Electrochemical Detection ofElectrochemical Detection of
Nitric Oxide in Biological FluidsNitric Oxide in Biological Fluid...
Nitric Oxide in Blood
Name Description
Neuronal
NOS
(nNOS or NOS1)
Produces NO in
neuronal tissue
in both the central and
...
Nitric Oxide in Blood
epentdent Vasodilator (Acetylcholine, Bradyk
r stress
matory
xia
Nitric Oxide in Blood
• NO has a half-life of about 4 s in biological
fluids and is oxidized to nitrite and nitrate
anions
Nitric Oxide in Blood
NO may be present in the blood in at least 2 active
Forms
1. Aqueous form as a dissolved gas
The hal...
Nitric Oxide in Blood
(oxyhaemoglobin) (methaemoglobin) (nitrate)
J. P. Wallis (2005)
(Adrian J. Hobbs ,2002)
Nitric Oxide in Blood
Why Detection of NO in Blood
Diseases or Conditions Associated with
Abnormal NO Production and Bioavailability
• Hypertens...
Introduction
•Electrochemistry
–fluids in real time and in situ
•NO electrodes can be made
small enough to be used in vivo...
Materials and Methods
Helix Diameter
1.85 mm
100 µM in diameter , 3 mm long.
Suspended a 20
µL
drop of rabbit
aortic blood
Electrodes
•Platinum wires, 100 µM in
diameter
•Multiwalled carbon
nanotubes
•Coated with ruthenium
•Coated with Nafion
Electrode
Gas flow
•Air–CO2 mixture (20% O2, 5%
CO2, 75% N2)
•CO2–nitrogen mixture (5%CO2,
95% N2)
Gas flow was maintained at
consta...
Blood Samples
•Rabbit aortic blood 3 mL
•Containing 7 units of
lyophilized heparin
•kept on ice for up to 30
min before us...
Chemical Reagents
•Prepared 100 µM solutions in
deionized water
–ascorbate
–L-cystine
–2,3-diphospho-D-glyceric
acid (DPG)...
Electrochemical Methods
•Amperometry
•BAS 100 B/W potentiostat
equipped
•+675 mV (vs. Ag/AgCl,)
•The electrodes were
activ...
The data were not used
•the composite resistance of
the electrochemical cell was
measured three times, final
average was m...
Results
• Selectivity of the Sensor for Nitric Oxide
100 µM solutions in deionized water
Responses to Changing Gas
Mixtures
Change Gas mixed
350 s
NO oxidation
Control
Responses to Changing
Gas Mixtures
•Responses to Changing Gas
Mixtures
–NO oxidation signals were first
detected from 200 ...
Discussion
• The blood-drop preparation described
here may represent a useful approach for
further investigation of the re...
Discussion
• limiting the potential or by applying
coatings to the electrode that exclude spe
cies that have certain chara...
Conclusions
•A highly sensitive
electrochemical system can b
e designed to detect nM
concentrations of NO activity
•From 2...
Conclusions
•we did not measure the
change in either ambient PO2
or blood-drop PO2 in this
deliberately kept low in order
...
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Electrochemical Detection Of Nitric Oxide In Biological Fluids

