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Separación de pigmentos vegetales

  1. 1. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL COMPOSICIÓN Y BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES Separación de Pigmentos Vegetales por Cromatografía Sobre el Papel I. INTRODUCCIÓN Los colores que presentan los vegetales son debidos a unos compuestos químicos. Cuando se observa una hoja, el pigmento clorofila es usualmente el único pigmento que parece estar presente. De hecho, la clorofila es solamente uno de varios tipos de pigmentos presentes en las hojasy uno de tantos pigmentos que están involucrados en el proceso de fotosíntesis. Una vez removidosde la hoja, los pigmentos fotosintéticos pueden ser separados uno de otro e identificados mediantecromatografía.La cromatografía es un método usado principalmente para la separación de los componentes de unamuestra en la cual los componentes son distribuidos entre dos fases una de las cuales esestacionario, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser sólido o líquido soportadoen un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columnaextendida en una capa, distribuida como una película.La cromatografía en papel tiene como soporte un papel de celulosa y es un proceso muy utilizado enlos laboratorios para realizar análisis cualitativos ya que pese a no ser una técnica muy potente norequiere de ningún tipo de equipamiento.La fase estacionaria está constituida por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en unextremo colocando pequeñas gotas de la solución y evaporando el solvente. Luego el disolventeutilizado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase móvil en el fondo.Después de unos minutos cuando el solvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y seca. Si el solvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se verán lasmanchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel sesomete a procesos de revelado. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz laelección del solvente y la del papel filtro. II. OBJETIVOS Dra. LUZ PAUCAR MENACHO Página 1
  2. 2. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL COMPOSICIÓN Y BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES  Extraer los pigmentos fotosintéticos y separarlos mediante una técnica sencilla de cromatografía en papel.  Reconocer la vitamina C (ácido ascórbico) mediante azul de metileno.  Observar el efecto y acción del calor y el cobre sobre la vitamina C. III. FUNDAMENTO TEÓRICO La clorofila es un pigmento de las plantas, que les proporciona su color verde y que absorbe la luz necesaria para la fotosíntesis. La clorofila absorbe principalmente luz violeta roja y azul y refleja luz verde. La abundancia de clorofila en hojas y su ocasional presencia en otros tejidos vegetales es la causa de que esas partes de las plantas aparezcan verdes, pero en algunas hojas la clorofila es enmascarada por otros pigmentos. La extracción y reconocimiento de estos pigmentos es interesante para ese estudio y conocimiento de sus propiedades. Los Pigmentos vegetales, que se encuentran en los cloroplastos, son moléculas químicas que reflejan o transmiten la luz visible, o hacen ambas cosas a la vez. El color de un pigmento depende de la absorción selectiva de ciertas longitudes de onda de la luz y de la reflexión de otras. Constituyen el sustrato fisicoquímico donde se asienta el proceso fotosintético. Hay diversas clases de pigmentos: Principales: • Clorofilas (a, b, c, d y bacterioclorofilas) de coloración verde. Accesorios: • Carotenoides (carotenos y xantofilas) de coloración amarilla y roja. • Ficobilinas de coloración azul y roja presentes en las algas verdeazuladas, que comprenden el filo de los Cianofitos. La Clorofila, es el pigmento que da el color verde a los vegetales y que se encarga de absorber la luz necesaria para realizar la fotosíntesis, proceso que posibilita la síntesis de sustancias orgánicas a partir de las inorgánicas (CO2, H2O y sales minerales), mediante la transformación de la energía luminosa en energía química. La clorofila absorbe sobre todo la luz roja, violeta y azul, y refleja la verde. Generalmente la abundancia de clorofila en las Dra. LUZ PAUCAR MENACHO Página 2
