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Proyecto tesis doctoral_epg_unt

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Investigación experimental que busca información sobre el efecto coadyuvante de las saponinas de Sapindus saponaria L. para antígenos de Leishmania braziliensis

Investigación experimental que busca información sobre el efecto coadyuvante de las saponinas de Sapindus saponaria L. para antígenos de Leishmania braziliensis

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  • 1. “Efecto adyuvante de vacunas de lassaponinas de Sapindus saponaria L. enmúsculo estriado de Rattus rattus varalbinus”PROYECTO DE TESIS DEDOCTORADOCIENCIAS BIOMEDICASAUTORM.Sc. Segundo Manuel Miranda LeyvaASESORDr. Ramón Piminchumo CarranzaEscuela de PostGrado/UNTTRUJILLO – 2007
  • 2. Sapindus saponaria L.
  • 3. Sapogenina(L-Hederina)
  • 4. ANTECEDENTES YFUNDAMENTACION DEL TRABAJO Se ha investigado científicamente lassustancias presentes tanto en plantas(Fitoquímica) como animales(Zooquímica)1. Las saponinas, se hanutilizado por sus propiedadesdetergentes2. Las saponinas desaponaria o jabonera, son agenteslimpiadores de la contaminación porvertidos tóxicos y poseen virtudeshemostáticas3. De Sapindussaponaria se ha aislado la SaponinaL-Hederina4.
  • 5. ANTECEDENTES YFUNDAMENTACION DEL TRABAJO En Perú, de Sapindussaponaria L., desdeépocas precolombinas seha utilizado el pericarpiodel fruto maduro por sualto contenido desaponinas5.
  • 6. ANTECEDENTES YFUNDAMENTACION DEL TRABAJO La Asociación Argentina de QuímicosCosméticos6 reporta la actividadantihialuronidasa de las saponinas deSapindus saponaria L. y la eficacia enel tratamiento cosmético de lalipoesclerosis. En Colombia; se hareportado que saponinas de Ruscus,estimularían el metabolismo celular,la multiplicación celular y microcirculación cutánea7.
  • 7. ANTECEDENTES YFUNDAMENTACION DEL TRABAJO En Santiago de Cuba, reportan lautilidad de las saponinas comoadyuvantes inmunológicos en elcampo de la salud veterinaria8. En LaHabana, han reportado la actividad invitro frente a L. infantum de lassaponinas hederacolchisida A y α y β-Hederina, y que Yuccasaponina MC3,inhibe al 100% el crecimiento depromastigotes de Leishmaniamexicana amazonensis9.
  • 8. ANTECEDENTES YFUNDAMENTACION DEL TRABAJO En Chile, se ha anunciado lacreación de una industria para laextracción y comercialización desaponinas, para refinación delcobre10. El Tratado de LibreComercio (TLC) Perú-USA11,incluiría saponinas con arancelbase 4 y canasta 4. El TPDColombia-USA12, también incluyesaponinas.
  • 9. INVESTIGACIONES PREVIASDEL AUTOR EN EL TEMA En 2005, con el proyecto "Saponinasde Sapindus saponaria L.: Extracciónpor fraccionamiento de espuma ysecado por radiación infrarroja".Concluimos que 1) La velocidad deburbujeo no influye en la pureza delas saponinas, 2) La altura decolumna de fraccionamiento influyeen la pureza de las saponinas, y 3) Nofue posible secar la espuma conradiación infrarroja en lascondiciones experimentales.
  • 10. INVESTIGACIONES PREVIASDEL AUTOR EN EL TEMA En 2006, con el proyecto "Efecto del grado devacío en la operación de evaporación a 40 °Cpara concentrar el producto delfraccionamiento de espuma de las saponinasde Sapindus saponaria", concluimos que 1)Es posible concentrar los extractos desaponinas de Sapindus saponaria L.“Choloque” mediante evaporación al vacío, y2) Por cada 180 mm de Hg de reducción depresión se puede obtener concentradosestadísticamente diferenciados con un 95%de seguridad.
  • 11. JUSTIFICACION YPLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA En nuestros laboratorios se hautilizado la cáscara del frutomaduro, para desarrollar unatecnología de obtención de unextracto concentrado desaponinas, para aplicacionescientífico-tecnológicas que afuturo demanden la producciónindustrial y la industrializacióndel producto.
