• Save
les proteines seriques
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×
 

les proteines seriques

on

  • 9,195 views

biochimie des proteines seriques s'articulent sur les protéines de la coagulation

biochimie des proteines seriques s'articulent sur les protéines de la coagulation
copie pdf disponible (avec d'autres cours et d'autres eBooks) sur www.medweb.eb2a.com

Statistics

Views

Total Views
9,195
Views on SlideShare
9,195
Embed Views
0

Actions

Likes
0
Downloads
0
Comments
0

0 Embeds 0

No embeds

Accessibility

Categories

Upload Details

Uploaded via as Adobe PDF

Usage Rights

© All Rights Reserved

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Processing…
Post Comment
Edit your comment

les proteines seriques les proteines seriques Presentation Transcript

  • 1) LES PROTEINES SERIQUES• A) Les protéines de la coagulation et de la fibrinolyse• B) Dosage des protéines totales dans le sérum.• C) Propriétés générales des protéines du sérum.• D) Méthodes d’analyse des protéines du sérum.• E) Classification des protéines du sérum.• F) Etude de quelques protéines importantes du sérum 1
  • A) Les protéines de la coagulation et de la fibrinolyse• - Différence plasma- sérum: fibrinogène• - La coagulation du sang in vivo et in vitro• - Voie extrinsèque et intrinsèque 2
  • L’hémostase est l’arrêt de l’écoulement du sang.-L’hémostase spontanée est un phénomènephysiologique due à la coagulation du sang - L’hémostase provoquée est obtenueartificiellement pour arrêter les hémorragies d’origine traumatique ou chirurgicale: compression, pince, électrocoagulation, ligature du vaisseau. 3
  • • Le sang qu’il soit artériel ou veineux comprend des éléments figurés(globules rouges et blancs, plaquettes) et un milieu liquide aqueux qui contient de nombreuses molécules en solution qui s’appelle le plasma.• A l’état normal le sang circule librement dans les vaisseaux.• Dans certaines circonstances pathologiques (thromboses) le sang peut se coaguler cad qu’il y a formation d’un thrombus (gr.thrombos:caillot) solide qui résulte de la transformation d’un liquide, le plasma en un gel. Cette gélification est due à la transformation d’une protéine plasmatique soluble, le fibrinogène, en une protéine insoluble, la fibrine.• Si cette coagulation est réalisée dans un tube, in vitro, le liquide résultant s’appelle le sérum. Le plasma et le sérum possèdent une composition identique à l’exception du fibrinogène.• L’hémostase nécessite aussi une rapide constriction du vaisseau lésé et l’agrégation des plaquettes sur la paroi des cellules endothéliales;pour former un caillot à la 4 surface traumatisée du vaisseau sanguin.
  • La coagulation in vivo et in vitro, voie extrinsèque et voie intrinsèque• En 1863 Joseph Lister montra que le sang reste fluide dans la veine jugulaire excisé d’un bœuf mais qu’il coagule rapidement s’il transvasé dans un récipient en verre(voie intrinsèque). La coagulation peut être déclenchée par des substances normalement absentes du sang comme des extraits tissulaires(voie extrinsèque) 5
  • Les 3 étapes de la coagulation• - Initiation• - Activation• - Fibrinoformation 6
  • Voie intrinsèque pour l’activation du facteur Xen Xa. HMK est le Kininogène de HMM.Lasurface activante est le collagène in vivo et leverre ou le kaolin in vitro 7
  • A.1 Les protéines de la coagulation A.1.1 Classification d’après leur ordre de découverte• FI- Fibrinogène• FII - Prothrombine• FIII - facteur tissulaire.• FIV - (Calcium).• FV - Proaccélérine.• FVII - Proconvertine.• FVIII - Facteur anti hémophilique A.• FIX - Facteur anti hémophilique B.• FX - Facteur de Stuart-Prower.• FXI – Précurseur du facteur antihemophilique B (PTA, Plasma Thromboplastine Antecedent)• FXII- Facteur de Hageman.• FXIII – Facteur stabilisant de la fibrine: transglutaminase. 8
  • F:Facteur inactif Fa facteur actif• F.II Prothrombine F.IIa Thrombine• F.X F.Stuart F.Xa 9
  • A.1.2 Classification d’après leur rôles• A) Fibrinogène, protéine de structure.• B) Enzymes inactifs ou zymogènes ou proenzymes qui après activation vont être des enzymes actifs:• 1- Enzymes du groupe des protéase à sérine car le site actif de ces enzymes contient un résidu de sérine• 2 - Transglutaminase• 3 – cofacteurs V et VII• 4 – Protéines modulant la coagulation: protéine C,S 10
