rôle de la protéine découplante UCP1 dans thermogenèse sans frisson

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importance de protéine UCP1 dans la genèse de la chaleur et leur intervention dans autres concepts physiologique et physiopathologique

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  • 1. UCP1 ET THERMOGENÈSE SANS FRISSON
  • 2. La protéine découplante UCP1 - L’étude des mitochondries du TAB de hamster montre que ces derniers admis une perméabilité aux cl-et aux H+ -Cette perméabilité est fortement diminuée en présence de GDP et d’albumine -Elle est reliée au potentiel de la membrane et au découplage de la respiration remarquée dans les mitochondries du TAB, -La présence d’un site de forte affinité pour le GDP, mis en évidence une hypothèse qui suggère la présence d’une protéine liant le GDP ( en 1976 ) :protéine serait responsable du découplage de la respiration -Utilisation de photo marquage par des nucléotides radioactifs en 1978 a permet l’ identification de cette protéine :32 kDa et l’appellent UCP (UnCoupling Protein). -Les premières caractérisations biochimique sont faites grâce à la méthode de purification de la protéine en se basant sur la méthode de purification utilisée pour le transporteur ADP/ATP - La séquence protéique d’UCP1 est déterminée en 1985 tandis que le clonage d’UCP1 était en 1986 -UCP1 présente une topologie commune aux transporteurs mitochondriaux -Sa structure n’a pas encore été déterminée. Mais en se basant sur la structure de l’AAC (21% d’identité de séquence protéique entre bAAC1 et rUCP1.
  • 3. ) UCP1 Gene in genomic location: bands according to Ensembl, locations according to (and/or Entrez Gene and/or Ensembl if different)
  • 4. structure Figure 10 : L’organisation des transporteurs mitochondriaux (Pebay-Peroula et al., Nature, 2003) (A) Topologie de l’ADP/ATP translocase, représentative des transporteurs mitochondriaux. Leur struture secondaire comporte 6 hélices a-transmembranaires (H), 3 boucles matricielles (M) et 2 boucles dans l’espace inter-membranaire. Les extrémités N- et C- terminales sont dans l’espace inter-membranaire. (B) Schéma de la structure de la translocase.
  • 5. UCP1 - transporteur de protons -La fonction d’UCP1 est de transporter des protons de l’espace intermembranaire vers la matrice mitochondriale (ou des OH- dans l’autre sens). -La reconstitution de la protéine dans des liposomes, montre qu’UCP1 était capable de transporter des protons dans les deux sens, -La vitesse de transport décrite pour l’UCP1 varie en fonction des conditions expérimentales, allant de 1000 s-1 à 20 s-1 et 14 s-1 pour l’UCP1 native et 7 s-1 et 3 s-1 pour l’UCP1 recombinant. -L’unité fonctionnelle d’UCP1 est généralement décrite comme étant un dimère. -Ceci a été suggéré par des études de pontage chimique sur les mitochondries du TAB et sur la protéine purifiée et incorporée en liposomes -Des travaux de centrifugation analytique et des approches analogues faites sur l’AAC avaient également permis l’hypothèse de l’existence d’un dimère pour l’AAC. - Cependant, plusieurs études récentes suggérant l’état monomérique de l’AAC remettent aussi en question l’état oligomerique d’UCP. 1 10
  • 6. II)Régulation de l’UCP Les principaux régulateurs de l’activité protonophore d’UCP1 sont: les acides gras qui agissent en activant le transport les nucléotides qui agissent en l’inhibant ce transport 1) La régulation par les nucléotides La liaison et l’inhibition par les nucléotides ont été étudiées sur la mitochondrie et sur la protéine isolée ou incorporée en liposomes UCP1 présente une affinité pour les nucléotides di et tri phosphate et une très pour les nucléotides monophosphate. affinité UCP1 préfère les bases purines et plus spécialement guanine l’ordre de l’affinité des nucléotides purines pour l’UCP étant : GTP > GDP > ATP > ADP >>> GMP/AMP Les KD pour les nucléotides purines di et tri phosphate sont de l’ordre du micro molaire, allant de 0,4 à 4 #M à pH 6,7 UCP1 lie seulement les nucléotides libres, non-complexés au. Mg2+