  3. 3. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL COMPOSICIÓN Y BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES hojas y su presencia ocasional en otros tejidos vegetales, como los tallos, tiñen de verde estas partes de las plantas. En ocasiones, la presencia de clorofila no es tan patente al descomponerse y ocupar su lugar otros pigmentos de origen isoprénico también presentes en los plastos como son los carotenos (alfa, beta y gamma) y las Xantofilas. Las algas verdeazuladas contienen la misma clase de clorofila que las plantas superiores, pero la ausencia de cloroplastos hace que se distribuya por toda la célula. Con frecuencia otros pigmentos como la ficobilina (presente también en los rodófitos) enmascaran la clorofila y confieren a estas a las células, un color azulado o rojizo. Su función es captar la luz y transferirla a la clorofila. Las clorofilas presentan una estructura molecular de gran tamaño de tipo porfirinico, estando formada en su mayor parte por carbono e hidrógeno; constituyendo un anillo tetrapirrolico ocupado en el centro por un único átomo de magnesio, rodeado por un grupo de átomos que contienen nitrógeno. Del anillo parte una larga cadena de 20 átomos de carbono, denominada fitol que constituye el punto de anclaje de la molécula de clorofila a la membrana interna del cloroplasto, el orgánulo celular donde tiene lugar la fotosíntesis. Cuando la molécula de clorofila absorbe un fotón, sus electrones se excitan elevándose a un nivel de energía superior. Esto es el punto de partida en el cloroplasto de una secuencia compleja de reacciones químicas que dan lugar al almacenamiento de energía en forma de enlaces químicos. Los diversos tipos de clorofilas existentes, se diferencian en pequeños detalles de su estructura molecular y que absorben longitudes de onda luminosas algo distintas. Por cromatografía se pueden separar cuatro clorofilas distintas: • La clorofila A constituye de manera aproximada el 75% de toda la clorofila de las plantas verdes, estando presente también en las algas verdeazuladas y en células fotosintéticas más complejas. • La clorofila B es un pigmento accesorio presente en vegetales y otras células fotosintéticas complejas; absorbe luz de una longitud de onda diferente y transfiere la energía a la clorofila A, que se encarga de transformarla en energía química. Dra. LUZ PAUCAR MENACHO Página 3
  4. 4. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL COMPOSICIÓN Y BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES • Las clorofilas C y la D son propias de algas y bacterias. Las clorofilas actúan como catalizadores, es decir, como sustancias que aceleran o facilitan las reacciones químicas, pero que no se agotan en las mismas. Entre los carotenoides hay también muchos catalizadores e intervienen como pigmentos accesorios en la fotosíntesis, transfieren a la clorofila la energía de la luz que absorben para su conversión en energía química. PIGMENTOS VEGETALES Los colores que presentan los vegetales son debidos a unos compuestos químicos llamados pigmentos. El color que presenta un determinado órgano vegetal depende generalmente del predominio de uno u otropigmento o la combinación de ellos. Además, algunos de los pigmentos que condicionan el color están estrechamente ligados a las actividades fisiológicas delpropio vegetal. El color verde en los vegetales es debido a la presenciade dos pigmentos estrechamente emparentadosllamados clorofila ay clorofila b. Se encuentranprácticamente en todas las plantas con semilla,helechos, musgos y algas. También aunqueaparentemente falten en algunas hojas de color rojo oamarillo, cuando se extraen las otras sustanciascolorantes de estas, puede comprobarse incluso allí lapresencia de las clorofilas, que estaban enmascaradaspor los demás pigmentos. Asociados con las clorofilas,existen también en los cloroplastos dos clases depigmentos amarillos yamarillo-anaranjados que sonlasxantofilas ycarotenos. PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS Entre todos los caracteres más externos de los vegetales, el más notable y característico es probablemente el color. El color no es únicamente un carácter llamativo de la vegetación, sino que, además, algunos de los pigmentos que lo condicionan están estrechamente ligados a las actividades fisiológicas del propio vegetal. Por consiguiente, el estudio de cómo las plantas viven y se desarrollan requieren el previo conocimiento de los pigmentos vegetales. ¿Qué son los pigmentos? Si es posible encontrar en el reino vegetal todos los matices y combinaciones de colores del espectro, existe un predominio general de los colores primarios: verde, amarillo, rojo, Dra. LUZ PAUCAR MENACHO Página 4
