ICSA29 - Proteínas plasmáticas

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Aula de ICSA29 Imunodiagnóstico Biotecnologia - UFBA

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ICSA29 - Proteínas plasmáticas

  1. 1. Dosagem de proteínas plasmáticas através de ensaios de Imunodiagnóstico Prof. Ricardo Portela Salvador – Fevereiro 2013
  2. 2. Proteínas plasmáticas • Resumidamente, todo e qualquer tipo de molécula complexa que pode ser encontrada no soro • Sua identificação e dosagem têm como objetivo avaliar o estado clínico de algum paciente perante algum tipo possível de patologia e/ou tratamento.
  3. 3. Proteínas plasmáticas • Intervalos de referência ou valores de referência: – Intervalo de valores no qual 95 a 99% da população da espécie estudada apresenta os níveis de proteínas plasmáticas sem apresentar nenhum tipo de alteração patológica – pacientes hígidos! – É calculado levando em consideração os valores obtidos em uma população clinicamente hígida!
  4. 4. Intervalos de Referência • Cálculos de Intervalo de Referências: – TEMA DE AULA PRÁTICA!
  5. 5. Proteínas Constituintes • Tipos de proteínas a serem analisadas: – Proteínas constituintes básicas: albumina – “Colesterol” – “Triglicerídeos”
  6. 6. Enzimas • São proteínas altamente especializadas com atividade catalítica; praticamente todas as reações químicas celulares onde participam biomoléculas orgânicas são catalisadas por enzimas. • Existem milhares de enzimas, cada uma capaz de catalisar um tipo de reação química diferente. • Exemplos: fosfatase ácida, fosfatase básica, transaminases • Podem não ser típicas do soro, mas sua presença neste serve de marcador de injúria tecidual
  7. 7. Proteínas Transportadoras • São proteínas que se ligam a íons ou a moléculas específicas, as quais são transportadas de um órgão para outro. Transportam hormônios, vitaminas, metais, drogas e oxigênio (hemoglobina); solubilizam os lipídios (apoproteínas). Transportam, por exemplo, a glicose, aminoácidos e outras substâncias.
  8. 8. Proteínas de Armazenamento • Atuam no armazenamento de certas substâncias, ex.: ferritina, que armazena átomos de ferro.
  9. 9. Proteínas com função imunológica • Imunoglobulinas • Proteínas da cascata da coagulação • Proteínas do Sistema do Complemento • Proteínas de Fase Aguda
  10. 10. Proteínas Reguladoras - Hormônios • Muitas vezes presentes na circulação sanguínea, pois é a via de transporte desde o órgão produtor ao órgão alvo • Prolactina, FSH, LH, TSH, eritropoietina, hormônio do crescimento • Não proteínas: testosterona, progesterona, estrógeno
  11. 11. Escolha do método a ser empregado • Natureza da molécula: proteína, açúcar, lipídeo • Tamanho da molécula e complexidade • Peso molecular • Possibilidade ou não de formação de complexos com outras moléculas • Função da molécula: hormônio, enzima... • Concentração da molécula no soro
  12. 12. ENZIMAS - MÉTODOS • Grande parte das enzimas plasmáticas NÃO são quantificadas por métodos imunológicos • Levando-se em consideração a sua ação enzimática específica, utilizam-se métodos nos quais se adiciona o substrato da enzima, e um marcador para a transformação enzimática • Resultados lidos por espectrofotometria
  13. 13. ENZIMAS • Exemplos – Amilase: adição de amido e iodo, e a diminuição da cor azul é correspondente a quantidade de amilase na amostra; – GamaGT: catalisa a transferência de glutamil para glicilglicina, formando p-nitroanilina, que absorve a 405nm – Lipase: clivagem de triglicéride de cadeia longa, com formação de composto de coloração vermelha
  14. 14. ENZIMAS • Exemplos – Fosfatase ácida: atuando sobre timolftaleína, e um álcali converte o resultado da reação em substância de cor azul – Transaminase pirúvica: formação de piruvato e hidrazona, formando cor em meio alcalino – CK-MB: formação de tiocolina, e redução de ferricianeto.
  15. 15. ENZIMAS • Mas... – Algumas enzimas são presentes em baixas concentrações no soro, e não se pode dosá-las por métodos bioquímicos de pouca sensibilidade; – A ação enzimática de algumas é difícil de reproduzir in vitro, com alto custo de substrato e co-enzimas; – Algumas tem ação enzimática muito específica, e ainda não foi desenvolvida técnica para tornar essa ação detectável...