  • 7. a) Site de liaison des nucléotides La localisation de site de liaison des nucléotides est faite grâce à des expériences utilisant la mutagenèse dirigée et des nucléotides marqués. L’utilisation des nucléotides présentant des groupements réactifs sur le cycle purine, mis en évidence des interactions entre ces nucléotides et trois résidus de la troisième hélice matricielle prédite (h56), C253, T259, T264, Dans cette région de la protéine, il ya une similarité des résidus 261-269 d’UCP1 avec le site de fixation de l’ADN du récepteur aux oestrogènes. La suppression de trois résidus au niveau de cette région (F267, K268, G269) conduit à surmonter l’inhibition de transport par les nucléotides . Les résidus 261-269 sont présents dans le troisième tiers de la protéine. Des délétions ont donc été réalisées dans les régions analogues situées dans le premier et deuxième tiers de la protéine aboutis au même résultat
  • 8. Figure 11 Localisation des résidus impliqués dans la liaison du GDP sur le modèle tridimensionnel de hUCP1 A. Vue dans le plan de la membrane B. Vue depuis l’espace intermembranaire
  • 9. b) Dépendance en fonction du pH La liaison des nucléotides à l’UCP1 est fortement influencée par le pH. L’affinité augmente lorsque le pH mais pas de façon linéaire, l’augmentation étant moins importante à des pH inférieurs à 6,8. L’influence du pH sur l’affinité est plus remarquable pour les nucléotides triphosphates que pour les nucléotides di-phosphate(GTP ;ATP ;GDP ;ADP) Des études de mutagenèse dirigée ont montré que le résidu E190 joue un rôle important dans la dépendance du pH de la liaison des nucléotides . Des différences dans la liaison des nucléotides à la protéine sont montré en fonction de la technique utilisée pour la mesurer :  méthode par échange ionique (le complexe UCP1-nucléotide est passé { travers d’une résine anionique qui retient seulement les nucléotides non liés),  par fluorescence (utilisation de nucléotides fluorescents). deux états de liaison : Un état de faible liaison, atteint très rapidement et qui ne provoque pas l’inhibition du transport proton, Un état de forte liaison pour lequel l’activité de transport est inhibée En effet, la méthode par fluorescence détecte les deux états alors que la méthode par échange ionique ne révèle que le nucléotide fortement lié à la protéine. En identifiant par mutagenèse un résidu (R276) qui n’affecte pas la liaison aux nucléotides 1 17 mais l’inhibition du transport,
  • 10. C)Effet des anions Par compétition, les anions inhibent la liaison du GDP { l’UCP1 . l’ordre d’inhibition de différents anions est le suivant : pyrophosphate (Ki = 0,16 mM) > sulfate (1 mM) > phosphate (4,4 mM) > maleate ( 8mM) > chlorure (9,3 mM) >>> acétate l’imidazole inhibe aussi la liaison 2) La régulation par les acides gras Les études sur les adipocytes bruns, sur les mitochondries du TAB et sur la protéine purifiée reconstituée en liposomes ont montré que l’activité de transport de protons par l’UCP1 est activée par les acides gras. Cette activation est dépendante du pH, et augmente vers les pH basiques La longueur de la chaîne est un paramètre important. Une chaîne hydrophobe supérieure à 8 carbones est nécessaire pour activer le transport, A Max pour les AG :C12 et C14. Pour les AGLC, la conductance avec le nombre d’insaturations. Les acides gras estérifiés ne sont pas capables d’activer le transport. En construisant des dimères UCP1-UCP2 il a été démontrer que la deuxième boucle matricielle d’UCPLE h34 (boucle connectant les hélices 3 et 4) est critique pour l’activation par les acides gras.