  5. 5. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL COMPOSICIÓN Y BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES azul. Estos colores son conferidos a los vegetales por determinados compuestos químicos definidos, llamadospigmento s. El color particular que presenta un determinado órgano vegetal depende generalmente del predominio de uno u otro o la combinación de ellos. Se debe tener claro que cuando un vegetal presenta un color blanco, es debido a la falta de tales pigmentos. La luz solar que incide sobre ellas no es absorbida selectivamente como ocurre en las partes coloreadas, sino que es transmitida o reflejada prácticamente sin sufrir modificación. Las Clorofilas. El color verde tan uniformemente presente en los vegetales es debido a la presencia de dos pigmentos estrechamente emparentados llamados clorofila a y clorofila b. Se encuentran prácticamenteen todas las plantas con semilla, helechos, musgos y algas. Pueden formarse en las raíces, tallos, hojas y frutos a condición de que estos órganos estén situados por encima del suelo y queden expuestos a la luz. También aunque aparentemente falten en algunas hojas de color rojo o amarillo, cuando se extraen las otras sustancias colorantes de estas, puede comprobarse incluso allí la presencia de las clorofilas, que estaban enmascaradas por los demás pigmentos. ¿Dónde están los pigmentos? Estos pigmentos se encuentran en el interior de las células vegetales específicamente en una organela llamadacloroplasto. Los cloroplastos son simplementeplástidos que contienen pigmentos clorofílicos. Los compuestos clorofílicos están ligados químicamente con las estructuras internas del cloroplasto (membrana tilacoides) y se hallan retenidos en estado coloidal. Asociados con las clorofilas, existen también en los cloroplastos dos clases de pigmentos amarillos y amarillo-anaranjados que son lasxantofilas y carotenoides. ¿Cómo se dividen los solventes? Los pigmentos clorofílicos soninsolubles en el solvente universal llamado agua. Pero sí son solubles (afinidad química) en solventes orgánicos como por ejemplo alcohol etílico y acetona. A los solventes que extraen simultáneamente todos los pigmentos de la hoja se los suele llamarextractantes. Existen otros solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se los llamaseparadores, como por ejemplo el tetracloruro de carbono y el éter de petróleo. Dra. LUZ PAUCAR MENACHO Página 5
  6. 6. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL IV. COMPOSICIÓN Y BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MATERIALES 4.1 Aportado por el alumno: Hojas de Espinaca fresca. 3 limones. 1 naranja. 1 piña pequeña. 1 paquete de gasa. 250 ml de alcohol de 96°. 4.2 Materiales de Laboratorio: Mortero. 1 Vaso de precipitación Embudo. de 600 ml. Matraz. Cocina eléctrica Papel filtro. Tabla de picar 3 tubos de ensayo. Cuchillos 4 Vasos de precipitación Mortero de 100ml. Sulfato de Cobre al 1 % 1 Vaso de precipitación Agua destilada. de 250 ml. Dra. LUZ PAUCAR MENACHO Página 6
  7. 7. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL V. COMPOSICIÓN Y BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES PROCEDIMIENTOS Dra. LUZ PAUCAR MENACHO Página 7
  8. 8. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL VI. COMPOSICIÓN Y BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES RESULTADOS  En la pruebapara la Separación de Pigmentos Vegetales, resultó que: a. Se observó la separación a diferente solubilidad de los pigmentos de la espinaca en el alcohol. b. La separación que se produjo en la hoja de papel colocada sobre la placa, fue que el pigmento más soluble en el alcohol formó una banda coloreada en la parte superior del papel y el menos soluble en alcohol fue el último en ascender a través del papel. c. En la disolución extraída de la espinacase tuvo tantos pigmentos como bandas coloreadas, que fueron 3, los cuales se observaron en la cromatografía sobre papel. Pigmento de color amarillo (xantofila), verde claro (clorofila b) y verde azulado (clorofila a). Xantofila Clorofila a Clorofila b Cromatografía en Papel PIGMENTO Clorofila A Clorofila B Xantofila Dra. LUZ PAUCAR MENACHO COLOR Verde azulado Verde claro Amarillo Página 8
