ICSA17 - Reações de Imunoprecipitação

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Aula Imunoprecipitação

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ICSA17 - Reações de Imunoprecipitação

  1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO TEIXEIRA, A.C.O.; Ferreira, M.A.S.V. e Marques, A.S.A.. Detecção de Erwinia psidii via enriquecimento em extrato de folhas de goiabeira e imunodifusão radial dupla. Tropical Plant Patology, vol. 33, nº 3. Brasilia, Junho de 2008. Trabalho realizado pelo Mestrando em Ciências Animais nos Trópicos Dan Loureiro Nascimento sob orientação do Prof. Dr. Ricardo Wagner Dias Portela do Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular (LABIMUNO). Atualizado em Fevereiro de 2011.
  2. 2. http://www.analiselaboratorios.com.br/imagem/prodts/014.jpg
  3. 3. • Teste utilizado para detectar a presença de anticorpo (ac) específicos em fluidos corporais •Possui boa especificidade, porém apresenta falhas de sensibilidade •A formação do complexo ag/ac e sua precipitação permite a visualização do teste •Facilidade de confecção do teste • Antígeno e anticorpo são colocados em meio sólido ou líquido, interagem e precipitam formando uma linha de precipitação, que indica a presença do anticorpo no soro.
  4. 4. • Utiliza-se, em geral, uma placa de Petri, lâmina de microscopia ou placa de poliestireno onde se adiciona o gel contendo ou não antígeno, •O gel geralmente é composto de agarose ou ágar nobre (a depender do teste e o tipo de malha e afinidade eletrônica que o mesmo exige). Depois de preparado e colocado na placa o gel é perfurado e nestes poços anticorpo e/ou antígeno são colocados, de onde se difundirão. •Na região onde o antígeno e o anticorpo se encontrarem (zona de precipitação) formar-se-á uma linha de precipitação que indica a positividade da amostra e/ou controle, • É um método qualitativo (na medida em que indica um resultado através da presença ou não das zonas de precipitação).
  5. 5. o Elementos necessários para a realização: • Gel de Agarose ou Ágar (o gel pode ser impregnado com Ac ou não a depender do tipo de imunodifusão), • Antígeno purificado (imunodifusão dupla), •Anticorpo purificado (controle positivo), • Amostras a serem testadas, • Placa de poliestireno, Petri, ou lâmina de microscopia, •Cuba de eletroforese horizontal.
  6. 6. o Elementos necessários para a realização: http://eximlab.com.br/images/fotos/fotop_DGH12_3.jpg http://www.analiselaboratorios.com.br/imagem/prodts/014.jpg Placas Imunodifusão Acervo pessoal. Placa de Petri http://www.biomol.com.br/Imagens/Fotos/%7B1isqt6495xo2bv02u0i43 dlgfdrxh4%7D_Cubas%20de%20Eletroforese%20Horizontal%2014%20x% 2014.JPG Cuba de eletroforese horizontal
  7. 7. o Vantagens • É um método de fácil execução, •Não necessita de aparato sofisticado, • Teste com boa especificidade (característica que indica que o teste em questão identificará somente o ag ou ac desejado) – menor risco de falsos-positivos, •Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo, • Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo em comparação com outras técnicas.
  8. 8. oDesvantagens • Falhas em sensibilidade, o que indica um alto risco de falsos negativos, •É um teste que apresenta alguns problemas com a reprodutibilidade, •Apesar de ser um texte de rápida execução, o tempo de incubação é muito grande, de 24 até 72 horas em alguns casos. •Difícil peservação do gel • Não aplicável a alguns isotipos de imunoglobulinas.
  9. 9. EM MEIO SEMI-SÓLIDO •IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES: dosagem de ac ou ag • IMUNODIFUSÃO RADIAL DUPLA: detecção de ac •IMUNOELETROFORESE: avaliação de imunoglobulinas
  10. 10. Anticorpo livre Antígeno livre + - - Zona de excesso de anticorpo Zona de equivalência + Precipitaçã o de anticorpo Zona de excesso de antígeno Quantidade de antígeno adicionado
  11. 11. 1) A placa se encontra cheia de gel impregnado com um anticorpo específico, 2) Coloca-se os controles positivos e as amostras a serem testadas nos poços perfurados no gel, 3) Incuba-se a placa por 48 horas, Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –Go. 4) Os halos (zona de equivalência) formados em tono dos poços são medidos, Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –Go.