  • 11. Mécanisme de transport de protons Deux modèles principaux ont été proposés : Fatty acid cyclic model». , les acides gras, protonés dans l’espace intermembranaire passent d’un feuillet { l’autre (mouvement de flip-flop) à travers la membrane mitochondriale interne indépendamment d’UCP1. Dans la matrice, en raison du pH élevé, les protons se dissocient des acides gras et les acides gras anioniques sont transportés vers l’espace inter-membranaire par l’UCP1. UCP1 transporte des acides gras anioniques et non des protons et le transport H+ observé serait donc totalement dépendant de la présence des AG. . Ceci est basé sur des études qui suggérant la capacité d’UCP1 { transporter des anions et plus précisément des anions des acides gras. En effet l’UCP1 incorporé dans les liposomes est capable de faire un transfert de charge à travers la membrane en utilisant des acides gras et plus précisément un analogue non protonable d’acide gras : le undécanesulfonate. En revanche, ce modèle demeure incompatible avec l’observation que les acides transrétinoiques qui n’ont pas une capacité de découplage et de flip-flopinné, peuvent activer le transport H+ 1 19
  • 12. « Proton buffering model » Les protons traversent la membrane via des fonctions acides et amines de la protéineUCP1 Les acides gras vont offrir des groupements protonables supplémentaires et activent ainsi le passage des protons. Un des arguments pour ce modèle est l’existence de résidus (H145, H147, R152) dont la mutation diminue l’activation par les acides gras du transport H+ ainsi que l’affinité de la protéine pour les acides gras ;mais n’affecte pas le transport des anions ou la liaison du GDP Des études montrent par exemple qu’il y a une inhibition compétitive entre les acides gras et les nucléotides, la liaison du GDP { la protéine étant diminuée en présence d’acides gras Ceci suggère que les acides gras activent la protéine de façon indirecte en surmontant l’inhibition par les nucléotides. Le transport de protons ne serait donc pas dépendant des acides gras. Il est possible aussi d’avoir deux voies indépendantes du transport de protons au sein d’UCP1. La mutation de deux résidus conservés du point du vue de l’évolution (E134 et M140) inhibe le transport H+ basal mais pas le transport induit pas les acides gras ou la liaison au GDP 1 20
  • 13. Régulation allostérique La théorie des navettes la théorie du cofacteur Théorie de compétition
  • 14. 3)Autres régulateurs activateurs inhibiteurs les acides rétinoïques le superoxide un produit de la peroxydation des lipides le 4-hyroxy2-nonénal (HNE) alkylsulfonates la coenzyme Q10 un co-facteur nécessaire pour le transport H+ par UCP1 Autres expériences montrent que l’UCP1exprimé dans une levure (le gène codant pour la coenzyme Q10 a été inactivé), a une activité de transport normale. la coenzyme Q10 peut activer UCP1 de façon indirecte, en augmentant son affinité pour l’acide rétinoïque(2009) CIDEA le deathinducing CIDEA cellule) fortement exprimé dans le tissu adipeux brun. Des souris transgéniques déficients en CIDEA montrent une dépense énergétique accrue ce qui peut suggérer une inhibition d’UCP1 par cette protéine (Lin 2004)
  • 15. UCP1 - transporteur d’anions Une des caractéristiques des mitochondries du tissu adipeux brun est leur perméabilité aux ions chlorure cl-, perméabilité fortement réduite en présence de GDP. Des mesures effectuées sur des liposomes ayant incorporés UCP1 purifié confirment que cette perméabilité était due { l’UCP1. Des études plus extensives ont révélé qu’UCP1 est capable non seulement de transporter des ions chlorure mais aussi diverses classes d’anions comme:  Les halogénés (Br-, I- , F-),  Les sulfonates,  Les alkylsulfonates,  Les oxohalogénides,  Les dérivés du phosphate monovalent  Les anions organiques monovalents (comme le pyruvate). Tous ces anions transportés inhibent le transport Cl- de façon compétitive Des études d’électrophysiologie sur des liposomes géants contenant UCP1 ont montré que ce transport chlorure présente des caractéristiques correspondant à un canal avec une conductance de 75 pS en 100 mM KCl symétrique. Ce transport d’anions ne dépend pas du pH et est inhibé par les nucléotides. 1 26
  • 16. Effet des ions chlorure Les halogènes tels que les ions chlorure peuvent avoir un effet inhibiteur du transport des protons par l’UCP1 Le remplacement du gluconate de potassium (utilisé habituellement) par le chlorure de potassium montre que la valeur maximale du courant n’a pas diminué mais la quantité des charges transportées a été diminuée d’environ 30%. Aucun effet n’a été observé sur les liposomes contrôle. C’est la première fois qu’il est montré que les ions cl- n’affecte pas la vitesse de transport de la Protéine mais plutôt la quantité de charge totale transportée. L’inactivation de la protéine est Donc plus rapide en présence des ions chlorure. Effet des ions chlorure sur l’activité d’UCP1Le transport a été activé par la création d’un gradient de pH obtenu par l’échange rapide d’une solution de à pH 7 (30 mM Mops pH 7 additionné de 140 mM gluconate de potassium ou 140 mM chlorure de potassium) avec une solution à pH 6 (30 mM Mes pH 6 additionné de 140 mM gluconate de potassium ou 140 mM chlorure de potassium). 27
