MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE
MICROORGANISMOS
PRÁCTICA DE MICROBIOLOGÍA GEN...
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TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS

I.

INTRODUCCIÓN

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TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS

III.

FUNDAMENTO TEÓRICO

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MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y
TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS
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PROCEDIMIENTO

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  1. 1. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS PRÁCTICA DE MICROBIOLOGÍA GENERAL UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P. INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL INTEGRANTES: • Cortijo Palacios Kiara. • Gamboa Cruzado Wagner. • Taboada Rosales Yacky. • Villaca Terrones Walter. 2011
  2. 2. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS I. INTRODUCCIÓN Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es muy amplia; por ello, la variedad de medios de cultivo es también muy grande, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. Los microorganismos se cultivan en agua, a la que se han añadido los nutrientes apropiados, dando una solución acuosa que se denomina medio de cultivo. Los nutrientes existentes en un medio de cultivo dan a la célula microbiana todos los ingredientes requeridos para que se produzca más células semejantes a ella misma. Además de las fuentes de energía, que puedan ser sustancias orgánicas e inorgánicas o luz, el medio de cultivo debe tener fuentes de carbono, nitrógeno y otros macro y micronutrientes importantes para el desarrollo de los microorganismos. Para el cultivo, aislamiento e identificación de un microorganismo en el laboratorio, es necesario realizar técnicas de siembra de la muestra en un respectivo medio de cultivo. Estas técnicas varían según el estado físico del medio o las necesidades gaseosas de los microorganismos (aeróbicos, anaeróbicos, etc.). Una condición básica de la siembra es que debe realizarse bajo rigurosas reglas de asepsia, evitando el crecimiento de contaminantes. II. OBJETIVOS • Describir los pasos en la preparaci0n de medios de cultivo, indicando los componentes básicos necesarios en su formulación. • Obtener colonias de bacterias en cultivo puro mediante la inoculación (siembra por estría en superficie) • Aplicar las técnicas de trabajo aséptico y de su manipulación de microorganismos. Página 2
  3. 3. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS III. FUNDAMENTO TEÓRICO CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO • AGAR. Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El componente predominante en el agar bacteriológico es un polisacárido al que acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Un gel de agar al 1-2 % en agua licua hacia los 100°C y se gelifica alrededor de los 40°C, dependiendo de su grado de pureza. Con la excepción de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente por las bacterias. • EXTRACTOS. Son extraídos, con agua y calor, de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (p.e.: carne, hígado, semillas...) y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Se utilizan de forma deshidratada. • PEPTONAS. Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales minerales que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, caseína...). Son muy ricas en péptidos y aminoácidos. • SISTEMAS AMORTIGUADORES. Son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo de crecimiento bacteriano. • INDICADORES DE pH. Son compuestos que presentan una coloración diferente según la acidez basicidad del medio. Cada indicador presenta colores diferentes además de un rango propio de valor de pH al cual cambia de color. Se añaden a menudo a los medios de cultivo para detectar variaciones de pH. • AGENTES REDUCTORES. Se añaden al medio para crear condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaeróbicos. • AGENTES SELECTIVOS. Permiten el crecimiento de determinados microorganismos e impiden el crecimiento de otros; p.e. sales biliares, antibióticos, etc. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo pueden ser sólidos o líquidos. La composición de estos medios puede ser definida (medio sintético) o no definida (medio complejo). No todos los medios de cultivo Página 3
  4. 4. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS son iguales, ni todos los microorganismos pueden crecer en todos los medios de cultivo. Hablamos de medio mineral o basal cuando se trata de un medio que sólo contiene compuestos inorgánicos. Con la adición de una fuente de carbono orgánica a este medio mineral obtendremos lo que se llama medio mínimo. Un medio rico es aquel medio con todos los tipos de requerimientos nutritivos (fuente de carbono, nitrógeno, fósforo, azufre, sales minerales y factores de crecimiento) que permiten el crecimiento de la mayoría de microorganismos heterótrofos. Aún así no hay un medio universal que sirva para aislar los diferentes tipos de microorganismos que existen. Un medio general es aquel que permite el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. A veces antes de hacer el aislamiento sobre un medio determinado, cuando la población del microorganismo que queremos aislar es mucho más baja que la del resto de microorganismos, previamente se hace crecer la muestra en un medio de enriquecimiento líquido. Este medio favorece el crecimiento de un determinado tipo de microorganismos (sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto) de forma que al final de la incubación la población del microorganismo que