modo de división (split), el gas de arrastre fluye continuamente por la entrada arazón de 50 a 1000 veces la velocidad con la que fluye por la columna. El exceso de flujo sedeja escapar y sólo penetra una fracción de la muestra a la columna.Columnas La elección de diámetro, longitud y fase estacionaria dependen en un principio de que serealice cromatografía en columna o capilar. En la tabla 4.1 se mencionan algunas cifras demérito para columnas empacadas y columnas capilares. La elección de fase estacionaria parala mayor parte de las muestras se realiza basándose en información específica (por ejemplo,la polaridad) de cada tipo de fases estacionaria y en las condiciones específicas para diversostipos de muestras, que se encuentran en los catálogos de los fabricantes y en manuales.Tabla 4.1 Comparación de las características de una columna empacada típica y una columna capilar Empacada WCOT y SCOT PLOTDI de la columna 3 – 6 mm 0,10 – 0,53 mm 0,32 – 0,53 mmLongitud de la columna 1–3m 30 – 50 m 30 – 50 mDiámetro de partícula (dp) 120 – 185μm -- --Grosor del recubrimiento -- 0,1 – 0,5 μm 12 – 25 μmPlatos teóricos/m 1 000 – 5 000 1 000 – 8 000 1 000 – 8 000Número típico de platos teóricos 1 000 – 5 000 25 000 – 200 000 25 000 – 200 000totales (N)Capacidad total (μg/componente) 100 0,05 – 5 0,05 – 5Área superficial de la fase 0,2 10-6 – 10-7 10-6 – 10-7estacionaria (m2)Gasto volumétrico (mL/min) 20 – 100 0,5 – 5 5 – 10Gasto lineal (cm/s) 10 – 50 20 - 50 50 - 100 En CGL otro factor que se puede modificar es la cantidad de fase líquida presente. Así, elhecho de usar más fase líquida tiene un efecto doble: primero, la capacidad aumenta, demodo que se pueden usar cantidades de muestra más grandes. Una mayor cantidad demuestra conduce en general a mejor cuantificación, mejor límite de detección y mayorintervalo medible de las concentraciones de analito en la muestra. Sin embargo, a medida quese dispone de más fase estacionaria y los analitos pasan más tiempo disueltos en ella, eltiempo de retención aumenta, de modo que es necesario balancear la capacidad con el tiempode análisis. En columnas capilares, el diámetro de la columna y el espesor de la capa de faseestacionaria son críticos para determinar que tan bien se establece el equilibrio entre la faseestacionaria y la fase móvil y, por tanto, la calidad de la separación. La fase líquida de lascolumnas empacadas se mide por el porcentaje de carga, que es la medida en peso/peso defase estacionaria comparado con el peso total del empaque. La cantidad de fase estacionariaUNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Cromatografía gas-líquidodisponible también está en función del diámetro de las partículas. Los diámetros de laspartículas se expresan en términos de tamaño de malla del empaque. Este número define eltamaño de los huecos de mallas estándar que se emplean para filtración de polvos. A medidaque el número es más alto, hay más líneas en la malla y las partículas de empaque serán máspequeñas. Por ejemplo, las partículas de “malla 80/100” pueden atravesar la malla “80”, peroquedan atrapadas en la malla “100”, y tienen un diámetro aproximado de 150 a 175 μm.Temperatura La temperatura es crucial para las separaciones en cromatografía de gases, por lo cual esconveniente lograr un control de ±0,5° C. La temperatura afecta las posiciones de losequilibrios de distribución de los analitos entre el gas de arrastre móvil y la fase estacionariay así como la rapidez con que se establecen los equilibrios. Cuando se aumenta latemperatura de la columna se acelera la elusión y se alcanza más rápido el equilibrio entre lafase móvil y la estacionaria. La temperatura óptima se determina teniendo en cuenta laresolución necesaria y el deseo de reducir el tiempo de separación. Para lograr resultadosóptimos, la separación se verifica a temperatura constante (separación isotérmica) o conprogramación de aumento de temperatura. El aumento de temperatura en el curso de laseparación se llama gradiente de temperatura. En cromatografía de gases un gradiente deelución implica un gradiente de temperatura. El gradiente puede tener diversas formas. Hayrampas