  • A.1.3 Exemple d’activation d’un proenzyme inactif, la prothrombine en enzyme actif, la thrombine. Rôle important de la vitamine K et du calcium• Structure: protéine formée d’une chaîne polypeptidique de 582 acides aminés, 66kDa.• Biosynthèse: hépatocytes. Nécessite la présence de Vitamine K (allemand, Koagulation) pour pouvoir subir une modification post traductionnelle( carboxylation de certains résidus de GLU, Glutamate en GLA, Gammacarboxyglutamate) et être activé par le calcium. Ces résidus GLA sont concentrés dans la région N-terminale:10 résidus GLA de l’AA 1 à 33.• Transformation de prothrombine en thrombine nécessite la présence des résidus GLA pour fixer le Ca2+ et induit un changement de conformation pour subir la protéolyse limitée sous l’action du facteur X.a cad coupure de la molécule au niveau de 2 liaisons Arg-Thr 274-275 et Arg-Ile 323-324.• Le clivage Arg-Thr libère un fragment inactif formé par l’extrémité N- terminale(AA 1-274) qui contient tous les résidus de gamma carboxyglutamate.• Le clivage Arg-Ile donne la thrombine active formée de 2 chaînes A et B (308 AA, 32kDa)unies par un pont disulfure. Le changement de conformation de la molécule libère le site actif sérine de l’enzyme. 11
  • L’activation de la prothrombine s’effectue sur les plaquettes et requiert:- Un phospholipide anionique de la membrane plaquettaire qui lie le Ca2+ et la prothrombine - le récepteur du facteur Va qui se lie au facteur Xa, lequel se fixe à la prothrombine. ( La thrombine est libérée de la membrane plaquettaire et va pouvoir agir sur le fibrinogène). Le facteur X est aussi une sérine protéase qui contient des résidus Gla responsables via le Ca2+ de sa fixation aux P.lipides anioniques de la membrane plaquettaire 12
  • A) Asymétrie normale des Plipides, PC,SM à l’extérieur, PS,PE à l’intérieurB) Surface procoagulante due à une asymétrie anormale de la paroi des plaquettes, PS,PE à l’extérieur qui permet la fixation des facteurs Va,Xa et II qui s’active en IIa 13
  • 14
  • A.1.4 Le fibrinogène et la fibrinoformation.• Structure: hexamère formée par l’association de 2 fois 3 chaînes polypeptidiques α,β, et γ soit α2,β2,γ2 de masse moléculaire 340kDa. Les 3 chaînes sont réunies par de nombreux ponts disulfures (28) intra-chaînes ou inter-chaînes. Elles forment une triple hélice à la manière du collagène. On note le fibrinogène par la formule (Aα,Bβ,γ)2 car lors de sa transformation en fibrine il perdra 2 fibrinopeptides A et B et la fibrine sera (α,β,γ)2 . C’est une protéine fibrillaire, d’où son nom, de forme aplatie elliptique qui mesure 45 nm et dont la structure au microscope électronique est linéaire avec 2 nodules terminaux D et un nodule central E.• Biosynthèse: hépatocytes. Les chaînes α,β, et γ sont synthétisées individuellement mais de façon concertée puis elles sont assemblées en trimères Aα,Bβ,γ puis en hexamères (Aα,Bβ,γ)2 . Les chaînes α,β, et γ comme la molécule de collagène, subissent des modifications post traductionnelles: Hydroxylation de certains résidus de proline en hydroxyproline qui rendent la molécule plus hydrophile et phosphorylation de résidus de sérine qui génèrent des charges négatives.• Génétique: le gène est localisé sur le chr. 4 en q31. Les gènes codant pour les 3 chaînes α,β, et γ (A,B et G) sont contigus er s’expriment conjointement. 15
  • FibrinogèneSchéma d’une molécule de fibrinogène en M.E avec un nodule central E correspondant aux 2 extrémités N-terminales de la super hélice αβγ et 2 nodules latéraux D correspondant aux 2 extrémités C-terminalesde forme globulaire réunis par 2 bâtonnets (analogie avec le collagène) D E D 16
  • 17