577

Published on

Jaunal club 2 :Electrochemical Detection Of Nitric Oxide In Biological Fluids

Published in: Business, Technology
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total Views
577
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
25
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide
  • NO เป็นก๊าซโมเลกุลขนาดเล็กที่ถูกสร้างขึ้นจาก NO Synthase ซึ่งมีอยู่ 3 Isoform
    Neuronal NOS คือเอ็นไซม์ที่ เส้นประสาทสังเคราะห์ NO ที่ทำหน้าที่เป็นสารสื่อประสาท
    Inducible NOS คือเอ็นไซม์ที่ macrophage สังเคราะห์ NO ที่ทำหน้าเป็นภูมิคุ้มกัน ทำลายสิ่งแปลกปลอม
    Endothelial NOS คือเอ็นไซม์ที่อยู่ใน Endothelial cell ที่บุผนังหลอดเลือด ทำหน้าที่ควบคุมการไหลของกระแสเลือด
  • ขั้นตอนการสังเคราะห์ NO นั้นเริ่มต้นที่ ตัวกระตุ้น NOS ให้เปลี่ยนจากรูปจาก inactive เป็น active
    เช่น สารกลุ่ม NO-depentdent Vasodilator เช่น Acetylcholine Bradykinin เป็นต้น จับกับ receptor ที่อยู่บนผิวของ Endotherail cell
    เกิดการเปิดของ Ca ion chanel , Ca ion ในเซลที่เพิ่มขึ้นจะทำให้ NOS ทำงานโดยเปลี่ยนอะมิโนเอซิต L-arg เป็น L-Citruline
    ได้ผลิตภัณฑ์อีกตัวออกมาคือ NO
    เนื่องจาก NO เป็นก๊าชที่มีความไวต่อปฏิกิริยาสูงมาก จะเปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็ว
    1. Aq NO ละลายอยู่ใน
    2. Nitrite ,Nitrate
    3. Nitrosothiols คือจะไปจับตัวกับสารที่มี กลุ่ม thial อยู่เช่น Albumin haemoglobin glutathione
    4. Peroxynitrite รวมตัวกับ Super Oxide
  • แต่ form active คือที่สามารถทำงานได้คือ NO ที่สะลายอยู่ในของเหลว กับ กลุ่ม Nitrosothiols
    ซึ่งมีงานวิจัยหนึ่งรายงานว่า Aq NO นั้นมีครึ่งชีวิตประมาณ 1 นาที
  • ตัวอย่าง NO ที่รวมตัวกับ Hb โดยจะเขาไปจับกับ Oxy. เปลี่ยนเปลี่ยนเป็น Meth. และ nitrite
  • Nitric Oxide ที่รวมตัวอยู่กับ Hb นั้นสามารถที่จะปล่อยออกมาได้เมื่อปริมาณของ PO2 ต่ำ
  • ความดันโลหิตสูง
    โรคอ้วน
    ภาวะไขมันโคเลสเตอรอลสูง
    โรคเบาหวาน
    โรคหัวใจขาดเลือด
    หลอดเลือดอุดตัน
    สูบบุหรี่
    ติดเชื้อในกระแสเลือด
  • Electrochemistry เป็นวิธีที่เหมาะสมที่ใช้วัดในสิ่งตัวอย่างที่มาจากสิ่งมีชีวิต เพราะสามารถวัดได้แบบ Real time และ วัดได้จากจุดที่หลั่งได้
    NO Electrode ที่ใช้ในการวัดแบบ in vivo มีการผลิตค่อนข้างน้อย งานวิจัยนี้จะเป็นโมเดลให้กับการทดลองต่อๆไป
    การวัดในครั้งนี้สิ่งตรวจที่มาจากสิ่งมีชีวิต นี้จะควบคุมปริมาณแก็สที่อยู่โดยรอบ โดยกระตุ้นการหลั่ง NO จาก RBC โดยการเปลี่ยนปริมาณของออกซิเจน
  • การออกแบบของงานวิจัยนี้เพื่อใช้ในการวัดเลือดที่ได้จากกระต่าย โดยให้
    Working Electrode/Counter Electrode ทำจาก Pt อยู่ตรงกลางมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 100 µm ยาว 3 mm