  12. 12. o Interpretação dos resultados: • Durante a incubação ocorre a difusão do antígeno na agarose e a formação de complexos ag-ac., • Os complexos precipitam e formam um halo ao redor do orifício, • Existe uma relação linear entre o quadrado do diâmetro do halo (d2) e a concentração do antígeno, • Utilizando antígeno de concentrações conhecidas pode-se fazer uma curva Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –Go. padrão, permitindo determinar a concentração em amostras desconhecidas. http://www.anflalab.com.br/images/Hoja%20Diffuplate%20051.jpg Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –
  13. 13. o Aplicações na medicina humana e veterinária: • Diagnóstico de doenças infecto-contagiosas, onde a detecção de imunoglobulinas e proteinas séricas seja significativa • Exemplos: dosagem de imunoglobulinas e proteina séricas (tanto em humanos como em animais).
  14. 14. 1) O gel de agarose ou agar é preparado e colocado na placa, Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –Go. Acervo Pessoal. Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –Go 2) Após a solidificação do gel, poços são perfurados com um molde (perfurador ou roseta), 3) adiciona-se antígeno , controle positivo e a amostra a ser testada nos poços perfurados, 4) Incuba-se a placa por 48 horas. 5) Os complexos ac-ag se formam e precipitam formando linhas de precipitação que indicam o resultado.
  15. 15. o Interpretação dos resultados: • A formação e localização da banda de precipitação indicam a presença de ac bem como sua concentração em relação ao ag, • Quanto mais perto do ag maior a concentração de ac na amostra . Acervo pessoal.
  16. 16. o Aplicações na medicina humana e veterinária: • Muito usado no diagnóstico de doenças infecto-contagiosas, • Exemplos na Medicina Humana: Candidísase, Histoplasmose e Aspergilose • Exemplos na Medicina Veterinária: Doença de Maedi-visna, Brucella ovis.
  17. 17. BURMESTER, G.R.; Pezzutto, A.. Color Atlas of Immunology. Thieme, Germany, 2003. 1) O gel é preparado e perfurado após sua solidificaçação, 2) O pH do gel éescolhido de forma que partículas negativas migrem para o eletrodo positivo, 3) É colocado o ac e/ou ag (a depender do tipo de imunoeletroforese) nos poços ou canaleta perfurados, 4) O gel numa cuba de eletroforese horizontal, 5) É aplicada carga no gel, esta carga é a responsável pela migração de ag, 6) É cortada uma canaleta entre os poços, a qual será preenchida com ac, 7) Ac e ag formam arcos de precipitação no gel
  18. 18. o Interpretação dos resultados: • Proteínas podem ser identificadas baseado na intensidade, forma e posição das linhas de precipitação, • Cada arco de precipitação representa um antígeno. Imunoeletroforese Rocket Eletroforese
  19. 19. o Aplicações na Medicina Humana e Veterinária: • Utilizada em pacientes com suspeitas de gamopatias monoclonais e policlonais. Imunoglobulinas policlonais são distribuídas uniformemente através da fração de gama-globulina depois da separação eletroforética. • Diagnóstico sorológico de algumas doenças • Exemplo na Medicina Humana: detecção de ac e ag bacterianos (Meningite e Septicemia), Cisticercose. • Exemplo na Medicina Veterinária: cisticercose, alérgenos.
  20. 20. • BURMESTER, G.R.; Pezzutto, A.. Color Atlas of Immunology. Thieme, Germany, 2003. • ROITT,I.M.; Rabson, A.; Delves, P.J.. Really Essential Medical Immunology. Ed – 2. Blackwell Publishing. Massachusetts – USA, 2005. • TEIXEIRA, A.C.O.; Ferreira, M.A.S.V. e Marques, A.S.A.. Detecção de Erwinia psidii via enriquecimento em extrato de folhas de goiabeira e imunodifusão radial dupla. Tropical Plant Patology, vol. 33, nº 3. Brasilia, Junho de 2008. • http://www.analiselaboratorios.com.br/imagem/prodts/014.jpg • http://pathmicro.med.sc.edu/Portuguese/13.GIF • http://eximlab.com.br/images/fotos/fotop_DGH12_3.jpg •http://www.biomol.com.br/Imagens/Fotos/%7B1isqt6495xo2bv02u0i43dlgfdrxh4%7D _Cubas%20de%20Eletroforese%20Horizontal%2014%20x%2014.JPG • http://www.anflalab.com.br/images/Hoja%20Diffuplate%20051.jpg • http://www.fcf.usp.br/Ensino/Graduacao/Disciplinas/LinkAula/imunoprecipitacao.pdf • http://www.unirio.br/DMP/Graduacao/Medicina/Imunologia/AgAb%20Reactions.pdf • http://www.scielosp.org/img/revistas/rsp/v12n1/11f1.gif

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