  • • Propriétés: c’est une protéine soluble dans l’eau. C’est le plus abondant des facteurs de la coagulation. Sa concentration normale dans le plasma est de l’ordre de 2,5g/l (1,50-3,50g/l). Sa teneur augment au cours des états inflammatoires.• La fibrinoformation: elle résulte de l’action de la thrombine et s’effectue en 3 étapes• A) Protéolyse limitée(hydrolyse spécifique par la thrombine des liaisons Gly- Arg qui se trouvent au niveau des extrémités N-terminales des 2 chaînes Aα et Bβ) qui va libérer 4 fibrinopeptides (2A et 2B) de 18 et 20 acides aminés et une molécule légèrement plus courte de 3%, la fibrine.• B) Cette coupure modifie la charge de la molécule qui va spontanément se polymériser sous forme de filaments disposés en réticule et devenir insoluble dans l’eau et former un gel qui enserre les éléments figurés. Ces polymères, liées seulement par des liaisons non covalentes de type pont hydrogène sont instables.• C) la formation de liaisons covalentes solides entre les polymères de fibrine se produit sous l’action d’une enzyme dite facteur stabilisant de la fibrine ou facteur XIIIa ou transglutaminase. Cette enzyme, F.XIII est activée en FXIIIa comme la prothrombine, par la thrombine et le Ca2+. Elle est due à la formation de liaisons pseudopeptidiques entre la fonction γ-CO- NH2 de certains résidus de Gln d’une chaîne avec la fonction ε-aminé de certains résidus de Lys appartenant à une autre chaîne. Elle correspond au phénomène de la rétraction du caillot qui laisse sourdre un liquide citrin, le sérum.• Contrôle de la fibrinoformation in vivo: inhibiteur de la thrombine ou anti- thrombine (ATIII)et maintien de la thrombine à l’état inactif de prothrombine. 18
  • Disposition proposée pour les monomères de fibrine; disposition semi-alternée donnant la période observée de 230 Angstroms ou 23nm soit la moitié de la molécule de fibrinogène de 46nm. 19
  • Représentation schématique du fibrinogène, de sa structure, de ses extrémités chargées et des sites declivage par la thrombine des 4 liaisons peptidiques Arg-Gly 20
  • Pontage des monomères de fibrine par la transglutaminase, F.XIIIa 21
  • A.2 Les protéines de la fibrinolyse• C’est la transformation de la fibrine insoluble dans l’eau en petits fragments solubles dans l’eau ou PDF, Produits de la Dégradation de la Fibrine, sous l’action d’une protéase à sérine, la plasmine. A l’état normal elle existe sous une forme inactive, le plasminogène de masse 90kDa. Elle est activée en plasmine sous l’action d’activateurs cellulaires. L’activation se réalise par protéolyse limitée et spécifique d’une liaison peptidique Arg-Val et conduit à la plasmine formée de 2 chaînes A et B réunies,par un pont S-S. Le contrôle de la fibrinolyse est assurée par une α2-globuline plasmatique, l’antiplasmine. 22
  • La formation de D.dimères peut être considéré comme un marqueur de la fibrinolyse. Mais seul des taux normaux de D.dimères sont utiliséscomme exclusion de thromboses pas leur diminution. Ilssont augmentés dans la R.I car la fibrine et le fibrinogène sont élevées. 23
  • Examens desang destinés à étudier la Fibrinolyse aulabo d’Hémato, Hôpital de la Timone à Marseille 24
  • A.3 Les Kallikréines, KLK• Elles représentent un groupe d’enzymes protéolytiques de spécificité « sérine protéases »que l’on trouve dans les tissus et les liquides biologiques. Ce terme a été introduit en 1930 par Werle et al. qui ont mis en évidence une forte activité enzymatiques dans les extraits de pancréas, en grec « kallikreas ».• On les divise en 2 grandes catégories: Les KLK tissulaires et plasmatiques qui diffèrent par leur masse moléculaire, la spécificité du substrat et la nature du produit libéré, la structure du gène 25
  • Kininogène Kinine, peptide bioactif• A) la kallikrèine plasmatique (KLKB1)• - agit sur un précurseur de haut poids moléculaire (HPM) produit par le foie et libère un nonapeptide très actif, la bradykinine• - est sécrétée exclusivement par le foie• - participe au processus de coagulation du sang(voie intrinsèque) et à la fibrinolyse et par la libération de bradykinine elle participe à la régulation du tonus vasculaire et à la réaction inflammatoire.• - sa synthèse est codée par 1 seul gène en 4q35 26
  • • B) les Kallikréines tissulaires appartiennent à une large famille multigénique(15) localisée sur la même région chromosomique en 19q13.4 et de structure protéique voisine.• - gène KLK1 human Kallicréine hK1, dans les reins et le pancréas qui agit sur un kininogène de bas poids moléculaire(BPM) pour donner un décapeptide la Lys-bradykinine ou kallidine(vasodilatateur, contraction des muscles lisses et douleur produite par les autacoides).• - gène KLK2 hK2 exprimé par la prostate et les poumons agit sur prohK3 pour donner hK3(237 AA) ou PSA, prostatic specific antigen. hK3 clive les semenogélines et la fibronectine et participe à la liquéfaction du liquide séminal qui augmente la motilité des spermatozoïdes. 27