lineales de temperatura o se puede proceder por diversas rampas o mesetas. Esteaumento de temperatura permite analizar con puntos de ebullición y características muyvariables en periodos más breves. Observe que el gradiente de temperatura es una variaciónde temperatura con el tiempo, dT/dt; no es un gradiente de temperatura a lo largo de lacolumna. La temperatura más alta en el curso de la separación no sólo depende de ladescomposición de la muestra que se mencionó con anterioridad, sino que también hay quetener la estabilidad y la presión de vapor de las fases estacionarias líquidas. La faseestacionaria líquida en sí puede vaporizarse, descomponerse, o ambas cosas, y el materialserá expulsado de la columna. Esto se llama sangrado de la columna, lo cual constituye unadescripción gráfica. Para efectuar una separación específica, el extremo inferior del intervalode temperatura se determina por las propiedades de la fase estacionaria y los analitoscomponentes. En el caso extremo, a temperaturas excesivamente bajas, todos los compuestosinyectados se quedan simplemente en la entrada de la columna o en la parte superior de lafase estacionaria y dejan de desplazarse. A temperaturas un poco más altas, pero aundemasiado bajas el proceso de adsorción y deserción es lento y los picos se ensanchan.Gasto de la fase móvil En la tabla 4.1 se indican los gastos característicos de diversas columnas decromatografía de gases. Mientras que las columnas empacadas generalmente se operan congastos de décimas de mililitros por minuto (en algunos casos de hasta 200 mL/min), lascolumnas capilares normalmente operan con gastos desde menos de 1mL/min hasta un picode aproximadamente 5 mL/min. El incremento del gasto a menudo acelera la elusión sinejercer ningún efecto importante en la resolución.Detectores En cromatografía de gases se dispone de diversos detectores que indican los cambios enla composición del eluyente. En la tabla 4.2 se mencionan los más empleados, junto con unabreve sinopsis de sus cifras de mérito, que incluyen sus límites de detección y sus intervaloslineales. Inclusive en CGL capilar y con columnas de baja capacidad que requieren demuestras pequeñas, es posible efectuar determinaciones de ppm que requierencuantificaciones de 10-10 g de los componentes de muestras reales. Esta masa de 10 -10 g es laUNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Cromatografía gas-líquidoque se integra en toda la banda. En cualquier momento la cantidad presente en el transductores menor y el límite de detección se indica en g s -1 o en unidades más pequeñas, como pg s-1.Como es de imaginar, los detectores no son igualmente sensibles a todos los compuestos. Porejemplo, dos de los más comunes, el detector de ionización de llama y el de captura deelectrones, tienen selectividades bastante distintas. Otro detector menos complicado, el deconductividad térmica, responde a un número muy amplio de compuestos pero es el menossensible de los que se emplean en la actualidad. Al combinar el poder de separación cromatográfica con la capacidad de identificación dela espectrometría de infrarrojo o la espectrometría de masas se obtienen herramientaspoderosas para el análisis de muestras complicadas. Las respuestas del espectrómetro deinfrarrojo y del espectrómetro de masas son específicas para cada componente aunque seeluyan en una misma banda. Si el componente es un compuesto conocido es muy probableque los algoritmos de búsqueda de patrones ayuden a identificarlo y también se podráefectuar un análisis cuantitativo mediante técnicas de combinación o híbridas. Lascombinaciones son, respectivamente, cromatografía de gases con detección de infrarrojo contransformada de Fourier, que se abrevia CG/FTIR (Fourier-transform infrared detection), ycromatografía de gases con espectrometría de masas, que se abrevia CG/EM. Tabla 4.2 Propiedades de algunos detectores para cromatografía de gases Tipo Límite de Intervalo Comentarios detección lineal aproximado (g aproximado s-1)Conductividad 10 – 10-6 -5 103 – 104 Detector universal.térmica Mide cambios en la (DCT) conductividad del calor.Ionización de 10-12 106 – 107 Detector