  • 17. Régulations de l’expression des protéines découplantes de mammifères Plusieurs systèmes hormonaux, facteurs de transcription et kinases sont impliqués dans la régulation de l’expression d’UCP1, : les hormones thyroïdiennes, le système adrénergique, les facteurs de transcription peroxisomes proliferator-activated receptors (PPAR) AMP-activated protein kinase (AMPK). La T3 est capable de se lier au récepteur nucléaire aux hormones thyroïdiennes (TR) pour activer ce dernier. Celui-ci, une fois couplé à un RXR, va se positionner sur les éléments de réponse aux hormones thyroïdiennes présents au niveau des promoteurs des gènes pour favoriser leur transcription Il existe une forte relation entre les hormones thyroïdiennes et la protéine découplanteUCP1. Ainsi, la T3 est impliquée directement dans la régulation de l’expression de l’UCP1 de mammifères
  • 18. . Une augmentation de la prolactine plasmatique et l'abondance récepteur de la prolactine peuvent directement stimuler l'expression de plus de UCP1 chez le fœtus d’un rat Effet de la prolactine est opposé chez l’adulte rat: une administration démunie règlement l’abondance de UCP1 Augmentation des hormones thyroïdiennes plasmatiques et renforcement de la capacité de convertir la thyroxine T4 à l'activité métabolique de tri- iodothyronine (T 3 ) par l'intermédiaire de l' enzyme 5- monodésiodinase est démontré chez un rat exposé au froid Cette activation peut entraîner une augmentation de la T 3 localisée à l'intérieur de l'adipocyte qui serait prévu de mettre { réguler et stabiliser de l’UCP1 ,ainsi l’expression abondance de ce protéine via abondance de T3 sensible à un site du gène(recepteur nucléaire) de l’UCP1
  • 19. Fig. 1. Norepinephrine (NE)-induced thermogenesis in wild-type (WT) and uncoupling protein (UCP)1 knockout (KO) mice
  • 20. BRL:AGONISTE de NE
  • 21. Fig. 3. Effects of chronic CL-316243 (CL) treatment on CL-induced thermogenesis in WT and UCP1 KO mice. Mice were treated with saline (Sal) or CL daily for 6 days (CL-6d). On the 7th day, mice were anesthetized with Avertin, and metabolic rate (V˙ O2) was determined under basal conditions (B) and after stimulation (S) by ip injection of CL (30 nmol). Basal values are averages of the 5-min period before injection, and stimulated values are averages of the 5-min period 20–25 min after injection. Two-way ANOVA indicated significant effects of drug treatment and genotype (P 0.0001) but no significantinteraction. Values are means SE; n 7–9.
  • 22. Autre rôle de la fuite de proton la fuite de protons ne serait pas seulement impliquée dans la thermogenèse. elle pourrait aussi jouer un rôle dans l'élimination des radicaux libres en diminuant le potentiel de membrane de la mitochondrie (Brand, 2000). En effet, la production de radicaux libres est dépendante de la valeur du potentiel de membrane Ainsi, une diminution de 10% du potentiel de membrane résulte en une diminution de 75% du taux de production de radicaux Libres . Récemment, il a été montré que les ROS et leur accumulation dans la matrice mitochondriale étaient des coactivateurs obligatoires des UCPs Quoiqu’il en soit, l’ensemble de ces études suggère que les radicaux libres sont capables de stimuler la fuite de protons induite par UCPs directement et indirectement (via la formation de dérivés lipidiques de peroxydations). Ainsi la stimulation UCPs limiteraient la formation de ROS par la chaîne respiratoire, participant à la détoxification de la matrice mitochondrial
  • 23. Figure 11 : Hypothèses de limitation de la production de ROS par les UCP (A). Les protéines découplantes pourraient être chargées du transport de substrats peroxydés pour les expulser vers l’espace intermembranaire où ils peuvent être neutralisés par dismutation. Cette réaction, consommant des protons, diminuerait le gradient de protons (Echtay et al., 2002). (B). La chaîne respiratoire peut être ralentie par un fort gradient de protons Elle laisse alors s’échapper des électrons vers la matrice où ils forment un radical superoxyde avec les molécules d’O2. Ces radicaux libres vont agir sur les phospholipides membranaires formant, entre autre, du HNE. Le HNE active l’UCP ce qui diminue le gradient de protons et permet à la chaîne respiratoire de réaccélérer produisant ainsi moins de radicaux libres (Brand et al., 2004). CR : chaîne respiratoire ; H+ : proton ; HNE : 4-Hydroxy-2-Nonenal ; O2 : radical superoxyde ; UCP : protéine découplante.