  • • - gène KLK3 hK3 exprimé par la prostate(hK3>hK2) et les poumons.• Intérêt de doser hK2 et hK3 dans le sérum pour le diagnostic, le suivi(pronostic) et le screening des populations pour le cancer de la prostate et des poumons. 28
  • 29
  • A.4 - Nature et mode d’action des anticoagulants utilisés in vitro et in vivo• A.4.1- Les complexants du calcium• - Citrates• - EtylèneDiamineTétraAcétate: EDTA• - Fluorures• - Oxalates• A.4.2 – Héparine• A.4.3 - Hirudine• A.4.4 - Argatroban 30
  • Calcium et coagulation• Le Ca2+ libre est indispensable à la coagulation. Dans le sang circulant la calcémie, voisine de 2,2mM, correspond au calcium total. La majorité du calcium est lié à diverses molécules minérales et organiques(ligands:L) telles que la sérum albumine.• Ca2+ + L Ca2+-L Libre Lié• Cet équilibre dépend de la nature du ligand et de son affinité caractérisée par une constante d’équilibre d’Affinité KA ou de Dissociation KD 31
  • A.4.1 Les complexants du Ca2+• Ils ne sont utilisés qu’in vitro et permettent de réaliser divers examens biologiques sur le plasma et les éléments figurés:• Dosage du fibrinogène dans le plasma.• Détermination de la Vitesse de Sédimentation des hématies, VS et de l’Hématocrite,Ht.• Isolement et étude du métabolisme des globules rouges, des globules blancs et des plaquettes. 32
  • • Ils possèdent tous des charges négatives qui vont neutraliser les charges positives du Ca2+, généralement des carboxyles ionisés pour les molécules organiques:• EDTA Ethylène Diamine Tétra Acétate• Citrate• Oxalate• Simple charge négative pour le Fluorure 33
  • A.4.2 L’Héparine• Découverte en 1916 par MacLean. Elle est utilisable à la fois in vitro et in vivo à visée thérapeutique: elle est utilisée par voie sous- cutanée et/ou IV.• C’est un polysaccharide acide ou glycosaminoglycane (répétition de 15 à 100 unités monosaccharide de sucre aminé(D. glucosamine avec SO3-) et d’acide L.iduronique( COO- et SO3-) extrait des mastocytes de tissus animaux en contact avec l’environnement: poumons, peau et intestin. Masse environ 20kDa. Actuellement Héparine de Bas Poids Moléculaire, HBPM, environ 5kDa qui possède une durée d’action plus longue.;• L’activité est donnée en UI par comparaison avec une préparation de référence• , Il agit en inhibant la thrombine par union à l’AT (liaisons + -, mole/mole) qui favorise la formation du complexe ternaire T-AT-H inactif (KD 10-5 M KD 10-8M).• Antidote de l’héparine: protamine, protéine basique, extraite de la semence de saumon, l’équivalent des histones. 34
  • 1967 héparinate de Ca voie SC1983 synthése du pentapeptide de liaison à l’AT 35
  • A.4.3 Hirudine: protéine extraite de la salive de la sangsue, hirudoofficinalis. Protéine de 65AA, 3 régions:N-ter, central et C-ter qui possèdede nombreuses charges négatives(AA53-65) qui se fixe à la thrombine et l’inhibe:Ki 10-12. Actuellement fabriquée par recombinaison génétique 36
  • Inhibiteurs directs de la thrombine, IIa Exosite I IIa IIaSite actif Lépirudine Refludan ® Désirudine Revasc ® IIa Site liaison Héparine Argatroban 37
  • Inhibition des facteurs activés IIa et Xa par l’AT, l’AntiThrombine III au niveau du site actif • ATIII IIa ATIII Xa 38
  • Système International d’Unités (SIU)• 10-15 femto f Numération des GR: 4• 10-12 pico p millions/mm3 = 4.106/µl soit• 10-9 nano n 4t/l.• 10-6 micro µ Volume du GR: 90fl, normales• 10-3 milli m 80-100• 1 unité (g,l,mole) Contenu en Hb: 30pg,• 103 kilo k normales 27-31• 106 méga m Concentration corpusculaire• 109 giga g moyenne en Hb: 30pg/90fl soit• 1012 téra t 30.000g/90l soit 333g/l normales: 300-350g/l 39
  • B) Dosage des Protéines totales du sérum (voir TP)• BA.1 – Technique: réaction du biuret.• BA.2 – Valeurs normales: moyenne arithmétique et 2 écarts types.• BA.3 – Variations pathologiques: hypo- et hyper- protidémies 40
  • • Hypoprotéinémies: portent principalement sur la sérum albumine.• Diminution de sa synthèse: apports nutritionnels insuffisants(Kwashiorkor marasme) ou atteinte des hépatocytes( insuffisance hépatique, cirrhose, hépatites).• Augmentation de sa fuite: lésions urinaires du glomérules, lésions intestinales, brulures étendues.• Hyperprotidémies: portent essentiellement sur les immunoglobulines(Maladie de Kahler, Plasmocytomes). 41
  • C) Propriétés générales des protéines• C.1- Principales propriétés physicochimiques:• C.1.1- Effets des sels sur la solubilité des protéines dans l’eau• C.1.2- Effets du pH sur la solubilité des protéines dans l’eau• C.1.3- Fixation non spécifique des colorants.• C.1.4- Spectre d’absorption dans l’UV 42
  • C .1.1 Effets des sels sur la solubilité des protéines dans l’eau La solubilité des protéines, qu’elles soient globulaires ou fibrillaires, dans l’eau est due à la présence à leur surface de résidus hydrophiles d’acides aminés comme les groupements –OH de la sérine,thréonine tyrosine et hydroyproline. La liaison OH est polarisée avec un pôle négatif sur l’O (δ-) et une charge positive sur l’H (δ+). Elle permet de contracter des liaisons hydrogène avec des molécules d’OH2 également polarisées qui entourent la protéine d’une couronne d’eau. 43
  • • L’effet des sels sur la solubilité des protéines dans l’eau fait intervenir les charges négatives ou positives portées par les résidus d’acides aminés acides (Aspartate et glutamate –COO-) et basiques (Lysine,NH3+, Arginine, Histidine) situés à la surface de la molécule.• Les sels comme le sulfate d’ammonium SO4- et NH4+ se lient respectivement aux charges + et - des acides aminés en formant une couronne de charges + et -. Les mol écules d’eau polarisées vont à leur tour entrer en contact avec les charges des sels et former une couronne d’eau, facilitant la solubilité à faible concentration en sel. .• Cette solubilité passe par un maximum puis diminue car l’eau est entièrement utilisée pour dissoudre le sel et réalise une déshydratation de la protéine d’où diminution de la solubilité. Pour une valeur critique, propre à chaque protéine, on obtient la précipitation de cette protéine.• La protéine précipitée conserve son état natif et peut être resolubilisée en diluant par l’eau la concentration en sels. 44
  • C.1.2 Effets du pH sur la solubilité des protéines dans l’eau• Il fait intervenir aussi l’ionisation des fonction acides et basiques des résidus d’acides aminés précédemment décrits.• Rappel de la dissociation des acides faibles selon Bronsted• R.COOH R.COO- + H+ pK COOH 2-3• R.NH3+ R.NH2 + H+ pK NH2 8-9 45
  • • En milieu acide cad riche en H+ la réaction évolue vers la gauche cad que la forme protonée R.COOH ou R.NH3+ est dominante.• En milieu alcalin ou basique cad pauvre en H+, la réaction évolue vers la droite cad vers la forme ionisée R.C00- acide et R.NH2 neutre.• A l’équilibre, cad 50% de chaque forme, le pH mesuré correspond au pK cad à la constante d’équilibre de la réaction K exprimée par pK= -log(K)• Pour le –COOH le pK se situe aux environs de pH= 2-3• Pour les acides aminés basiques le pK se situe à pH= 10 pour la,lysine, à pH=12 pour l’arginine et à pH= 6 pour l’histidine. 46
  • • Exemple d’une protéine avec 2 groupements COOH et 2 groupements NH3+.• 1) en milieu acide fort, pH=2 les 4 groupes vont être protonés 2 COOH et 2 NH3+. La molécule est sous forme d’un cation de charge nette 2+.• 2) En augmentant le pH, les 2 carboxyles vont s’ioniser en premier (pK=3) et conduire à 2COO- et 2NH3+. Les charges se neutralisent et l’on a affaire à un ion double de charge nette =0. Pour cette valeur du pH, on calcule le point isoionique ou pI qui est une caractéristique de chaque protéine.• 3) En augmentant encore le pH, on va ioniser les fonctions basiques( R.NH3+ R.NH2, pK= 10). La protéine est alors sous forme d’anion de charge nette -2 47
  • • La solubilité des protéines dépend du pH cad de la forme cation, neutre ou anion.• Les formes cations et anions sont solubles dans l’eau car possédant une même charge elles se repoussent:agitation moléculaire.• la forme neutre ne se repoussant pas passe à la valeur du pI par une solubilité minimum et on obtient la précipitation de la protéine, également sous sa forme native. Elle peut être redissoute dans un milieu de pH adapté. 48
  • • On peut classer les protéines en 3 groupes d’après leur pI:• pI voisin de ph=2,3 protéines riches en acides aminés acides• pI voisin de ph= 6,7 protéines neutres car le nombre d’acides aminés acides et basiques est voisin• pI de pH= 8-10 protéines basiques car riches en acides aminés basiques.• Notion fondamentale: pour chaque protéine la valeur du pI est importante à connaître:• En dessous du pI elle sera chargée +• Au pI elle, sera neutre• En dessus du pI elle sera chargée - 49
  • C .1.3 Fixation non spécifique des colorants• Les protéines sont en général incolores mises à part certaines qui contiennent des métaux qui leur confère une coloration comme l’hémoglobine rouge(Fer), la céruloplasmine bleue(Cu).• Pour les mettre en évidence on utilise des colorants non spécifique comme le rouge ponceau, le noir amide, le bleu de bromophénol. 50
  • C.1.4 Spectre d’absorption dans l’UV• En raison de la présence d’un ou de plusieurs résidus de tryptophane dont la chaîne latérale est un noyau indol, les protéines possèdent une spectre d’absorption dans l’UV dont le maximum se situe à 280nm. Si la protéine est pure l’absorption à 280nm permet de mesurer sa concentration.• Les protéines possèdent également un maximum d’absorption très important à 190nm, mille fois supérieur à celui de 280nm cad que l’on pourra à cette longueur d’onde(200nm) détecter une concentration en protéines mille fois plus faible. Cette propriété sera utilisée lors de la détection des protéines après séparation par électrophorèse capillaire. 51
  • 52
  • • C.2- Propriétés immunologiques• - Définition des protéines antigènes humaines, Ag et des anticorps, Ac, Immunoglobulines; Ig, présents dans le sérum d’un animal immunisé: spécificité et sensibilité(10-11) de la détection des protéines• - Mise en évidence des complexes Ag-Ac:• Précipitines 53
  • • Mise en évidence des précipitines:• A - en milieu liquide dans un tube étroit: anneau blanc à l’interface sérum humain ou protéine (Ag) - sérum animal immunisé (Ac).• B - en milieu solide hydrophile:agarose dans une boîte ronde dite de Pétri. Deux puits ronds contiennent l’Ag et l’Ac qui vont diffuser radialement et le point de rencontre Ag-Ac se manifeste par l’apparition d’un arc blanc unique. Aspect qualitatif et semi-quantitatif car l’épaisseur et la longueur de l’arc sont sensiblement proportionnelles à la quantité d’Ag.• C’est la technique d’Ouchterlony (Institut Pasteur Paris). 54
  • Méthode qualitative : OuchterlonyC – En milieu liquide etdans des conditionsopératoires bienprécises (viscositéaugmentée par le PEG)on peut stabiliser leprécipité Ag-Ac et lemesurer parnéphélémetrie. 55
  • D) Méthodes d’analyse des protéines du sérum• D.1- Solubilité des protéines en milieu salin• D.2- Electrophorèse• D.2.1- Electrophorèse en milieu liquide• D.2.2- Electrophorèse en milieu solide: papier(cellulose),cellogel( acétate de cellulose), amidon, agarose, polyacrylamide. Exemple de l’électrophorèse sur cellogel: principe, technique, résultats(profils normaux et pathologiques) D.2.3- Electrophorèse capillaire .D.3 – Immunochimie: immunoélectrophorèse et néphélémétrie. DC.4 – Protéome et protéomique 56
  • D.1- Solubilité des protéines en milieu salin• Le sérum sanguin peut être fractionné en 2 grands groupes de protéines:• - En ajoutant 1 volume de sulfate d’ammonium (SO4Am2) saturé à 1 volume de sérum on observe un précipité de globulines pour une concentration finale de 50% de saturation.• Le surnageant traitée à son tour par du SO4Am2 pour obtenir 75% de saturation. On observe un précipité de sérum albumine. 57
  • D.2 Electrophorèse D.2.1 Electrophorèse en veine liquide• Décrite par un chercheur suédois, Tiselius, l’électrophorèse en phase liquide nécessitait un appareillage compliqué et onéreux. En raison des mouvements liquidiens qui s’opposaient à la séparation des protéines d’après leur charge électrique, il fallait opérer en milieu thermostaté. Le déplacement des protéines était suivi par la variation de la diffraction du milieu entre le tampon et la protéine. Il était destiné à la recherche et non à la routine. 58