universal.llama Mide corrientes iónicas (DIF) de pirólisisCaptura de 10-14 102 – 103 Detector selectivo paraelectrones compuestos con átomos de (CE o DCE) afinidades electrónicas altas.Fotometría de 10-13 102 Detector selectivo parallama compuestos que contienen (DFF) S, P.Nitrógeno-fósforo 10-8 – 10-14 105 – 107 Selectivo para compuestos que contienen N, P.Fotoionización 10-8 – 10-12 105 Universal (con cierta (DFI) selectividad debida a la identidad del gas en la lámpara.Detector Hall 10-11 105 Detector específico para compuestos que contienen halógenos, S o N.Espectrómetro de 10-12 a Detector universal.masas (EM)Infrarrojo de 10-10 102 Moléculas polarestransformadas deFourier (IRTF)a. Variable y dependiente del tipo de espectrómetro de masas y también del tipo de compuestos que se analizan.UNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Resumen: Cromatografíab. RESUMEN: LA CROMATOGRAFIA Con el término cromatografía se engloba una serie de técnicas en las que loscomponentes de una muestra son transportados por una fase móvil (gas ó líquido), a través deuna fase estacionaria (líquida ó sólida) que los retiene selectivamente haciendo que eluyan atiempos distintos, permitiendo su detección individual. La cromatografía se puede clasificar en dos grandes ramas, según la fase móvil que seemplee, sub-dividiéndose éstas a su vez de acuerdo al medio en que se realiza la separación. Unaclasificación general de los distintos tipos se muestra en el siguiente cuadro: El campo de la aplicación de cada tipo de cromatografía está fijado por suscaracterísticas principales, debiendo compatibilizarse estas con las de los compuestos a analizar,para determinar cuál es la técnica más adecuada a emplear en el análisis. Esto origina que pese a ser técnicas parecidas, sean útiles en la solución de problemasdistintos, convirtiéndose más bien en técnicas complementarias. Así, mientras que porCromatografía de gases (CG) analizamos compuestos volátiles, con la cromatografía líquidaseparamos aquellos compuestos polares y no polares de baja volatilidad. El advenimiento de la cromatografía líquida de alta performance ó HPLC, por sus siglasen inglés, basada en el empleo de columnas de pequeño diámetro rellenas con micropartículas yde altas presiones para el flujo de solventes; amplía enormemente los campos de aplicación deesta técnica analítica. Como una primera orientación presentamos una comparación de los dos gruposprincipales de las técnicas cromatográficas, en función de las principales características de lamuestra que tienen un carácter limitante para el uso de cada una de estas técnicasUNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca
  • Instrumentación y Análisis Resumen: Cromatografía Tabla. Comparación de CG con HPLC CG HPLC. Volatilidad de la muestra. . Solubilidad de la muestra.. Es crítica la estabilidad molecular de . No es crítica la estabilidad de la la muestra. muestra molecular, por no usarse - Por proceso térmico. altas temperaturas. - Contra catalizadores.. Sólo para compuestos de peso molecular . No hay limitación en el peso menor a 500. molecular de los compuestos.. No se recupera la muestra generalmente. . Fácil recuperación de la muestra. De aquí podemos concluir que la cromatografía de gases es la vía más adecuada cuandose desea analizar compuestos volátiles, siempre que sean estables térmicamente; mientras que sise trata de compuestos polares, la cromatografía líquida nos brinda una mejor solución, al no sersu baja volatilidad un factor limitante. Estas diferencias y limitaciones se relacionan con las diferentes variables que controlanel proceso en cada uno de los instrumentos empleados por estas técnicas. Cada tipo decromatógrafo es gobernado por un conjunto diferente de variables, esto se comprueba fácilmenteal comparar esquemáticamente las partes principales que debe tener un sistema CG y el HPLC. En un primer análisis encontramos que en el cromatógrafo de gases será necesariocontrolar la presión y temperatura del gas de arrastre; mientras que en el de líquidos se deberácontrolar la composición y flujo del solvente.UNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca