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UAGRM            ANÁLIS IS INS TRUMENTAL MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS        DE ANÁLISIS
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Métodos espectroscópicos de análisis

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  • Para muchos fines, la radiación electromagnética se representa adecuadamente como un campo eléctrico y otro magnético que están en fase, con oscilaciones sinusoidales en ángulo recto de uno respecto a otro y respecto a la dirección de propagación. La luz se puede considerar como una onda. Para una onda que se mueve en el vacío, su velocidad C, su longitud de onda λ , y su frecuencia ν , están relacionadas de una manera sencilla por: C = λν en el vacío. Cuando pasa a través de cualquier material la velocidad es menor: υ = λν en general
  • Parámetros ondulatorios. En la figura se muestra la amplitud A de una onda sinusoidal como la longitud del vector eléctrico en el máximo de la onda. El tiempo, en segundos, necesario para el paso de sucesivos máximos o mínimos por un punto fijo del espacio se denomina el período p de la radiación. La frecuencia ν es el número de oscilaciones del campo por segundo cuadrado y es igual a 1/p. Otro parámetro e interés es la longitud de onda λ , que es la distancia lineal entre dos puntos equivalentes de ondas sucesivas (por ejemplo, máximos o mínimos) Cuando un átomo o molécula absorbe energía de la luz, absorbe únicamente ciertas longitudes de onda. Para otras longitudes de onda, la sustancia puede ser transparente. De manera similar, cuando un átomo o molécula emite luz, lo hace sólo lo hace a sus longitudes de onda características. A otras longitudes de onda no se produce emisión. En resumen, las longitudes de onda absorbidas y emitidas dependen de la identidad del compuesto. Estas longitudes de onda permanecen iguales pese a la cantidad de analito presente. Sin embargo, la cantidad de luz absorbida o emitida depende de la concentración del compuesto presente en el paso óptico (en casos sencillos).
  • Para que ocurra algún cambio, la energía hv debe ser de la intensidad adecuada, por lo cual las diferentes regiones del espectro electromagnético. Como bien sabemos, la molécula o átomo permanece muy poco tiempo en ese estado, tendiendo a regresar a su estado normal o fundamental de energía mediante procesos de relajación. Esto puede ser mediante una relajación no radiante, proceso que supone la pérdida de energía a través de una serie de pequeñas etapas en la que la energía de excitación se transforma en energía cinética al colisionar con otras moléculas, resultando un pequeño aumento en la temperatura del sistema. También la relajación se puede producir por emisión de radiación fluorescente ( ceden su exceso de energía en forma de fotones). Pero también puede haber descomposición de la especie de la molécula excitada dando nuevas especies. La excitación puede producirse por diversos métodos tales como el bombardeo de electrones u otras partículas elementales, la exposición a chispas de corriente alterna de potencial elevado, el incremento térmico en una arco o en una llama, o la absorción de radiación electromagnética. Las partículas elementales que están muy separadas entre sí, como en el estado gaseoso, se comportan como cuerpos independientes y, a menudo, producen radiación que contiene sólo unas pocas longitudes de onda específicas. Por tanto, el espectro se denomina un espectro discontinuo o de líneas. Por otro lado, un espectro continuo es aquel en el que todas las longitudes de onda están próximas dentro de un intervalo de apreciable. Este tipo de espectro resultan de la excitación de sólidos o líquidos, en los que los átomos están tan apiñados unos respecto a otros que son incapaces de tener un comportamiento independiente o molécula complicadas que tienen muchos estados de energía estrechamente relacionados. La radiación continua que se produce cuando los sólidos se calientan hasta la incandescencia, es característica más de la temperatura de la superficie que de la naturaleza del material del que está compuesta dicha superficie. La radiación de este tipo se denomina radiación de cuerpo negro, cuyo comportamiento se explica mediante 1) la radiación presenta un máximo de emisión a una longitud de onda que varía inversamente con la temperatura absoluta, 2) la energía total emitida por un cuerpo negro por unidad de tiempo y de área, varía con la cuarta potencia de la temperatura absoluta, y 3) la potencia de emisión a una temperatura dada varía inversamente con la quinta potencia de la longitud de onda. Al aumentar la temperatura, los picos de energía se desplazan a longitudes de onda más cortas. Es evidente que se necesitan temperaturas muy altas para que una fuente térmicamente excitada emita como radiación ultravioleta una fracción sustancial de su energía.
  • Pérdidas. Por reflexión como resultado de la diferencia entre los índices de refracción de las interfases, diferencias de temperatura, partículas en suspensión, deshomogeneidades en el medio. Pero la principal razón de la disminución de energía es la absorción total o parcial por parte de las moléculas en solución. Esta ley no tiene excepciones y si cumple tanto para radiaciones poli como monocromáticas.
  • Supuestos: la radiación debe ser monocromática, el espesor es limitado, la concentración es limitada, la radiación incide en ángulo recto sobre las superficies claras, pulidas, uniformes y paralelas de la celda de absorción. K1 depende de landa, de la concentración, de la naturaleza de la muestra y de la naturaleza del solvente. K2 depende de landa, del espesor de la celda, de la naturaleza de la muestra y de la naturaleza del solvente.
  • Ko depende de landa, de la concentración, del espesor de la celda, de la naturaleza de la muestra y de la naturaleza del solvente.
  • Epsilón > E 1% 1cm > absortividad > absorbancia Unidades: cada constante tiene sus unidades pero no se acostumbra a usarlas.
  • Requisitos de una fuente: debe generar un espectro continúo dentro de la región de trabajo, suficientemente intensa y estable (la potencia radiante de una fuente varía de manera exponencial con el potencial de la fuente de alimentación eléctrica. Este problema se elimina en los equipos de doble haz. Permite obtener un espectro continuo en la región de interés (UV, VIS, IR). La instrumentación empleada para el IR tiene ciertas características especiales por lo cual se tratará independientemente. La señal producida debe ser estable. Fuentes para el ultravioleta : Las más empleadas son las lámparas de hidrógeno o de deuterio, las cuales son excitadas a baja presión, produciéndose un espectro continuo entre 180 y 380 nm. Cuando se precisa una fuente más intensa son adecuadas las lámparas de arco llenas de un gas, argón, xenón o mercurio, a alta presión. La lámpara de arco de xenón produce un espectro continuo entre 250 y 600 nm, al pasar una corriente a través de una atmósfera de xenón. Fuentes para el visible : La más empleada es la lámpara de filamento de tungsteno la cual por calentamiento adecuado emite un espectro continuo entre 350 y 750 nm. Las fuentes que emiten unas pocas líneas discretas se usan ampliamente en absorción atómica y en los métodos fluorescentes (vapores de mercurio, de sodio, de cátodo hueco) Fuentes para el IR. Las fuentes para el IR consisten en un sólido inerte que se calienta eléctricamente a una temperatura comprendida entre 1500 y 22000 °C. Como resultado se obtiene una radiación continúa que se aproxima a la del cuerpo negro. El emisor de Nerst está constituido por óxidos de tierras raras, y tiene forma cilíndrica con un diámetro de 1 a 2mm y una longitud de unos 20 mm. Los extremos del cilindro están unidos a unos conductores de platino que permiten el paso de electricidad lo que permite alcanzar temperaturas comprendidas entre 1200 y 2200 °K. La lámpara de Nerst tiene un coeficiente de resistencia muy negativo respecto de la temperatura por lo cual debe calentarse externamente hasta el rojo oscuro para que la corriente sea suficiente como para mantener la temperatura deseada. La fuente globar es una varilla de carburo de silicio que por lo general tiene unos 50 mm de longitud y 6 mm de diámetro. Se calienta también eléctricamente a 1300-1500 °K y tiene la ventaja de poseer un coeficiente de resistencia positivo. Las energías espectrales del globar y de del emisor de Nerst sson semejantes, excepto en la región inferior a 5 micrométros, donde el globar se distingue por tener una mayor energía. La fuente de filamento incandescente es algo menos intensa aunque de mayor vida útil. Consiste en una espiral muy apretada de alambre de nicromo que se calienta por le paso de una corriente eléctrica. Para la región espectral del IRL (>50 micrométros) ninguna de las anteriores fuentes térmicas proporcionan suficiente energía para una detección adecuada. En este caso se utiliza una fuente de arco de mercurio de alta presión. Consiste en un tubo de cuarzo que contiene vapor de mercurio a una presión mayor de una atmósfera. El paso de electricidad de a través del vapor origina una fuente de plasma que proporciona una radiación continúa en la región del IRL. Dentro de las fuentes láser tal vez la de dióxido de carbono es la más usada para determinar sustancias absorbentes en disoluciones acuosas. Este láser sintonizable produce una banda de radiación en el intervalo de 900 a 1100 cm-1 y está constituido por unas 100 líneas discretas y poco espaciadas. La fuente es útil para la determinación de algunas especies de gran interés como el amoniaco, butadieno, benceno, etanol, dióxido de nitrógeno y tricloroetileno.
  • Un selector ideal tiene una máxima potencia de radiación y un ancho de banda efectivo estrecho. Una máxima potencia de radiación es deseable porque permite el paso de una mayor cantidad de fotones a través del selector, dando una señal fuerte con menos ruido de fondo. Un ancho de banda efectivo estrecho proporciona una alta resolución, con rasgos espectrales separados por más de dos veces el ancho de banda efectivo. Generalmente estas dos características están contrapuestas. Las condiciones que favorecen una alta potencia de radiación usualmente proporcionan una menor resolución. La disminución el ancho de banda efectivo mejora la resolución, pero con el costo de un incremento de ruido.
  • Filtros : La selección de la longitud de onda, en algunos casos se hace con filtros los cuales pueden ser filtros de absorción o filtros de interferencia. Con cualquiera de los dos se logra seleccionar un haz de radiación dentro de un intervalo estrecho de longitud de onda, pero desde luego el haz que se aproxima más a la monocromaticidad es el que se selecciona con un buen sistema monocromador. Los filtros se usan para seleccionar bandas en la región visible y funcionan absorbiendo ciertas zonas del espectro. El tipo más usual es un vidrio coloreado o una suspensión de un colorante en gelatina que se coloca entre dos placas de vidrio. Sus características de funcionamiento son bastante inferiores a las de los filtros de interferencia (anchos de banda mayores y menor fracción de luz transmitida) pero son perfectamente útiles para muchas aplicaciones. Los instrumentos que usan filtros de absorción para seleccionar la radiación se denominan fotocolorímetros. Los filtros de interferencia permiten seleccionar la radiación en las regiones UV, VIS e IR.
  • Usualmente son de forma cúbica pero también se usan celdas cilíndricas . La ley de Lambert-Beer se cumple más exactamente cuando se usan celdas cúbicas. Si se emplean las cilíndricas deben ser colocadas de modo que siempre se use el mismo eje óptico. Las celdas empleadas para el UV y el VIS generalmente tienen 1 cm de espesor pero pueden utilizarse de mayor o menor espesor. Los materiales ópticos empleados para su fabricación deben ser transparentes a la radiación a emplear (cuarzo para el UV y vidrio para el VIS). Deben mantenerse escrupulosamente limpias y evitarse que se raye la superficie. El cuarzo y la sílice fundida deben usarse por debajo de 350 nm. Estas dos sustancias son transparentes en la región visible y también en la región infrarroja hasta 3  Los vidrios de silicato pueden usarse en la región entre 350 y 2000 nm. Los recipientes de plástico también se utilizan en la región visible. La sustancia más comúnmente empleada para el IR es el cloruro de sodio cristalino, al igual que Kbr, yoduro de cesio y bromuro de tantalio y tantalio.
  • Los espectros UV y VIS se obtienen en la mayoría de los casos a partir de disoluciones diluídas del analito. Las medidas de absorbancia en el intervalo óptimo se obtienen ajustando de forma adecuada la concentración, o bien el espesor de la cubeta. Lamentablemente esta práctica no es aplicable por lo general a la espectroscopía IR, debido a que no existen buenos disolventes que sean transparentes en toda la región espectral. Entre los disolventes comunes para IR: disulfuro de carbono, tetracloruro de carbono, tetracloroetileno, cloroformo, ciclohexano, dioxano, benceno. Es evidente que no existe un solo disolvente que sea transparente en toda la región del IRM. El agua y los alcoholes se utilizan rara vez, no sólo porque absorben intensamente, sino porque también atacan a los haluros de metal alcalino, que son los materiales más comunes que se utilizan en las ventanas de las cubetas. Por estas razones, es necesario secar los disolventes indicados antes de utilizarlos. Debido a la tendencia de los disolventes a absorber, las cubetas para el IR suelen ser mucho más estrechas (0.1 a 1 mm) que las empleadas en las regiones UV y VIS. Los caminos ópticos en el IR requieren por lo común, concentraciones de muestra de 0.1 a un 10%. Con frecuencia, las celdas son desmontables, con espaciadores de teflón que permiten variar la longitud de camino óptico. Líquidos puros. Cuando la cantidad de muestra es pequeña o cuando no se dispone del disolvente apropiado, es habitual obtener los espectros del líquido puro. Para ello, una gota del líquido se coloca entre dos ventanas para IR que se mantienen unidas por capilaridad. El espesor de la película formada es de 0.01mm o menos y el espectro es satisfatorio, reproducible y muy satisfactorio para investigaciones cualitativas. Sólidos. Los espectros de sólidos que no pueden disolverse directamente en un solvente para IR, se obtienen con frecuencia dispersando el analito en una matriz líquida o sólida y analizando la mezcla resultante. Estas técnica requieren que el tamaño de partícula del sólido suspendido sea menor que la longitud de onda del haz infrarrojo porque de lo contrario se pierde una gran cantidad de radiación por dispersión. Uno de los métodos utilizados para preparar la mezcla a analizar consiste en triturar de 2 a 5 mg de muestra finamente pulverizada ( > 2 μ m) en presencia de una o dos gotas de un aceite pesado de un hidrocarburo (Nujol). Si es probable que las bandas del hidrocarburo interfieran, se puede usar Fluorolube, un polímero halogenado. La mezcla resultante se examina luego entre dos placas planas de sal en forma de una delgada película. En una segunda técnica, se parte de 1 mg de la muestra finamente triturada que se mezcla íntimamente con unos 100 mg de KBr desecado. La mezcla se comprime luego en un troquel especial a una presión de 700 a 1000 kg/cm2, para obtener un disco transparente.
  • Consiste de una serie de fotodiodos posicionados sobre un cristal de silicio. Cada uno de los diodos tiene una capacitor específico, los cuales tienen un determinado nivel de carga. Cuando los fotones penetran el silicio, se generan cargas eléctricas transportadoras libres que descargan el capacitor. El capacitor es recargado a intervalos regulares de tiempo. La cantidad de carga necesaria para recargar el capacitor representa el número de fotones que son detectados por cada diodo, los cuales son proporcionales a la luz incidente. Midiendo la variación de la intensidad de la luz sobre el rango entero de longitudes de onda, podemos obtener el espectro de absorción de las sustancia. El número de diodos varía según el instrumento pero situarse en unos 300. La luz policromática que viene de la fuente pasa a través del área de la muestra y se focaliza sobre la entrada del slit de un policromador. El policromador dispersa la luz sobre el arreglo de diodos, en el cual cada diodo está destinado a medir una banda estrecha del espectro. El ancho de banda de la luz detectada por un diodo está relacionado con el tamaño del slit de entrada del policromados y el tamaño físico del diodo. Cada diodo es efectivamente equivalente al slit de salida de un monocromador.
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    1. 1. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS DE ANÁLISIS
    2. 2. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL El proceso analítico general MUESTRA ETAPAS BÁSICAS DEL Operaciones PROCESO ANALÍTICO previas Medición de la propiedad analítica Adquisición y tratamiento de datos RESULTADOS27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 2
    3. 3. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL El proceso analítico general Análisis, determinación y medida Análisis : proceso que proporciona información física o química acerca de los componentes de una muestra o de la propia muestra Analitos : Componentes que interesan de una muestra. Matriz: Todos los componentes de una muestra que no son analitos Determinación : Análisis de una muestra para identificar la identidad, concentración o propiedades del analito. Medida : Determinación experimental de las propiedades químicas o físicas de una analito27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 3
    4. 4. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL El proceso analítico general Técnicas, métodos, procedimientos y protocolosTécnica : Principio físico o químico que puede emplearse para analizar una muestra.Método : Medio para analizar una muestra a fin de hallar un analito dado en una matriz específicaProcedimiento : Instrucciones escritas que señalan la forma de analizar una muestra.Protocolo: conjunto de instrucciones escritas especificadas por un organismo para analizar una muestra27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 4
    5. 5. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Clasificación de los métodos analíticosos métodos analíticos producen inf ormación químic INFORMACION ANALITICA: Declaración relacionada con cualquier propiedad química, física, o biológica denominada propiedad analítica, analítica producida en conexión con la información química del material analizado 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 5
    6. 6. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Clasificación de los métodos analíticos P unto de vista histórico métodos clásicos e instrumentales27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 6
    7. 7. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Clasificación de los métodos analíticos Métodos clásicos Gravimetría Volumetría Métodos instrumentales Espectroscópicos Térmicos Electrométricos Separación27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 7
    8. 8. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Elección de un método analítico1. ¿Qué exactitud se requiere?2. ¿Cuántas muestras se tiene?3. ¿Cuál es el intervalo de concentración del analito?4. ¿Qué componentes de la muestra podrían causar interferencia?5. ¿Cuáles son las propiedades físicas y químicas de la matriz de la muestra?6. ¿Cuántas muestras se analizarán?27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 8
    9. 9. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Calibración de métodos instrumentales • Comparación con estándares • Calibración de un estándar externo • Métodos de adición estándar • Método del patrón interno27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 9
    10. 10. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Conceptos básicos de espectroscopía 1. La luz y el espectro electromagnético27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 10
    11. 11. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL • Onda Electromagnética • Radiación electromagnética • Energía de radiación • Espectro electromagnético • Unidades27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 11
    12. 12. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Onda electromagnética E M27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 12
    13. 13. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Energía de la Radiación velocidad frecuencia A λ Número de onda h= = 6,6262 . 10 -34 joule . segundo , Longitud de ondaEnergía es la constante de Planck.asociada aun fotón E = hν E = hC λ 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 13
    14. 14. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL CARACTERÍSTICAS DE LAS ONDAS nodo27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 14
    15. 15. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Unidades : -10 Amgstrom : Aº = 10 m Nanómetro : nm = 10 - 9 m µ m = 10 - 6 -4 Micrómetro : m = 10 cm -1 Número de onda, ν: cm27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 15
    16. 16. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Problemas• Calcular la energía y la frecuencia de la luz con la longitud de onda de 2.0 x 105 cm• Cuál es la frecuencia de la luz verde con una longitud de onda de 500 nm
    17. 17. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Espectro electromagnético Longitud de Onda Micro- Ondas de Rayos γ Rayos X ondas radio 0.01-0.1Å 1-10Å 0.02-300cm 3-300m Energía27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 17
    18. 18. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Espectro electromagnético Longitud de Onda Vacio ultravioleta Ultravioleta Visible Infrarrojo 10-2000Å 200-380nm 385-750nm 0.75-200µm Energía27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 18
    19. 19. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Espectro electromagnético Infrarrojo Longitud de Onda 0.75-200µm IRC : 0.75 – 2.5 µm (13333-4000 cm-1) IRM : 2.5 – 50 µm (4000-200 cm-1) IRL : 50 – 1000 µm (200-10 cm-1) Energía27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 19
    20. 20. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Conceptos básicos de espectroscopía 2. Interacción de la radiación con la materia27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 20
    21. 21. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Interacción de la radiación con la materia Cuando un haz de luz incide sobre un medio puede ser transmitido (refractado), reflejado, difundido (sobre una superficie rugosa o por pequeñas partículas), absorbido o puede provocar la emisión de luz (normalmente en una frecuencia distinta). El color y el brillo son algunas de las sensaciones que resultan de estos fenómenos en el rango de frecuencias del espectro visible, pero existe instrumentación para estudiarlos en un amplio margen del espectro electromagnético27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 21
    22. 22. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Interacción de la radiación con la materiaRefracción y reflexiónCuando un haz luminoso llega a lasuperficie que separa dos mediosdistintos, parte del mismo es reflejadohacia el medio de procedencia, y parterefractado hacia el otro medio. Si lasuperficie que separa ambos medios escompletamente plana y sin rugosidades,los fenómenos tienen lugar siguiendo lageometría prevista en las leyes deDescartes 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 22
    23. 23. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Interacción de la radiación con la materia Difusión Este proceso tiene lugar debido a la presencia de partículas en suspensión en un medio transparente (el caso del humo de un cigarrillo, por ej), o por vibraciones de las moléculas que forman el propio medio, en cuyo caso la intensidad de la radiación difundida depende de las interacciones de estas moléculas entre ellas, y por tanto el fenómeno suele ser de mayor intensidad en gases que en sólidos27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 23
    24. 24. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Interacción de la radiación con la materiaAbsorciónLa absorción de las ondas electromagnéticas requiere considerar que loselectrones ocupan orbitales con niveles discretos de energía, separadosentre ellos por cantidades discretas de energía.Cuando un medio es alcanzado por una onda electromagnética formada porradiaciones de diversas energías, alguna de ellas puede coincidir con la deuno de los saltos energéticos posibles entre un nivel completamenteocupado por electrones y uno vacío o parcialmente ocupado, entonces unelectrón es excitado al nivel energético superior y la energía de la frecuenciacorrespondiente, absorbida 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 24
    25. 25. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Interacción de la radiación con la materiaEmisiónLa emisión de luz por parte de un medio puede ocurrir si cierta energía esabsorbida por los electrones de los átomos del medio considerado, de modoque algunos de éstos son promovidos a niveles superiores y dejan un huecoen su posición original. En estas condiciones la configuración del átomo esinestable y electrones de niveles energéticos superiores pasan aocupar el hueco, liberando parte de su energía en forma de radiaciónelectromagnética de la energía correspondiente al salto efectuado 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 25
    26. 26. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Interacción de la radiación con la materia27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 26
    27. 27. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Clasificación básica de los métodos ópticos Métodos espectrales Métodos no espectrales Moleculares Atómicos Turbidimetria Nefelometria Refractometria Polarimetria Absorción UV-vis IR Absorción atómica Fluorescencia Emisión atómica Fosforescencia Rayos X (A,E)27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 27
    28. 28. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALClasificación básica del los métodos ópticos en función al tipo de interacción radiación- materia Espectrofotometría UV-vis Absorción de la Espectrofotometría IR Radiación Espectrofotometría RX Emisión atómica Emisión de la Fotometria de llama Radiación Fluorescencia Refracción de la Refractometría Radiación Rotación de la Polarimetría Radiación Dispersión de la Turbidimetría Radiación Nefelometría27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 28
    29. 29. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Conceptos básicos de espectroscopía 3. Origen de los espectros moleculares27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 29
    30. 30. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Origen de los espectros moleculares Las moléculas de una sustancia poseen una energía relativa dada, esto es, dada pueden existir sólo en niveles de energía fijos. Ello se debe a una serie de fijos factores, de los cuales son de nuestro interés los siguientes: 1) Energía debida a los niveles electrónicos. 2) Energía debida a vibraciones entre los átomos que la componen. 3) Energía debida a rotación molecular. Un espectro de absorción es el resultado de que un átomo o molécula se excita a un nivel de energía superior mediante la absorción de un cuanto de energía.27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 30
    31. 31. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Excitación : E E1∆ E q +hν 2 -hν1 Eo ∆ E = E1 Eo27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 31
    32. 32. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL transiciones energéticas ν2 λ2 E2energía uv visible λ1 ν E1 ν3 λ3 E3 ν4 λ4 E4 IRM IR hc E=hν = estado estado estado λ electrónico vibracional rotacional 32 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D
    33. 33. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL transiciones energéticas27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 33
    34. 34. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Conceptos básicos de espectroscopía 3. Clasificación de los métodos espectroscópicos de análisis27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 34
    35. 35. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Métodos espectroscópicos de análisis Radiación Efecto Rayos X y cósmicos Ionización de moléculas UV-visible Transiciones electrónicas entre los OA y OM Infrarrojo Deformación de los enlaces químicos microondas Rotaciones de los enlaces químicos radiofrecuencias Transiciones de spín electrónico o nuclear en los átomos de la molécula27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 35
    36. 36. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL TÉCNICA ESPECTROSCÓPICA INFORMACIÓN OBTENIDA Estructura total de la molécula incluida la estereoquímica de la Rayos X misma a partir de las posiciones relativas de los átomos. Existencia de cromóforos y/o conjugación en la molécula a partir Ultravioleta-Visible de las absorciones observadas. Grupos funcionales a partir de las absorciones observadas. Infrarrojo Espectrometría de Fórmula molecular y subestructuras a partir de los iones masas (*) observados. Grupos funcionales, subestructuras, conectividades, Resonancia magnética estereoquímica, etc. a partir de datos de desplazamiento químico, nuclear áreas de los picos y constantes de acoplamiento observadas(*) No es una técnica espectroscópica en el sentido que estamos viendo pues no existe irradiación electromagnética de lasustancia y no se produce absorción de dicha radiación. 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 36
    37. 37. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Conceptos básicos de espectroscopía 3. Leyes de la espectroscopía27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 37
    38. 38. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Espectroscopía basada en absorción Leyes de la Fotometría Primera Ley de Lambert : Pt = k Po Po Pt h T = Pt / Po27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 38
    39. 39. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Espectroscopía basada en absorción Leyes de la Fotometría Segunda Ley de Lambert : h = cte. - k1h Pt = Po e Ley de Beer : C = cte. - K 2c Pt = Po e27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 39
    40. 40. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Espectroscopía basada en absorción Leyes de la Fotometría Ley de Lambert - Beer: Pt = Po e - K oc h log Pt = Kch Po A = log Po A=Kch Pt27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 40
    41. 41. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Espectroscopía basada en absorción potencia del haz antes de atravesar el blanco absortividad concentración absorbancia P0 molar de lastotal medida a la longitud de AT,λ = log = εhc especies P absorbentes onda λ camino óptico potencia del haz P luego de = Transmitancia (T) A = -logT P0 atravesar la muestra 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 41
    42. 42. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Espectroscopía basada en absorción Leyes de la Fotometría Ley de Lambert - Beer: A= Kch A= ach C en g/L h en cm A= ech C en mol/L h en cm 1% A= Ecm c h C en g/% h en cm A = 2 - log (% T)27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 42
    43. 43. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Espectroscopía basada en absorción Definiciones Definiciones a : absorbancia de una disolución de concentra- absorbancia de una disolución de concentra- ción gramo por litro en celda de un ción gramo por litro en celda de un centímetro centímetro e : absorbancia de una disolución de concentra- absorbancia de una disolución de concentra- ción mol por litro en celda de un ción mol por litro en celda de un centímetro centímetro 1% Ecm : absorbancia de una disolución de concentra- absorbancia de una disolución de concentra- ción gramo por 0.1 litro en celda de un ción gramo por 0.1 litro en celda de un centímetro centímetro27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 43
    44. 44. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALLa representación gráfica correspondiente a absorbancia ytransmitancia en un gradiente de concentraciones es la siguiente: Concen tración27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 44
    45. 45. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Espectroscopía basada en absorción Propiedad aditiva de la absorbanciaLa absorbancia total de una muestra a una longitud de onda determinada es la suma delas absorbancias de cada uno de sus constituyentes a dicha longitud de onda. 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 A 0,6 0,4 0,2 0,0 0 200 400 600 800 longitud de onda (nm) ¡esto obliga a seleccionar muy bien la λdel analito! 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 45
    46. 46. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Espectroscopía basada en absorción Absortividad molar depende de: • características del disolvente • especie absorbente • longitud de onda de trabajo Problema Una disolución de un analito de concentración 5.00 x 10-4M es puesta en una celda de muestras la cual tiene una longitud de 1.00 cm. Cuando se mide a una longitud de 490 nm, la absorbancia de la solución es 0.338. ¿Cuál es la absortividad molar del analito a esta longitud de onda? Solución:27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 46
    47. 47. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Problema Las absorbancias de las disoluciones que contienen Cr como Cr2O72- en 1.0 M de H2SO4se midieron a 440 nm en una celda de 1 cm. Se obtuvieron los siguientes resultados: Conc. de Cr, Abs. μg/mL a 440 nm 10.00 0.034 25.00 0.085 50.00 0.168 75.00 0.252 100.00 0.335 200.00 0.669Determine la absortividad del dicromato (Lg-1cm-1) y la absortividad molar en (Lmol-1 cm-1) a 440 nm27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 47
    48. 48. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Wavelength, nm Psolvent Psolution ProblemaLos datos siguientes se tomaron de un 350 0.002689 0.002560espectrofotómetro de diodos en serie en un 375 0.006326 0.005995experimento para medir el espectro del 400 0.016975 0.015143complejo Co(II)-EDTA. La columna llamada 425 0.035517 0.031648Psolución es la señal relativa que se obtiene 450 0.062425 0.024978con una disolución de la muestra en la 475 0.095374 0.019073celda después de la sustracción de la señal 500 0.140567 0.023275oscura. La columna Psolvente es la señal de 525 0.188984 0.037448referencia que se obtiene cuando sólo está 550 0.263103 0.088537el solvente en la celda después de la 575 0.318361 0.200872sustracción de la señal oscura. Determine 600 0.394600 0.278072la transmitancia a cada longitud de onda y 625 0.477018 0.363525 650 0.564295 0.468281la absorbancia en cada longitud de onda. 675 0.655066 0.611062Grafique el espectro del compuesto 700 0.739180 0.704126 725 0.813694 0.777466 750 0.885979 0.863224 775 0.945083 0.921446 800 1.000000 0.977237 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 48
    49. 49. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Limitaciones de la ley de Lambert- BeerDe acuerdo a la ley de Lambert-Beer, una curva de calibración de absorbancia versusla concentración del analito en una serie de soluciones estándar debe ser una recta,con ordenada en el origen en O y una pendiente ab o εb. En muchos casos, sinembargo, se encuentran curvas de calibración no-lineales. Estas desviaciones de la linealidad están divididas en 3 categorías: Fundamentales, químicas e instrumentales27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 49