  16. 16. MÉTODOS E SUAS UTILIZAÇÕES
  17. 17. IMUNODIFUSÃO (IMUNODIFUSÃO SIMPLES) • Método antigo, de boa especificidade, mas de baixa sensibilidade • Medição dos halos de precipitação, e comparação com os halos de calibradores • Praticidade, baixo custo, não há necessidade de aparato sofisticado, confecção rápida
  18. 18. IMUNODIFUSÃO (IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES) • Limitação: utilizado para proteínas séricas que tenham alta concentração em fluidos corporais (nível de mg/mL) • Utilizado para proteínas séricas que tenham um intervalo de referência largo (pequenas variações não influenciariam no resultado) • Em desuso atualmente, principalmente devido a problemas de reprodutibilidade, de manutenção do gel (comercialmente)
  19. 19. IMUNODIFUSÃO • O caso das Imunoglobulinas: – Por terem uma concentração sérica considerada alta (com exceção de IgE), e por terem largas faixas de referências, podem ser dosadas por Imunodifusão simples. – Praticidade, custo baixo – Exceção: quando se necessita do resultado com urgência (incubações podem durar até 3 dias)
  20. 20. ELISA SANDUÍCHE • Utilizado atualmente como método de referência para diversas proteínas plasmáticas • Consegue realizar detecção e quantificação de proteínas plasmáticas com sensibilidade de até nanogramas (dependendo do tipo de sistema utilizado) • Relação custo/benefício boa
  21. 21. Outros componentes do soro ELISA “SANDWICH” Antígeno a ser dosado Anticorpo primário Anticorpo conjugado TMB Enzima Peroxidase
  22. 22. ELISA SANDUÍCHE • Para o desenvolvimento do método: – Necessário a proteína ser de um peso molecular e complexidade razoáveis – necessidade de haver mais de um epitopo – Necessário o emprego de anticorpos para dois epitopos diferentes, e espacialmente afastados um do outro – Necessário o analito purificado e quantificado de forma confiável
  23. 23. ELISA SANDUÍCHE • Para o desenvolvimento do método: – Necessário quantidade razoável de soros para serem empregados como referências – previamente quantificados para o analito em questão – Decidir quanto ao método enzimático a ser empregado – Verificar questões de sensibilidade analítica, linearidade, range de detecção, reprodutibilidade, repetitividade...
  24. 24. QUESTÃO DO MEIO PONTO • O caso do PSA e do PSA Livre: – PSA utilizado como um marcador para alterações e patologias prostáticas – Dosado rotineiramente por Elisa Sanduíche – Encontrado normalmente complexado com anti- proteases – PSA Livre e relação PSA Livre/PSA Total normalmente é mais informativo do que somente PSA Livre – Pergunta-se: como desenvolver uma dosagem em ELISA sanduíche de PSA Livre, sem ser influenciado pelo PSA Total?
  25. 25. ELISA COMPETIÇÃO • Moléculas monovalentes – possuem somente um epitopo (as vezes a molécula inteira é um anticorpo) – incapacidade de realizar um ELISA Sanduíche • Alternativa para dosar esse tipo de molécula: ELISA de competição
  26. 26. ELISA DE COMPETIÇÃO Outros componentes do soro Antígeno a ser dosado Anticorpo primário Antígeno biotinilado TMB ST-AV- Peroxidase
  27. 27. ELISA COMPETIÇÃO • Exemplos de moléculas séricas com essas características: T3, T4, estrógeno, progesterona, testosterona • Diferença importante: Na competição a correlação entre reação desenvolvida e quantidade de analito é inversamente proporcional! • Importante frisar: a curva desenvolvida é, além de inversa, também logarítmica, para a grande maioria dos analitos em ELISA Competição!
  28. 28. ELISA COMPETIÇÃO • Pontos necessários para desenvolvimento de um ELISA competição: – Necessário: ter um anticorpo específico para o epitopo único de seu analito! – Necessário: ter o seu analito marcado/conjugado com substância enzimática, purificado e quantificado corretamente – Necessário: Saber previamente o intervalo de referência do analito para poder fazer calibrações na concentração de analito conjugado a ser utilizado no ensaio
  29. 29. QUESTÃO DO MEIO PONTO • O caso de T3/T4: – T3 e T4 são moléculas bem pequenas, que devem ser dosadas em sistema de competição. – Enzimas como a peroxidase e a fosfatase alcalina são grandes, complexas – A diferença de tamanho entre a enzima e o analito pode influenciar em seu reconhecimento pelo anticorpo de captura – PERGUNTA: como proceder?
  30. 30. ELISA DE COMPETIÇÃO • A questão da Biotina: – Biotina - vitamina H, B7 ou B8 – Streptoavidina: quelação de biotina em indivíduos infectados com Streptomyces – Ligação de grande afinidade de Streptoavidina com biotina
  31. 31. ELISA DE COMPETIÇÃO • A questão da Biotina: – Biotina: pode ser usada em mecanismos de conjugação com grande sucesso! – Streptoavidina: pode ser conjugada com peroxidase! – Uma streptoavidina pode carregar 4 peroxidases (3 para deixar um sítio para ligar a biotina) – E daí???