  • D.2.2 Électrophorèse en milieu solide ou sur support A) cellogel: Principe, technique (voir TP) 59
  • Résultats: Profil électrophorétique normal 60
  • • Seules les protéines dont la concentration est supérieure à 1g/l sont visibles sur le profil. Il y en a 11:• (la quantité de sérum déposée étant de 10µl, la quantité de protéines visualisée est 700µg soit 70µg par protéine(protidémie de 70g/l soit 70µg/µl).• 1) Sérum albumine 35-40 g/l• α1-globulines: 2) α1-glycoprotéine acide ou orosomucoide 1,2 g/l.• 3) α1-antitrypsine 3,0 g/l.• α2 –globulines: 4) α2 macroglobuline 3 g/l• 5) Haptoglobine 1,7 g/l• β-globulines: 6) β-lipoprotéines 4 g/l.• 7) Transferrine 2,5 g/l (1,8-3,3 g/l).• 8) Fraction C3 du complément 1 g/l (0,8-1,6 g/l).• 9) IgM 1 g/l ( 0,5-1,5 g/l).• 10) IgA 2 g/l ( 1,1-3,4 g/l)• 11) IgG 10 g/l (7-13 g/l). 61
  • Dynamique d’expression des protéinessériques: la SA et les IG représentent 90% des protéines sériques 62
  • Profils électrophorétiques en Pathologie 63
  • 64
  • 65
  • La bisalbuminémie de Kénitra• La bisalbuminémie se définit comme la coexistence de 2 populations d’albumine sérique mise en évidence par l’électrophorèse: 1 normal et 1 variant. .Le variant peut être plus rapide ou plus lent par rapport à l’albumine normale. Cette anomalie est acquise (fixation d’un médicament qui modifie la charge et donc la,migration) ou héréditaire (mutation du gène qui produit une protéine dont la charge est modifiée. La forme héréditaire est de transmission autosomique dominante: 1 gène normal et un gène muté donnant une protéine normale et une anormale.• Le gène de la S-albumine est localisé sur le chr.4q11-13 et comprends 15 exons et code pour 585 AA.(1755 nucléotides.• La bisalbumine de Kénitra est due à l’insertion d’une Adénine au nucléotide 1597entrainant un décalage du cadre de lecture et d’un codon stop retardé donnant une protéine allongée de 603 AA.( Mutation trouvée chez une marocaine née à Kénitra dans le service de Médecine interne du Pr.Weiller au CHU timone à Marseille) 66
  • Autre exemple de bisalbuminémie 67
  • B) Gel d’agarose Zone de dépôt - + Cathode Anode• Gel d’agarose• Migration des protéines en fonction de la charge électrique• Coloration des protéines• Examen visuel (bandes) ou intégration densitométrique (pics) 68
  • gels d’agarose en séries selon 2fournisseurs: Sebia(34) et Midigel (10) 69
  • D.2.3 - Electrophorèse capillaire en phase liquide 70
  • 71
  • 72
  • 73
  • 74
  • Présence de résidus de fibrinogène dans un sérum en position β-globuline 75
  • • D.3- Immunochimie• Spécificité importante: Ag-Ac• Sensibilité importante: permet de détecter les protéines à des concentrations très faibles: µg/l(10-6g:l), ng/l(10-9g/l• Néphélémetrie• Principe, technique, résultats avec Ac spécifiques des protéines du sérum 76
  • Néphélémétrie 77
  • Dosage des protéines sériques et urinaires 78
  • Méthodes quantitatives, milieuliquide Immunonéphélémétrieet/ou turbimétrieSi la lumière diffractée est caractérisée par une longueur d’onde identique à celle du faisceau incident, lum. inc = lum. diff, il s’agit de la diffusion RAYLEIGH de la lumière. 79
  • L’absorption du faisceau en lumière transmise, donc dans la direction du faisceauincident s’appelle la turbidimétrie. L’observation de la lumière diffractée selon un angle a par rapport à la direction incidente s’appelle la néphélométrie Formule de Rayleigh : Lambda est la longueur d’onde de la lumière, n est le nombre de particules par unité de volume, V le volume des particules, et K un facteur de proportionalité. Lorsque l’angle d’observation est de 90° l’intensité C, diffractée est maximum (sin de alpha est égal à 1) 80
  • d < lambdaDispersionRayleigh d > lambda Dispersion Mie 81
  • D.4 Protéome et protéomique• Projet d’identification des protéines des tissus et en particulier du sérum sanguin. Il est basé sur le fait notre génome code pour environ 20 à 25.000 protéines bien que chaque tissu n’en exprime qu’un certain nombre. Ce travail de recherche a progressé en raison de la mise au point de nouvelles techniques très performantes. Nous donnerons 2 exemples pour le sérum sanguin:• 1) 1980-90, Séparation des protéines par électrophorèse dur gel de polyacrylamide à 7% en 2 dimensions: dans une dimension les protéines sont séparées d’après la valeur de leur pI en milieu non dénaturant, dans l’autre dimension perpendiculaire elles sont séparées d’après leur masse moléculaire en milieu dénaturant (présence de SDS, 82