    Ref Electrode ทำจาก Ag เคลือบด้วย Ag/AgCl ทำเป็นเกลียวเส้นรอบวง 1.85 mm
    Sample Blood หยดลงตรงกลางปริมาณ 20 µL
  • การเตรียม Electrode ในเหมาะสมกับ NO
    ใช้ Pt เส้นผ่านศูนย์กลาง 100 um
    เคลือบด้วย carbon nanotubes
    เคลือบด้วย ruthenium
    และสุดท้ายเคลือบด้วย Nafion
  • จากนั้นมีการตรวจสอบว่าสารต่างๆที่เคลือบนั้น
    หลังจากทำการเคลือบแล้วมีการติดที่ Electrode จริงเลยมีการ
    ใช้ Scanning electron micrograhy ส่องดู ก็พบว่ามีการเคลือบของสารต่างๆเกิดขึ้น
  • ก๊าซที่ใช้ในการควบคุมการจำลองปรากฏการ hypoxia
    เมื่อ NO จับอยู่กับสารอื่นเมื่ออยู่ในสภาวะขาดออกซิเจนหรือสภาวะ hypoxia ก็จะถูกปล่อยออกมา
    จากนั้น electrode ก็จะทำการตรวจวัด NO ที่ถูกปล่อยออกมา
  • การเก็บตัวอย่างเลือดใช้เลือดกระต่าย
    เก็บมา 3 ml ในสารกั้นเลือดแข็ง Heparin
    และแช่ในน้ำแข็ง เป็นเวลา 30 นาทีก่อนนำมาทดสอบ
  • กลุ่มสารรบกวนต่างๆที่คาดว่าจะมีผลต่อการวัด NO
    ก็จะเตรียมในความเข้มข้น 100 uM มี
  • ใช้หลักการ Amperometry โดยในแรงดันแล้ววัดกระแสที่เกิดขึ้น
    ใช้เครื่อง BAS 100 B/W เป็นเครื่องในการให้แรงดันและวัดแส
    ใช้ แรงดัน +675 mV
    ก่อนการวัดทำการ activate electrode ด้วยกระแสไฟฟ้าสลับ 200 mV และ 800 mV อย่างละ 250 ms และ 500 ms ตามลำดับ
    และทำทั้งหมด 120 s
  • การคัดเลือก Data มาวิเคราะห์
    วัดความต้านทานของ electrode ก่อนทำการวัดและหลังการวัดอย่างละ 3 ครั้ง
    ถ้าหลังมากว่า 10 % แสดงว่าเลือดแห้ง
    เลือดแห้งไม่ใช้ data นั้น
    เลือดไม่อยู่ในเกลียว
  • ผลของการวัดกับสารรบกวนเทียบกับ NO
  • การวัดเมื่อเปลี่ยน gas mixed แกนตั้งคือกระแสหน่วย nA แกนนอนเป็นเวลา
    กราฟ A ลูกศรคือช่วงที่มีการเปลี่ยนก๊าซเมื่อเวลาผ่านไป 350 s พบว่าเกิด peak ของสัญญาณขึ้น
    กราฟ B คือ Sample blood เหมือนกันแต่ไม่เปลี่ยนก๊าซ
  • จากการศึกษาดังกล่าวพบว่า peak จะเกิดขึ้นหลังเปลี่ยนก๊าซประมาณ 200-400 s
    Peak ที่เกิดขึ้นวัดกระแสได้ประมาณ 1-2 nA
  • จากการเก็บตัวอย่างเลือดอาจจะทำให้เกิดผลกระทบปริมาณของ NO ได้
  • วิธีที่วัดคือการวัดการ transfer ที่ electrone ดังนั้นเราไม่อาจแน่ใจได้ว่าตัวที่ transfer ให้ นั้นมาจาก NO การเลือก selective membran และการ limite แรงดันสามารถช่วยแก้ปัญหานี้ได้
    2. ควรจะเพิ่มการวัดด้วยวิธีอื่นเพื่อใช้ในการเปนียบเทียบด้วย
  • สามารถผลิต electrode ที่มีความไวต่อ NO ได้
    หลังจากเปลี่ยนปริมาณ PO2 ไปแล้วประมาณ 200-400 s จะเกิดปฎิกิริยาเกิดขึ้น
    ในการทดลองนี้ได้ใช้การจำลองภาวะ Hypoxia เพื่อกระตุ้นให้มีการปล่อย NO
  • 1.ไม่สามารถที่จะทำการลดปริมาณ PO2 ให้เหมือนจริงได้ เพราะถ้าทำช้าจะทำให้ เลือดแห้ง
    2. ไม่สามารถระบุตำแหน่งได้ว่า ออกมาจาก เม็ดเลือด หรือ plasma
  • Electrochemical Detection Of Nitric Oxide In Biological Fluids