  32. 32. IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA IMUNOFLUORESCÊNCIA • São aplicadas quando se necessita de maior sensibilidade analítica! • Pode detectar analitos na ordem de pico a fentogramas! • Muito utilizadas hoje em dia (Luminescência mais) em ensaios de dosagem de analitos séricos humanos (mesmo com concentrações usuais nem tão baixas assim!)
  33. 33. Adição de anticorpo monoclonal específico para o antígeno pesquisado conjugado a enzima. Uma microesfera de poliestireno é revestida com anticorpo monoclonal contra antígeno analisado Adição do soro do paciente, que é incubado com agitação intermitente. Lavagem para retirada do antígeno não fixado Incubação do conjugado e mais uma lavagem para tirar o anticorpo não fixadoY Y Y Y Adição do substrato da enzima, em seguida, incubação. A adição de substrato quimioluminescente sofre hidrólise na presença da enzima, produzindo substâncias instáveis que geram emissão de fótons (luz). Y Y Anticorpo monoclonal Substrato Conjugado Antígeno do soro do paciente
  34. 34. Estes impulsos são lidos em “contagens” de luz por segundo (cps). Essa unidade é proporcional a quantidade de antígenos presentes na amostra. Estes fótons são medidos través de um fotomultiplicador (PMT) que tem a função de transformar a luz emitida pelos fótons em impulsos elétricos.
  35. 35. IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA IMUNOFLUORESCÊNCIA • Possuem as mesmas variações de um ELISA: Competição, Indireto, Sanduíche, Captura • A escolha do tipo vai seguir os mesmos padrões para o ELISA! • Grande vantagem: Sensibilidade analítica elevada! • Consegue detectar pequenas variações nas concentrações dos analitos!
  36. 36. IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA IMUNOFLUORESCÊNCIA • Necessário: anticorpos diretamente conjugados com substâncias fluorescentes ou quimioluminescentes, ou com enzimas que tenham ação sobre um substrato que se torne luminescente ou fluorescente • Necessário: substâncias fluorescentes ou quimioluminescentes, e outras que façam sua estabilização
  37. 37. IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA IMUNOFLUORESCÊNCIA • Necessário: leitores de quimioluminescência ou fluorescência • Necessário: soros padrões dosados por técnicas igualmente sensíveis • Necessário: PADRONIZAÇÃO CORRETA DE CONCENTRAÇÃO DE REAGENTES, e determinação de sua repetitividade e reprodutibilidade
  38. 38. QUESTÃO DE MEIO PONTO • A questão da alta sensibilidade: – A alta sensibilidade dos ensaios acarreta um preço: Qualquer variação mínima em tempo de incubação, pipetagem, temperatura de incubação, lavagens pode acarretar um resultado distorcido – Portanto, a reprodutibilidade pode ser problemática! – Pergunta: como proceder?
  39. 39. AUTOMAÇÃO
  40. 40. Interferentes clássicos em dosagem de proteínas plasmáticas • Questão SORO x Plasma! – Plasma: contém ainda proteínas da coagulação – Soro: sem proteínas da coagulação – mais limpo! – Tempo de coagulação: consumo de glicose e de outras enzimas – Tamanho das proteínas a serem dosadas: podem estar aprisionadas no processo de coagulação! – Interação Antígeno/Anticorpo e moléculas da coagulação!
  41. 41. Interferentes clássicos em dosagem de proteínas plasmáticas • Hemólise! – Liberação de hemoglobina no soro/plasma – Alteração da coloração da amostra: influência em ensaios espectrofotométricos com utilização de grande qtdade de amostra – Contaminação com componentes internos das células: problema maior em eletrólitos, e em algumas enzimas – Interferência na ação de algumas enzimas (inibição) – Interferências nas reações antígeno/anticorpo quando em grande concentrações!
  42. 42. Interferentes clássicos em dosagem de proteínas plasmáticas • Hemólise! • Para evitá-la: – Retirada de sangue: cuidados com a pressão negativa violenta, com a manipulação de seringas e agulhas, com a retirada correta – Evitar altas temperaturas – Evitar exposição a luz – Tempo de conservação – Tempo de permanência do coágulo antes de sua retirada
  43. 43. Interferentes clássicos em dosagem de proteínas plasmáticas • Cuidados pessoais do paciente pré-coleta: – Jejum – fundamental para algumas enzimas e proteínas carreadoras – Suspensão de medicação: corticóides principalmente – Relato de qualquer tipo de alteração – Intervenções e reações cruzadas!

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