  • 12. JUSTIFICACION YPLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Continuando las investigaciones del Centrode Investigaciones de Energía Solar enSantiago de Cuba, sobre ADYUVANTESINMUNOLÓGICOS8 y su búsqueda de nuevassustancias con actividadadyuvante/inmunopotenciadora en el marcode la investigación inmunológica actual y conla finalidad de proponer como fuente desustancias con propiedadesinmunoestimulantes a Sapindus saponaria L.”Choloque” es necesario explicarcientíficamente el mecanismo de la actividadde las saponinas de esta especie vegetal. Losresultados permitirán un mejor enfoquecientífico, tecnológico y ecológico depromoción de su cultivo.
  • 13. JUSTIFICACION YPLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Adyuvante es una sustancia distintade un antígeno que potencia laactivación de los linfocitos T alfavorecer la acumulación y activaciónde otros leucocitos, denominadoscélulas accesorias, en el lugar deexposición al antígeno. En las célulasaccesorias, los adyuvantes aumentanla expresión de coestimulantes ycitocinas que activan a los linfocitos Ty pueden prolongar también laexpresión de complejos péptido-CPHen la superficie de las CPA13.
  • 14. Problema científico ¿Cuál es el Efecto de lassaponinas de Sapindussaponaria L. en músculoestriado de Rattus rattus varalbinus?
  • 15. HIPOTESIS DEL TRABAJO “Las saponinas de Sapindussaponaria L. actuando comoadyuvantes en el tejido estriadode Rattus rattus var albinus,favorecen la acumulación yactivación de células accesoriasen la zona de depósito”.
  • 16. Objetivo generalDeterminar el efectoadyuvante de lassaponinas de Sapindussaponaria L. en tejidoestriado de Rattus rattusvar albinus.
  • 17. Objetivos específicosEnsayar la respuesta coadyuvante delas saponinas de Sapindus saponariaL. a tres concentraciones diferentesen solución salina fisiológica enmúsculo estriado de Rattus rattus varalbinus.Realizar el análisis histoquímico, esdecir cuantificar los IL y CD.Determinar estadísticamente lasignificancia de los resultadosobtenidos.
  • 18. Relevancia técnica ysocioeconómica del temapropuestoEn la preparación del extracto se aplica unatecnología desarrollada en nuestroslaboratorios, adecuada a nuestra realidad ypor tanto fácil de aplicar a nivel de plantapiloto con un mínimo de inversión.Sapindus saponaria L. puede convertirse enuna planta agroindustrial y de reforestaciónde nuestros valles costeños, incluidas laszonas urbanas, por su follaje perenne yabundante; sus frutos y semillas puedentener aplicación industrial, incluida la químicafarmacéutica. Existen otras líneas deinvestigación potencial, aún por iniciar.
  • 19. Diseño de investigación Material de estudioConcentrado de saponinas deSapindus saponaria L.preparado en el laboratorio deAnálisis Instrumental; soluciónsalina fisiológica; Rattus rattusvar albinus, tres grupos testigoy tres grupos ensayo. Cadagrupo estará constituido por 10especimenes cada uno.
  • 20. Diseño experimental:Diseño clásicoDos grupos de Rattus rattusvar albinus testigo yexperimental, serán inyectadoscon solución salina fisiológicay solución de saponinas (tresconcentraciones diferentes) ensolución salina fisiológica,respectivamente. Se realizaránlas observaciones antes ydespués de la inyección.
  • 21. Extracción y concentración desaponinasSe preparará un extractoacuoso concentrado desaponinas de la cáscaradel fruto seco deSapindus saponaria L.
  • 22. Muestra para extracción
  • 23. Fraccionamiento y concentración
  • 24. Ensayo inflamatorio1. Inyección intramuscular Se depilará el área de inyección de cadaespécimen. Se inyectará a cada espécimen lasolución experimental correspondiente(según grupo y dosis) y se observará laaparición de signos en el área:inflamación, color, calor. Se documentará esta etapa mediantefotografías. Para esto se colocará juntoal animal una regla para llevar la cuentade la dimensión del área.
  • 25. Zona depilada para inyectar
  • 26. Ensayo inflamatorio2. Biopsia del tejido de la zona de depósito Se tomará una muestra de tejido y seobservará en una lámina la infiltración (sila hubiera). Se hará un conteo de células,especialmente neutrófilos. Se compararácon una muestra patrón (con inyecciónde solución salina fisiológica). Si el animal es sacrificado, se observarála zona de depósito.