    1. 1. Electrochemical Detection ofElectrochemical Detection of Nitric Oxide in Biological FluidsNitric Oxide in Biological Fluids METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. BARRY W. ALLEN, JIE LIU, and CLAUDE A. PIANTADOSI
    2. 2. Nitric Oxide in Blood Name Description Neuronal NOS (nNOS or NOS1) Produces NO in neuronal tissue in both the central and peripheral nervous system. Inducible NOS (iNOS or NOS2) Can be found in the immune system used by macrophages in immune defence against pathogens. Endothelial Three isoforms of NO synthase (NOS) Furchgott R, Zawadzki J (1980).
    3. 3. Nitric Oxide in Blood epentdent Vasodilator (Acetylcholine, Bradyk r stress matory xia
    4. 4. Nitric Oxide in Blood • NO has a half-life of about 4 s in biological fluids and is oxidized to nitrite and nitrate anions
    5. 5. Nitric Oxide in Blood NO may be present in the blood in at least 2 active Forms 1. Aqueous form as a dissolved gas The half life of aqueous NO in red cell-free plasma in vitro is around 1 min (Rassaf et al., 2002). 2. Nitrosothiols or RSNOs
    6. 6. Nitric Oxide in Blood (oxyhaemoglobin) (methaemoglobin) (nitrate) J. P. Wallis (2005)
    7. 7. (Adrian J. Hobbs ,2002) Nitric Oxide in Blood
    8. 8. Why Detection of NO in Blood Diseases or Conditions Associated with Abnormal NO Production and Bioavailability • Hypertension • Obesity • Dyslipidemias (particularly hypercholesterolemia and hypertriglyceridemia) • Diabetes (both type I and II) • Heart failure • Atherosclerosis • Cigarette smoking • Septicemia • Etc.
    9. 9. Introduction •Electrochemistry –fluids in real time and in situ •NO electrodes can be made small enough to be used in vivo •NO in biological fluids that are maintained in contact with a gaseous environment, •Release of NO from blood cells as they move between regions
    10. 10. Materials and Methods Helix Diameter 1.85 mm 100 µM in diameter , 3 mm long. Suspended a 20 µL drop of rabbit aortic blood
    11. 11. Electrodes •Platinum wires, 100 µM in diameter •Multiwalled carbon nanotubes •Coated with ruthenium •Coated with Nafion
    12. 12. Electrode
    13. 13. Gas flow •Air–CO2 mixture (20% O2, 5% CO2, 75% N2) •CO2–nitrogen mixture (5%CO2, 95% N2) Gas flow was maintained at constant rate
    14. 14. Blood Samples •Rabbit aortic blood 3 mL •Containing 7 units of lyophilized heparin •kept on ice for up to 30 min before use.
    15. 15. Chemical Reagents •Prepared 100 µM solutions in deionized water –ascorbate –L-cystine –2,3-diphospho-D-glyceric acid (DPG) –sodium nitrite
    16. 16. Electrochemical Methods •Amperometry •BAS 100 B/W potentiostat equipped •+675 mV (vs. Ag/AgCl,) •The electrodes were activated electrochemically b y applying alternating potent ials of 200 and 800 mV for 2
    17. 17. The data were not used •the composite resistance of the electrochemical cell was measured three times, final average was more than 10% greater than the initial avera ge, fouled or that the blood d rop had dried, •The bloodwas not fluid
    18. 18. Results • Selectivity of the Sensor for Nitric Oxide 100 µM solutions in deionized water
    19. 19. Responses to Changing Gas Mixtures Change Gas mixed 350 s NO oxidation Control
    20. 20. Responses to Changing Gas Mixtures •Responses to Changing Gas Mixtures –NO oxidation signals were first detected from 200 to 400 s after the flowing gas was chang ed –spike was followed by a continuous signal of 1–2 nA
    21. 21. Discussion • The blood-drop preparation described here may represent a useful approach for further investigation of the response of NO levels
    22. 22. Discussion • limiting the potential or by applying coatings to the electrode that exclude spe cies that have certain characteristics of ch arge or size • always useful to confirm anyexperimental result by using other nonelectrochemical methods
    23. 23. Conclusions •A highly sensitive electrochemical system can b e designed to detect nM concentrations of NO activity •From 200 to 400 s after a suspended drop of rabbit arte rial blood was exposed to a d ecrease in ambient PO2 •an experimental condition—
    24. 24. Conclusions •we did not measure the change in either ambient PO2 or blood-drop PO2 in this deliberately kept low in order to prevent drying of the blood drop, PO2 will change slowly. • we cannot assign this
    1. A particular slide catching your eye?

      Clipping is a handy way to collect important slides you want to go back to later.

    ×