1. PCR
La reacción en cadena de la polimerasa,
conocida como PCR por sus siglas en inglés
(Polymerase Chain Reaction), es una técnica
de biología molecular desarrollada
en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es
obtener un gran número de copias de un
fragmento de ADN particular, partiendo de
un mínimo; en teoría basta partir de una
única copia de ese fragmento original, o
molde.
2. Aplicaciones
La PCR tiene multitud de aplicaciones:
Permite detectar y controlar fragmentos de ADN de
interés (técnica de clonaje, recombinación dirigida)
Medicina: Como herramienta de diagnosis de
especies que provocan un cuadro infeccioso y en el
diagnóstico de enfermedades hereditarias.
Paleontología, antropología biológica y ciencias
forenses: permite recuperar las escasas cantidades de
DNA que aun no se ha degradado.
Estudios evolutivos: establecimiento de relaciones
filogenéticas de diferentes especies.
3. Identifica con una muy alta
probabilidad, virus o bacterias causantes
de una enfermedad, identificar personas
(cadáveres) o hacer investigación
científica sobre el ADN amplificado.
Estos usos derivados de la amplificación
han hecho que se convierta en una
técnica muy extendida, con el
consiguiente abaratamiento del equipo
necesario para llevarla a cabo.
4. Esta técnica se fundamenta en la
propiedad natural de las ADN
polimerasas para replicar hebras de
ADN, para lo cual emplea ciclos de altas
y bajas temperaturas alternadas para
separar las hebras de ADN recién
formadas entre sí tras cada fase
de replicación y, a continuación, dejar
que vuelvan a unirse a las polimerasas
para que vuelvan a duplicarlas
5. La PCR consiste en la amplificación de
fragmentos de DNA mediante el uso de la
enzima DNA polimerasa que tiene capacidad
para sintetizar nuevas cadenas de DNA
mediante la incorporación de bases
nucleotídicas, a partir de una secuencia corta
conocida (cebador o primer) que hibrida de
forma complementaria con uno de los
extremos de la hebra. El crecimiento de la
nueva hebra se realiza en sentido 5’ a 3’.
6. Para realizar la técnica se necesitan:
Los 4 dNTP para polimerizar nuevo ADN.
Dos cebadores , de 6 a 40 nucleótidos para el inicio la
reacción. Delimitan la zona de ADN a amplificar.
Iones divalentes. Se suele usar Mg2+ como MgCl2. Actúan
como cofactores de la polimerasa.
Iones monovalentes, como el K+.
Una solución tampón de pH adecuado para el
funcionamiento de la ADN polimerasa.
ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con
temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es
la polimerasa Taq).
ADN molde, región de ADN que se va a amplificar.
Termociclador.
7. Inicio
Este paso lleva la reacción hasta una T0 de 94-98 °C (ó
98 °C si se está usando una polimerasa termoestable
extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos.
Desnaturalización
Separación las dos hebras del ADN (94-95 °C). La
temperatura a la cual se decide realizar la
desnaturalización depende, por ejemplo, de la
proporción de G+C que tenga la hebra, como también
del largo de la misma.
8. dos cebadores
Esta técnica utiliza dos cebadores
(oligonucleótidos) de unos 20 pares
de bases de longitud, sintetizados por
métodos químicos y cuyas secuencias
corresponden a los extremos de las
cadenas del ADN que se quiere
reproducir.
9. El ADN que hay que multiplicar
El ADN que hay que multiplicar es
calentado a 94° C: El calor separa las
ambas cadenas. La temperatura es
disminuida para alcanzar la
temperatura de "annealing" por los
cebadores. Entonces, cada cebador se
fija a una sola cadena de ADN. En este
momento interviene ADN pol.
10. La ADN pol
La ADN pol alarga la extremidad 3 ' de los
cebadores utilizando dNTPs. Se forman dos
cadenas complementarias dando lugar a
dobles cadenas de ADN. Este proceso repetido
varias veces, reacción en cadena, permite
obtener cantidades importantes del ADN
original.
Para cada pareja de primers, hay que también
medir la concentración del ión Mg++.
11. Las etapas de la reacción
1. La separación del ADN:
El primero es la separación total
(fusión) de las dos cadenas que
forman la molécula de ADN que se
quiere amplificar. Para hacerlo
calentamos La solución que contiene
el ADN a 94 ° C.
Ambas cadenas obtenidas servirán de
plantilla a las reacciones que siguen.
12. 2. Hibridación de los cebadores: "annealing"
Calculamos una " temperatura de base ", con la
ayuda de una fórmula o de ábaco. Sometemos
a un test luego la temperatura que hay que
utilizar aumentando 3 en 3 grados el valor de
base: para cada una de estos temperatura
efectuamos un PCR. Escogido la temperatura
que da más ADN. La temperatura óptima debe
ser determinada con el termociclador que
servirá luego.
13. Las ADN polimerasas termoestables
Para efectuar una PCR, se deben utilizar ADN
polimerasas termoestables. La Taq DNA pol por
ejemplo fué aislada de la bacteriaThermus
aquaticus que habita en medios acuáticos
calientes de temperaturas de alrededor de
70°C. Esta polimerasa funciona de manera
óptima a 72°C. La vida media de ésta enzima
calentada a 96°C es de 40 minutos.
14. Taq DNA Polimerasa es obtenida en E. coli a
partir de la expresión de un plásmido
portador del gen de Thermus aquaticus.
Es una enzima termoestable que cataliza la
polimerización de nucleótidos en la dirección
5’-a-3’ a 70-74 ºC y exhibe una vida media de
30-45 minutos a 95 ºC. Esta enzima posee
actividad polimerasa y exonucleasa en la
dirección 5’-3' pero carece de actividad
exonucleasa en la dirección 3'-5' (prueba de
lectura). La enzima es capaz de amplificar
productos de hasta 5 kb de longitud.
15. Alineamiento o unión del cebador
O hibridación del cebador, es decir, el cebador se
unirá a su secuencia complementaria en el ADN
molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a
40-68 °C durante 20-40 s.
Los puentes de hidrógeno sólo se forman cuando
la secuencia del cebador es muy similar a la
secuencia del ADN molde. La polimerasa se une el
híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza
a sintetizar ADN.
Los cebadores actuarán como límites de la región
de la molécula que va a ser amplificada.
16. Extensión o elongación de la cadena
La polimerasa, toma el ADN molde y sintetiza la
cadena complementaria a partir del cebador
para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa
añade los dNTP complementarios en dirección
5'→ 3', del final de la hebra de ADN creciente
(la cual se extiende).
La To depende de la ADN polimerasa que
usemos. Para la Taq, está en 75-80 °C
(comúnmente 72 °C).
En su temperatura óptima, la polimerasa de
ADN polimerizará mil bases en un minuto.