    50. 50. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Limitaciones de la ley de Lambert- Beer La mayor parte de las especies cumplen con la ley en un determinado intervalo de concentraciones. Fuera de él, experimentan desviaciones positivas o negativas. Esto se observa bien en el calibrado: absorbancia respuesta debida a la autoabsorción o a la luz escasa que atraviesa la cubetarespuesta del blanco,interferencias o escasasensibilidad concentración Es preciso asegurar que se está trabajando en el intervalo lineal!! 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 50
    51. 51. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Limitaciones de la ley de Lambert- Beer selección de la longitud de onda de trabajo banda A banda CA A banda A banda Bbanda C banda B λ concentración Se debe de procurar medir las absorbancias en el entorno más próximo a la λ max. de absorción en el espectro (se minimizan errores) y se logran máximas sensibilidades. Midiendo lejos de ese punto de máxima absorción: pequeñas variaciones en la medida se traducen en grandes errores.27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 51
    52. 52. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Limitaciones de la ley de Lambert- Beer Es conveniente ajustar el intervalo óptimo de transmitancias en las que el error de concentración es mínimo. Es fácilmente demostrable que calibrando concentraciones que supongan un 20-80% de transmitancia, el error es mínimo. pequeños ∆ C ocasionan grandes ∆ %Terrorrelativo pequeños ∆ %T ocasionan grandes ∆ C %T concentración 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 52
    53. 53. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Conceptos básicos de espectroscopía 4. Componentes básicos de los instrumentos espectroscópicos27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 53
    54. 54. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos 3 2 4 1 1. Fuente 6 2. Selector 3. Muestra A 5 4. Detector 5. Transductor 6. Registro λ 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 54
    55. 55. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos Fuentes UV : lámpara de cuarzo- hidrógeno lámpara de cuarzo - deuterio 200 - 350 nm VIS : filamento de tungsteno 350 - 750 nm IR : emisor de Nerst globar filamento incandescente arco de mercurio fuentes láser 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 55
    56. 56. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos Fuentes de radiación electromagnética 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 56
    57. 57. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos Fuentes comunes de radiación electromagnética en espectroscopía Fuentes de energía térmica Las fuentes de energía térmica más comunes son llamas y plasmas. Las llamas se originan por combustión de un combustible y un oxidante tales como acetileno y aire, con lo cuál se alcanzan temperaturas entre 2000 y 3400 K. Los plasmas, los cuáles están a altas temperaturas, son gases ionizados que proveen temperaturas entre 6000 y 10000 K.27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 57
    58. 58. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos Fuentes comunes de radiación electromagnética Fuentes de energía químicaLas reacciones exotérmicas pueden también servir como fuente de energía. Enquimioluminiscencia, el analito es elevado a un estado de alta energía por mediode una reacción química, emitiendo radiaciones características cuando retornaal estado de baja energía.27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 58
    59. 59. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos 3 2 4 1 1. Fuente 6 2. Selector 3. Muestra A 5 4. Detector 5. Transductor 6. Registro λ 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 59
    60. 60. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos Selección de la longitud de ondaUn selector de longitud de ondadeja pasar una banda estrecha deradiación caracterizada por unalongitud de onda nominal, un da d s ne n t Iancho de banda efectivo y una imáxima potencia de radiación. Elancho de banda efectivo se definecomo el ancho de la banda a la Long. de onda Anchodemitad de la máxima potencia de banda Características espectrales de un sistemaradiación selector de longitud de onda27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 60
    61. 61. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos Selección de la longitud de onda Ancho de banda efectivo= 0.25 nm Ancho de banda efectivo= 2.0 nm Ancho de banda efectivo= 1.0 nm Ancho de banda efectivo= 4.0 nm27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 61
    62. 62. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos Selección de la longitud de onda Para análisis cualitativo, la resolución es generalmente más importante que la máxima potencia de radiación; así, pequeños anchos de banda efectivos son deseables. En análisis cuantitativo una alta potencia de radiación es usualmente deseable27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 62
    63. 63. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos Selector : filtro, prisma o rejilla rendija Rejilla Filtro Prisma de difracción 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 63
    64. 64. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Monocromadores espejo espejo colimador focalizador con red de difracción λ2 λ1 rendija de rendija de entrada elemento salida dispersante con prisma λ2 λ1 lente colimadora lente focalizadora27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 64
    65. 65. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 65
    66. 66. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos 3 2 4 1 1. Fuente 6 2. Selector 3. Muestra A 5 4. Detector 5. Transductor 6. Registro λ 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 66
    67. 67. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos Area de la muestra : celdas UV : cuarzo, sílice VIS : vidrio, cuarzo, sílice IR : cloruro de sodio, bromuro de potasio, yoduro de cesio27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 67
    68. 68. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos Celda para gases en IR :27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 68
    69. 69. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos Celda desmontable para IR :27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 69