  9. 9. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL COMPOSICIÓN Y BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES  En la prueba para el Reconocimiento de Vitamina C (ácido ascórbico) mediante azul de metileno, resultó que: a. El azul de metileno es un colorante que se reduce fácilmente formando un compuesto incoloro. Debido a esta facilidad de cambiar de color (azul = oxidado, blanco = reducido)fue utilizado para el reconocimiento de la vitamina C. b. Cuando se agregó azul de metileno, dio como resultadoque la muestra de zumo de limón adoptó una coloración “verde azulado”, la muestra dezumo de naranja una coloración “verde” y la muestra de zumo de piña un color “cobalto o azul claro”; esto sedebió a que el ácido ascórbico sufrió unaoxidación reversible a ácido deshidroascórbico, con lo cual el azul demetileno actuó como donador de electrones. c. La muestra de Naranja (tubo 2) tiene mayor concentración de vitamina C que las muestras de Limón y Piña. 1 2 3 Tubo 1:Color verde azulado. Tubo 2:Color verde. Tubo 3: Color cobalto o azul claro. Reconocimiento de Vitamina C Dra. LUZ PAUCAR MENACHO Página 9
  10. 10. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL COMPOSICIÓN Y BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES  En la prueba de Acción del calor y el cobre sobre la vitamina C, resultó que: a. En el tubo 1 cuando al zumo de naranja se añadió sulfato de cobre, este actuósobre la vitamina C o ácido ascórbico, al agregar azul de metileno se observó un color cobalto oscuro o azul claro, en el tubo 2 al agregar sulfato de cobre y luego hervir, las altas temperaturas degradaron la vitamina C, se observó un color azul oscuro, en el tubo 3 solo se agregó azul de metileno para indicar la concentración de vitamina C que tenía la muestra de naranja. b. Al final se observó que el tubo 2 indicaba que la vitamina C había sido degradada o destruida, color azul oscuro, debido al sometimiento del zumo de naranja a la acción del calor y del cobre.El tubo 2 no tenía presencia de vitamina C y los tubos 1 y 3 si tenían aún vitamina C pero en mínima concentración. c. El tubo 1 tenía menos concentración de vitamina C que el tubo 3, debido a que se agregó sulfato de cobre al tubo 1. (tubo 3, color más claro que el del tubo 1). Mayor concentración de Vitamina C en el tubo 3. 1 2 3 Tubo 1: color azul claro. Tubo 2: color azul oscuro. Tubo 3: color azul claro. Acción del calor y el cobre sobre la vitamina C Dra. LUZ PAUCAR MENACHO Página 10
  11. 11. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL VII. COMPOSICIÓN Y BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES DISCUSIÓN  Según Química II: un enfoque constructivista. Indica en la pág. 96: La cromatografía es otro método útil para separar mezclas. Se basa en la diferencia de afinidad que los componentes de una mezcla pueden tener hacia una fase móvil, como un gas o un líquido. Los componentes de una mezcla líquida pueden separarse si ésta impregna una tira de papel que se sumerge en un disolvente adecuado. Éste se adhierey avanza sobre la superficie, disolviendo, arrastrando y separando a diferente velocidad cada uno de los componentes de la mezcla.las sustancias más solubles en el líquido avanzarán más rápido, mientras que las más insolubles o más afines al sólido quedarán atrás.  YuliMoret de González - Vitamina C: influencia que ejerce en la cicatrización y alteraciones de la cavidad bucal Indica en la pág. 28-29: El ácido ascórbico se obtiene de las frutas cítricas (naranja, limón, mandarina, lima, toronja, fresas, melón, piña). El jugo de naranja y el de limón, incluyendo su tegumento blanco, encierran más vitamina C que una parte igual de jugo colado. Los alimentos tropicales ricos en la vitamina, incluyen el zapote, la lechosa, la guanábana y la guayaba. El brócoli, las coles de Bruselas, las espinacas, los pimientos verdes, los nabos, verduras foliáceas, frijoles, algunos tubérculos y plátanos son fuente excelente de vitamina C, siempre y cuando los métodos de preparación diaria sean buenos. Se presenta en todas las células de las plantas, soliendo alcanzar mayor concentración en las hojas y en las flores, esto es, en las partes que crecen activamente.  Según la página: http://es.scribd.com/doc/23475173/info09-Vitaminas Indica: La característica más importante del acido ascórbico es su capacidad de sufrir con facilidad una oxidación reversible a ácido deshidroascórbico, La actividad fisiológica de la vitamina C depende principalmente de esta oxidación reversible. Dra. LUZ PAUCAR MENACHO Página 11