  • • Après coloration par le bleu de Coomassie on peut mettre en évidence une centaine de protéines. La limite de détection est de 50ng comparée à celle sur cellogel qui est de 70µg. La sérum albumine est bien visibleRappel dechimie sur lafabrication dugel depolyacrylamide à partir del’acrylamideet sur lestamismoléculaires. 83
  • • 2) 2000-2005 Méthode SELDI-TOF (surface-enhaced laser desorption and ionisation time-of-fligh)• C’est une plateforme qui combine la chromatographie de surface à la spectrométries de masse. Le mélange protéique est fractionné dans un premier temps par chromatographie de surface par adsorption en fonction de ses propriétés physico-chimiques ( ionisation en cations ou anions,caractère hydrophile ou hydrophobe) ou biologiques(réaction Ag-Ac) puis les échantillons sont désorbés par un laser et analysés par spectrométrie de masse. 84
  • Principe du spectrophotomètre de massePlateforme SELDI 85
  • E) Classification des Protéines du sérum• E.1- Lieu de synthèse: foie, lymphocytes B, glandes endocrines• E.2- Structure: holo- et hétéro-protéines• E.3- Concentration• E.4- Rôles: coagulation, enzymes, immunoglobulines(Ig), antiprotéases, protéines de la réaction inflammatoire (PRI), transport ou liaison 86
  • E.2 Structure: Holo-et hétéro-protéines• Holoprotéines: ne donnent à l’hydrolyse que des AA. Il y en a 3: Sérum albumine, Préalbumine ou transthyrétine, protéine C réactive, PCR ou CRP.• Hétéroprotéines: donnent à l’hydrolyse des AA et des molécules différentes ou groupement prosthétique.• - Glycoprotéines: groupements polyosidiques ou glycanes qui varient en nombre, en longueur, en nature(oses neutre ou acides comme l’acide sialique). Α1- glycoprotéine acide, α1-foetoprotéine, α2- macroglobuline.( La majeure partie des protéines du sérum sont des glycoprotéines)• Lipoprotéines: α et β-lipoprotéines.- Métalloprotéines: céruloplasmine(Cu), Transferrine et ferritine(Fe). 87
  • E3. Concentration• 1) > 1g/l 11 protéines de l’électrophorèse• 2) 1-1000mg/l• Hémopexine: 750• Céruloplasmine: 500 (150-600)• Antithrombine III: 250 (170-300)• Transthyrétine: 250• Plasminogène: 200 (100-300)• Prothrombine: 75 (50-100)• Β-2 microglobuline 50 88
  • • 3) 1-1000 µg/l• Ferritine: 200• α- foetoprotéine: 10• PSA: 2,5 (Prostatic specific antigen)• 4) 1-1000 ng/l• HBC: 100 (Hormone béta chorionique)• Calcitonine: 10• 5) 1-1000 pg/l 89
  • E4 Rôles• E.4.1- protéines de la coagulation et de la fibrinolyse• E.4.2- Enzymes: LDH, CK, PAL (Phosphatases Alcalines), ASAT,ALAT, GammaGT(Gamma GlutamylTranspeptidase).• E.4.3- Inhibiteurs d’enzymes: α-1 AT Anti Trypsine, α-2 Macroglobuline.• E.4.4- Protéines de transport ou de liaison: 90
  • F) Etude de quelques protéines importantes du sérum• F.1 Les inhibiteurs d’Enzymes:• - AT, Anti-thrombine III• - AM, Alpha-2-macroglobuline• - AAT, Alpha-1-AntiTrypsine 91
  • F.2 Les protéines de transport et de liaison• F.2.1 Sérum albumine:• 1) molécules normalement présentes dans le sang(plasma)• 1.A) hydrophobes: bilirubine libre, vitamines liposolubles (Vit A, D, E),acides gras libres, hormones stéroides.• 1.B) ions: Ca2+, Zn2+, Ni• 2) molécules absentes à l’état normal: médicaments: notion de médicaments libre(actif biologiquement) et lié(réserve potentielle de médicaments libre). Notion de pharmacocinétique 92
  • • F.2.2 - Haptoglobine• F.2.3 - Hémopexine• F.2.4 – Transferrine,Tf et ferritine• F.2.5 – Céruloplasmine• F.2.6 - RBP Retinol Binding Protein ou transthyrétine ou préalbumine• F.2.7 – Les globulines liant les hormones• F.3 – Les marqueurs tumoraux:• PSA, Prostatic Specific Antigene• ACE, Antigène Carcino Embryonnaire• AFP, AlphaFétoProteine 93
  • • F.4 - Les protéines de la réaction inflammatoire, RI• - CRP, C-reactive protein• - fibrinogène• F.5 - Les protéines du complément et les immunoglobulines• F.6 – Les Hormones: Erythropoiétine 94