queremos aislar es mucho más grande que la de los otros. Cualquier medio de cultivo que favorece el crecimiento de un tipo o grupo de microorganismo, e inhibe el crecimiento del resto de la flora microbiana presente en el inóculo, se llama medio selectivo. Generalmente estos medios contienen productos inhibidores que no afectan el crecimiento del microorganismo o grupo de microorganismos que queremos aislar, pero sí al resto de la biota. Los medios selectivos son de mucha utilidad en los hospitales para aislar o hacer recuentos de microorganismos patógenos. A veces la selectividad del cultivo viene dada por las condiciones de crecimiento (anaerobiosis, temperatura, etc.). Aquellos medios cuya composición permite poner de relieve ciertas propiedades metabólicas de los microorganismos, y por tanto diferenciarlos en base a estas propiedades, se denominan medios diferenciales. Las diferencias entre los microorganismos se pueden poner de manifiesto por la morfología o coloración colonial, coloración del medio de crecimiento, aparición de burbujas, precipitación de algún componente del medio, etc. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS El proceso de aislamiento consiste en disponer de la descendencia de un individuo (célula) inmovilizada sobre la superficie de un medio sólido y separada del resto de individuos presentes en el cultivo mixto. Esta célula, en las condiciones de crecimiento adecuadas dará lugar a una descendencia (clon) que resultará macroscópicamente visible y que se llama colonia. Cada colonia contiene millones o miles de millones de células idénticas y con el mismo origen y propiedades. Se puede demostrar que prácticamente cada colonia procede de una sola célula o de un grupo de células del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Por ello lo más correcto es hablar de unidades formadoras de colonias (UFC) al referirnos al origen de una colonia. El cultivo descendiente de una misma colonia es un cultivo puro. Página 4
  5. 5. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS En los primeros tiempos de la Microbiología se utilizaban como sustratos sólidos para inmovilizar los microorganismos patatas o pan, con el inconveniente de la opacidad de estos sustratos. En el laboratorio de Robert Koch se desarrollaron técnicas para solidificar un medio líquido con composición conocida añadiendo una sustancia sin opacidad y con la posibilidad de modificar la composición del medio líquido según los requerimientos nutricionales del microorganismo a aislar. La gelatina fue el primer agente solidificante utilizado por Koch, sin embargo, presentaba el inconveniente de que algunos microorganismos son capaces de utilizarla para su crecimiento. Entonces la gelatina fue sustituida por el agar; introducido por Fanny Eilshemius (1881). El agar es un polisacárido que se obtiene de algunas algas rojas y para pasar de sólido a líquido se debe calentar por encima de los 100°C y una vez fundido es mantiene líquido hasta enfriarse a 44°C. INÓCULO Y SIEMBRA Inoculó es la masa microbiana que se utiliza para sembrar el medio de cultivo. Para evitar contaminaciones a la hora de inocular el medio de cultivo, habitualmente se trabaja al lado de la llama del mechero Bunsen. Para la toma del inóculo a partir de una muestra a examinar a partir de un medio sólido o de un tubo con líquido, se recomiendan las maniobras siguientes: 1.- Colocar frente al mechero la muestra a analizar y el resto del material necesario (tubos, placas...) de manera que sea fácilmente accesible. 2.- Tomar el asa de siembra o la pipeta. La pipeta debe estar previamente esterilizada. Se debe flamear el asa de siembra hasta que el filamento alcance un rojo incandescente y después enfriar en la proximidad de la llama (unos 10 segundos). 3.- Tomar con la otra mano el recipiente (tubo, placa...) que contiene la muestra a analizar: A. Si la muestra está en un tubo, quitar el tapón y flamear la boca del tubo. B. Si la muestra está en una placa de Petri, colocar la placa invertida sobre la mesa y levantar la parte de la placa que contiene el crecimiento bacteriano. Situar en la proximidad de la llama del mechero. 4.- Trabajando en todo momento en la proximidad de la llama, tomar la alícuota o inoculó: A. Si el medio es líquido agitar ligeramente el tubo e introducir la pipeta o el asa de siembra en la cual quedará adherida una gota por tensión superficial. B. Si el medio es sólido, rozar con el asa de siembra una pequeña porción de colonia. C. Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar, hundir el filamento dentro del medio hasta tomar una pequeña porción. 5.- Transferir el inoculó a otro medio de cultivo estéril, tomando las mismas precauciones en su manejo (flameando la boca del tubo, trabajando en la proximidad de la llama...) A. Si la transferencia va a ser a un caldo líquido, descargar el inoculó mediante agitación del asa de siembra en aquél o la expulsión del volumen pipeteado. Página 5