    70. 70. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos 3 2 4 1 1. Fuente 6 2. Selector 3. Muestra A 5 4. Detector 5. Transductor 6. Registro λ 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 70
    71. 71. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos Detectores : Al final la luz seleccionada tiene que ser detectada y cuantificada. *Esto se consigue con el empleo de detectores cuyo cometido es convertir la respuesta del instrumento en una señal medible. *Dependiendo del tipo de luz con el que se trabaja existen distintos tipos de detectores:  De fotones (fotoeléctricos) celda fotovoltaica (VIS) fototubo (UV-VIS) fotodiodos de silicio  De calor (térmicos) termopar termocupla neumático27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 71
    72. 72. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos FOTOTUBOS Y FOTOMULTIPLICADORES Están basados en el efecto fotoeléctrico, en el que la incidencia de un haz fotónico sobre un metal es capaz de generar energía eléctrica FOTOTUBO colector En el caso de los fotomultiplicadores, la señal se amplifica mediante el uso de FOTOMULTIPLICADOR diodos en serie. 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 72
    73. 73. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos En la actualidad es el detector espectrofotométrico mas utilizado acoplado a un sistema cromatográfico líquido 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 73
    74. 74. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos Requisitos de los detectores deben responder a un amplio rango de longitudes de onda deben dar respuesta rápida deben ser sensibles a bajos niveles de radiación deben producir señal eléctrica fácilmente amplificable deben tener bajo nivel de ruido la señal debe ser proporcional a la potencia radiante 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 74
    75. 75. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos 3 2 4 1 1. Fuente 6 2. Selector 3. Muestra A 5 4. Detector 5. Transductor 6. Registro λ 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 75
    76. 76. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicosLa señal eléctrica generada por el transductor es enviada a un procesador deseñal donde se muestra de la forma más conveniente para el analista. Elprocesador de señal también puede ser usado para calibrar la respuesta deldetector, para amplificar la señal del detector, para eliminar el ruido porfiltración o por transformación matemática de la señal. 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 76
    77. 77. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTALComponentes básicos de los instrumentos espectroscópicos Procesador de señal y lectura Es el último componente básico de instrumentación Todo espectrofotómetro ha de disponer de: 1. Sistema de amplificación propia que produzca una señal medible 2. Un sistema procesador de la señal, que permita eliminar, promediar datos, proporcionar salida de lectura, dirigir la salida de la señal..etc 3. Una salida de la señal: digital,registrador..etc 4. Tener cierta capacidad de procesar números /FTIR27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 77
    78. 78. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Limitaciones instrumentales27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 78
    79. 79. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Limitaciones instrumentales Especificaciones y parámetros óptimos de trabajo Se denomina exactitud y reproducibilidad fotométrica a la exactitud de las determinaciones de transmitancia o absorbancia y a la reproducibilidad de las mismas respectivamente. La exactitud y reproducibilidad de longitud de onda en general son sumamente importantes en determinaciones cualitativas porque afectan la certeza del dato de la longitud de onda del máximo o mínimo espectral y la posibilidad de su comparación con otros espectros, particularmente si se trata de sustancias con máximos o mínimos próximos a) el ancho de banda espectral (que gobierna la resolución); b) la luz espuria («stray light» o «luz dispersa»); c) la relación señal a ruido; d) la respuesta y energía.27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 79
    80. 80. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Limitaciones instrumentalesAncho de bandaespectralCuanto más estrecho seaeste rango más cerca seestaría, en principio, delvalor real, 27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 80
    81. 81. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Limitaciones instrumentales Luz espuria o parásitaEn general, esta radiación «contaminante» no deseada, que se denominaconsecuentemente luz espuria («stray light», luz dispersa o luz falsa) es sólouna pequeña cantidad respecto de la radiación del intervalo deseado o «luzgenuina», si el espectrofotómetro está en condiciones razonablemente buenas.Por ello bajo condiciones normales, no muy severas, los errores debidos a la luzespuria no son muy graves, pero hay situaciones en las que el error ocasionadopuede ser de consideración.27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 81
    82. 82. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Limitaciones instrumentales Luz espuria27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 82
    83. 83. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Limitaciones instrumentales Luz espuria o parásita27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 83
    84. 84. UAGRM ANÁLIS IS INS TRUMENTAL Limitaciones instrumentales Luz espuria o parásita Se aprecia la señal del detector en función de la real longitud de onda (curva superior). Si la muestra absorbe fuertemente en la zona de longitudes de onda seleccionada, como se representa en la segunda curva, al detector llegará muy poca luz «genuina» y, por lo tanto, una cantidad relativamente grande de luz espuria, lo que se ilustra en la figura inferior. El resultado naturalmente es una señal detectada total mayor que la que correspondería, esto es, error por defecto en absorbancias (y por tanto en concentración). Supongamos que la muestra ha absorbido 99% de la luz «genuina», o sea, pasa un 1% (absorbancia 2,0). Si la luz espuria del espectrofotómetro en esa zona es de 0,5%, al detector llega la suma de ambas, 1,5%, lo que significa 50% de error en transmitancia, si bien sólo menos de un 18% en términos de absorbancia o concentración.27/03/13 Luis Adolfo Mercado R., Ph.D 84
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