  12. 12. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL COMPOSICIÓN Y BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES Los metales de transición, cobre, hierro y cinc catalizan la destrucción de la vitamina C, pero esto depende de la actividad acuosa; a valores deaw < 0.4 no hay alteraciones, posiblemente porque existe movilidad de los metales y por una falta de solubilidad en el medio que les facilite el contacto con el ácido ascórbico. Cuando la aw > 0.65, la velocidad del deterioro se incrementa de 2 a 4 veces, ya que en estas condiciones el agua permite el acarreo de metal y favorece su acción. El azul de metileno es un colorante que se reduce fácilmente formando un compuesto incoloro. Debido a esta facilidad de cambiar de color (azul=oxidado, blanco=reducido) será utilizado para el reconocimiento de la vitamina C.  Según Delgado,Nidia Esperanza Delgado López,Jorge Augusto Díaz - Fundamentos de nutrición parenteral Indica en la pág. 95: El cobre potencia la oxidación de la vitamina C. El ácido ascórbico reduce el cobre de cúprico a cuproso si las condiciones de pH lo permiten. La vitamina C se oxida por acción de la luz aunque el pH, la presencia de cisteína y de cobre favorecen su degradación.  Según Javier Aranceta, Lluis Serra Majem, Rosa Ortega, Alfredo Entrala, Angel Gil–Las Vitaminas en la alimentación de los españoles: estudio Indica en la pág. 11: El ácido ascórbico es ligeramente estable en medio ácido y se descompone rápidamente en presencia de la luz; la descomposición es acelerada por la acelerada por la presencia de iones metálicos como Fe y Cu y por la acción del oxígeno y de los álcalis. La vitamina C se pierde fácilmente tanto por los tratamientos térmicos como por efecto del almacenamiento. Así, el contenido de los alimentos procesados en vitamina C depende no sólo de la fuente de alimento específico sino del cuidado con que los alimentos sean procesados. Elevadas temperaturas y largos tiempos, asociados a elevadas concentraciones de oxígeno, tienen efectos indeseables sobre el contenido de vitamina C en los alimentos. Dra. LUZ PAUCAR MENACHO Página 12
  13. 13. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL VIII. COMPOSICIÓN Y BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES CONCLUSIONES  Los cloroplastos poseen una mezcla de pigmentos con diferentes colores y estas presentan diferente grado de solubilidad en disolventes apolares, lo que permite su separación cuando una solución de las mismas asciende por capilaridad a través de papel,aparecen varias bandas de diferentes colores que están más o menos alejados de la disolución alcohólica según su mayor o menor solubilidad de sus pigmentos. Estas bandas poseen diferente grosor, dependiendo de la abundancia del pigmento en la disolución.  Se determinó la presencia de Vitamina C en las muestras de limón, naranja y piña;a mayor coloración azul existe menor concentración de vitamina C. La muestra de naranja tiene mayor concentración de vitamina Cque las muestras de limón y piña (mayor coloración azul, menor concentración de vitamina C).  El cobre acelera la descomposición de la vitamina C en la muestra, y el calor (altas temperaturas, ebullición), hace que sedestruya la vitamina C. IX. BIBLIOGRAFÍA  Aranceta, Lluis Serra Majem, Rosa Ortega, Alfredo Entrala, Angel Gil / Las Vitaminas en la alimentación de los españoles: estudio / Impreso en España / Editorial Medica Panamericana / Pág. 11.  Delgado, Nidia Esperanza Delgado López, Jorge Augusto Díaz/ Fundamentos de nutrición parenteral /Impreso en Colombia / Editorial Medica Panamericana / Pág. 95.  YuliMoret de González / Vitamina C: influencia que ejerce en la cicatrización y alteraciones de la cavidad bucal / Pág. 28-29.  Química II: un enfoque constructivista / 2007/ Primera Edición /Pearson Educación / Pág. 96.  http://www.botanica.cnba.uba.ar/Trabprac/Tp6/Pigmentos.htm  http://blafar.blogia.com/2007/040901-los-pigmentos-vegetales.php  http://www.jpimentel.com/ciencias_experimentales/pagwebciencias/pagweb/la_ ciencia_a_tu_alcance_II/quimica/Exp_qui_pigmentos_fotosinteticos.htm Dra. LUZ PAUCAR MENACHO Página 13
  14. 14. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL COMPOSICIÓN Y BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES  http://es.scribd.com/doc/23475173/info09-Vitaminas Dra. LUZ PAUCAR MENACHO Página 14

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