  • 24. UCP1 DANS LE THYMUS Figure 1 Detection of UCP1 protein in thymocytes Immunoblots using the Calbiochem anti-UCP1 peptide antiserum (A) and antibody to the α-subunit of the F1-ATP synthase B) to mitochondria from BAT from cold-acclimated rats and BAT, thymocytes and liver from rats kept at room temperature thymus is not due to contamination of the preparation by BAT. In dissecting out the thymus any BAT is clearly visible and easily removed by dissection. We speculate that mitochondrial UCP1 would have a major bearing on metabolic flux in thymus and predict a
  • 25. La comparaison des profils cellulaires dans le thymus et la rate des souris sauvages avec ceux des UCP 1 souris knock-out, donne une idée sur le niveau du potentiel apoptotique dans les thymocytes de ces souris. Le nombre de cellules de rate ont été réduits environ 3 fois dans souris knock-out UCP 1par rapport aux souris de type sauvage. Une diminution de moitié du nombre de cellules CD8 actives dans le thymus et avec une augmentation significative supplémentaire dans CD4/CD8 dans le thymus des UCP 1 souris knock-out par rapport aux souris de type sauvage. une diminution environ de moitié du nombre de cellules CD8 actives et un doublement du nombre de cellules CD4/CD8 dans la rate des souris knock-out UCP1 par rapport aux souris de type sauvage. Ces différences sont probablement expliqué par un potentiel apoptotique diminué et des niveaux plus élevés d'ATP dans les thymocytes de UCP 1 souris knock-out par rapport à la souche sauvage :contrôles. Donc l’expression constitutif de l’UCP 1 est un facteur dans la détermination de sélection de la population des lymphocytes T chez la souris. Étude récentes montrent des interaction directe entre l’UCP1 et un protéine de cascade apoptotique(Cidea) dans le BAT. Cidea (cell deathinducing DNA fragmentation factor a-like effector A) peut jouer le role d’un regulateur endogène de l’activité d’ UCP1 dans BAT has implications for understanding the role of UCP1 in the thymus
  • 26. Les résultats actuels confirment que UCP1 est uniquement exprimé dans les adipocytes bruns et démontrent que tout signal détecté UCP1 dans le thymus est représenté par les adipocytes bruns qui restent attachés au thymus, même après dissection minutieuse. Que les adipocytes bruns adjacentes à lobes thymiques jouer un rôle dans la physiologie du thymus reste à étudier. Thymus Figure UCP1 analyse immunohistochimique de la souris et du thymus de rat. Thymus de souris (B) et le rat (A, C, D) ont été testés pour UCP1 immunoréactivité. BAT entourant la glande a été positive, mais à la fois le cortex et la médulla du thymus étaient négatifs (B). Les mêmes résultats ont été obtenus avec thymus de plusieurs rats acclimatés au froid (ca). Pas de cellulaire UCP1 coloration a été observée dans le thymus à un grossissement supérieur. (D) L'élargissement de la zone correspondante de C. Bar: AC = 240 um; D = 50 um.
  • 27. thymus BAT: contrôle Tractus gastro-intestinal WAT Figure Utérus thymus ovaires rie n La protéine découplante (UCP1) analyse immun histochimique des tissus de rats acclimatés au froid. Inter scapulaire tissu adipeux brun (BAT) a été utilisé comme contrôle positif pour UCP1 immunoréactivité (A). Le tissu adipeux blanc (WAT) et squelettiques (sk) des muscles dans la même préparation histologique étaient UCP1 négative. Tous les autres tissus analysés étaient également négatifs UCP1. (B) du foie. (C) Tractus gastro-intestinal. (D) du pancréas et de la rate. (E) de l'utérus et des ovaires. (F) du rein. En F, le signal positif est de BAT résiduelle autour du rein. Bar = 240 um.