  • 27. Ensayo inflamatorio3. Pruebas histoquímicas Se tomará una muestra y se observarálas respuestas histoquímicas, secuantificará los IL y CD.4. Comparación con un coadyuvante patrón Se inyectará coadyuvantes patrones13, 14:Hidróxido de aluminio, fosfato dealuminio, fosfato cálcico, BCG. Se documentará todas las evidencias quepermitan realizar la comparación. Si se no se dan los signos del paso 1 secontinuará directamente con el 3.
  • 28. Análisis estadístico Se realizará el ANOVA15 con lasprueba de MSD y Dunnett paradeterminar si existe o no diferenciasignificativa entre las respuestasgrupo experimental y testigo,mediante el software16 SPSS v 10.
  • 29. Resultados esperados El análisis de datospermitirá concluir si lassaponinas de Sapindussaponaria L. tienen efectocoadyuvante de vacunas enmúsculo estriado de Rattusrattus var albinus .
  • 30. Impacto o beneficios esperados Ante la resistencia al uso decoadyuvantes como el mercurio,hay una gran potencialidadaplicativa del extracto concentradode saponinas de Sapindussaponaria L.; todo esto enmarcadoen una alternativa de desarrollo deuna tecnología propia que permitaexplotar nuestros recursosnaturales respetando el medioambiente.
  • 31. Infraestructura y medios físicosa utilizar Laboratorios: Laboratorio de Química Física yLaboratorio de Análisis Instrumental dela Sección de Química eInstrumentación, Departamento deBioquímica Laboratorio de Toxicología,Departamento de Farmacología. Equipos de laboratorio: Columna de fraccionamiento de espuma Equipo de destilación al vacío Espectrofotómetro UV/Vis HP 8452A Microscopio óptico binocular
  • 32. Tipo de investigación De acuerdo al fin que sepersigue: Aplicada De acuerdo al diseño deinvestigación: Explicativa
  • 33. Localización Localidad: Trujillo Institución: UniversidadNacional de Trujillo
  • 34. Referencias bibliográficas1. Martínez, A. Manual de Farmacognosia y Fotoquímica.Facultad de Química Farmacéutica, Universidad deAntioquia, Medellín (Colombia) 1997. [En línea].<http://huitoto.udea.edu.co/~farmacogfit>.2. Evans, W. Trease-Evans, Farmacognosis. 13ª ed. Ed.Nueva Editorial Interamericana, S.A. de C.V. MéxicoD.F. (México). 1989. pp 519-520.3. [En línea].<http://www.revik.com/cosmetologia/enciclopedia.htm>4. [En línea].<http://fbio.uh.cu/webfv/articulos/metabolismo%20secundario.doc>5. Almenara, O. Físico-Químca. Ed. Empresa EditorialHumbolt, S.A. Lima (Perú). 1984. pp. 192-194.6. [En línea].<http://www.abc-cosmetologia.org.br/biblioteca/descr_revistas.php?id=942>
  • 35. Referencias bibliográficas7. [Em línea].http://www.sic.gov.co/propiedad/Estudios/vigilancia/Vigilancia_Cremas.php8. Morris, H. J.; Martínez, Cl, Abdala, R. T.; Campos, D. Adyuvantesinmunológicos. [En línea].<http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0864-03001999000200010&script=sci_arttext>9. [En línea].http://bvs.sld.cu/revistas/far/vol36_s_02/F%20Producciones%20Plantas%20y%20Prod.%20Natya.pdf10. [En línea]. http://www.puc.cl/autoridades/rector/discurso02.PDF11. [En línea].http://www.tlcperuusa.com/uploads/Oferta%20de%20Peru%20a%20EEUU%20con%20formato%205.pdf12. [En línea]<http://www.sice.oas.org/TPD/AND_USA/COL_USA/Draft_text_050806_s/Lista%20de%20Desgravacion%20de%20Colombia%20(industria%20y%20textiles)%20con%20Categorias.pdf>
  • 36. Referencias bibliográficas13. Abbas A; Andrew H. Lichtman. Inmunologíacelular y molecular. 5ª ed. Ed. Elsevier EspañaS.A. Madrid: 2004. 363-365, 477.14. [En línea] .http://www.aeped.es/vacunas/pav/modulo1/PDFs/Vacunas2.pdf15. Walpole, RE., Raymond H. Myers y SharonL. Myers. Probabilidad y Estadística paraIngenieros. Ed. Prentice - HallHispanoamericana, S.A. México: 1999. 483.16. Pérez, C. Técnicas Estadísticas con SPSS. Ed.Pearson Educación, S.A. Madrid: 2001. 370 –372.
  • 37. Por una tecnología propiay ecológica A ustedesMuchas gracias