  6. 6. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS B. Si la transferencia se va a realizar a un tubo de agar inclinado, introducir el asa con el inoculó y sembrar en zigzag sobre la superficie del agar o bien sembrar en picadura en la profundidad del medio. C. Si la transferencia se va a hacer sobre un medio sólido en placa de Petri, existen diferentes tipos de siembra: extensión de una gota con asa de vidrio, siembra en masa y por agotamiento en placa. 6.- Una vez realizada la transferencia: A. En el caso de los tubos, flamear la boca antes de colocar el tapón. Identificar los tubos e incubar a temperatura adecuada durante el tiempo necesario para que crezcan los microorganismos. B. En el caso de la placa de Petri, tapar la placa. Identificar las placas marcándolas en la base e incubar en posición invertida para evitar que e agua de condensación se deposite sobre la superficie del agar, lo cual impediría la obtención de colonias aisladas. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO • Técnica de aislamiento por estría escocesa o agotamiento en placa La siembra por estría escocesa es un método cualitativo de aislamiento de microorganismos por agotamiento en placa a partir de una muestra natural o de un cultivo de laboratorio. Este método está basado en arrastrar, mediante un asa de siembra, un número cada vez más pequeño de individuos. Es un método rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inóculo sobre un medio sólido contenido en una placa de Petri. El objetivo es obtener, a partir de un elevado número de bacterias, un número reducido de ellas distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa. Al incubar la placa, y dejar crecer las bacterias distribuidas sobre ella, cada una de las bacterias originará una colonia. • Técnica de aislamiento por banco de diluciones y recuento de células viables El aislamiento de microorganismos mediante banco de diluciones es un método tanto cualitativo como cuantitativo. Es cualitativo porque permite diferenciar las diferentes morfologías coloniales y también es cuantitativo porque permite conocer el número de microorganismos que hay en una suspensión. Consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra en condiciones de esterilidad, de manera que se va reduciendo el número de microorganismos de la suspensión inicial, con el objeto de sembrar después cantidades conocidas de las diluciones en placas de Petri. Evidentemente, el número de microorganismos en algunas de las diluciones será tal que al distribuir una parte de ella en una placa originará colonias separadas en un número óptimo para su recuento. Página 6
  7. 7. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS Las diluciones se realizan en tubos que contienen una disolución mineral isotónica (solución Ringer 1/4) que mantiene la viabilidad de las células pero no permite la división celular. De los tubos de las diluciones se siembra un volumen conocido, 0.01 ó 0.1 ml (10 ó 100 μl), sobre una placa de Petri. Conociendo el número de colonias (UFC), la cantidad sembrada y la dilución correspondiente, esta técnica permite evaluar el número de microorganismos viables en la muestra original. IV. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales biológicos: • Cultivo puro de Escherichia coli (A) • Cultivo puro de Bacillus subtilis (B) • Suspensión bacteriana mixta (A + B) • Suspensión de Saccharomyces cerevisiae Materiales de laboratorio: • Frascos de agar agar, extracto de carne, peptona, NaCl y agar MacConkey • Placas petri con agar nutritivo • Placas con agar oxitetraciclina glucosa extracto de levadura (OGY) • Tubos con agar oxitetraciclina glucosa extracto de levadura (OGY) • Matraz Erlenmeyer con 20ml de SSF estéril • Estufa o incubadora • Mechero de alcohol • Asa bacteriológica calibrada y en codo • Fósforos • Plumón de tinta indeleble Página 7
  8. 8. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS V. PROCEDIMIENTO V.1. Técnicas de siembra y aislamiento V.1.A. Siembra por estria en superficie e agar nutritivo • Marcar la base de la placa petri donde se depositará el inóculo y donde comenzarán las estrías. • Esterilizar el asa calibrada por flameado en el mechero y dejar enfriar. Página 8
  9. 9. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS • Primero con una asad tomar una muestra de agua contaminada y colocaralo en la superficie del primer cuadrante dela placa. • Tomar una asada de la suspensión bacteriana de bacillus y colocarlo en la superficie del primer cuadrante de la placa con agar nutritivo, agotar la muestra y realizar las estrias continuas en cuatro cuadrantes. La siembra de los siguientes cuadrantes se inicia a partir de la porción final de la anterior estría. TSA • Rotular las placas y tubos e incubarlos a 37°C por 24 horas. Los tubos de agar OGY incubar a temperatura ambiente por 5 a 7 días. • Realizar un análisis de las características culturales (de las colonias aisladas). 4.2.2. Siembra por suspensión en caldo nutritivo • Esterilizar el asa calibrada por flameado en el mechero y dejar enfriar • Tomar una muestra de cultivo puro bacteriano (A) en frascos con agar nutritivo. Página 9
  10. 10. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS • Coger el tubo conteniendo el medio líquido, destapar el medio y flamear a la llama del mechero ligeramente en las paredes del tubo el inóculo, llevarlo en posición vertical el tubo y agitar ligeramente. • Esterilizar el asa de siembra. • Repetir lo anterior utilizando el cultivo de Escherichia coli (B) • Rotular los tubos e incubarlos a 37°C por 24 horas. • Realizar un análisis de la forma de incubamiento en medio líquido. Esquematizar lo observado. Siembra en caldo con Escherichia coli Siembra en caldo con Bacillus VI. RESULTADOS: MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO: • Agua contaminada Observamos la aparición de colonias en la placa, distribuidas en los cuatro cuadrantes. Estos microorganismos que se encuentran en la placa están muy aislados. En un cuadrante se encuentra una colonia en gran Página proporción. 10
  11. 11. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS • Se cultivaron Bacillus Subtilis, el cual es una bacteria, en placas con agar sólido TSA (agar soja triplicasa). Incubamos a 37°C por 24 horas. Observamos la aparición de colonias en la placa, distribuidas en los cuatro cuadrantes. En el último cuadrante se pueden apreciar colonias más separadas. Los colores de las colonias son de color crema, además podemos añadir que el nutriente utilizado fue efectivo para la muestra de Bacillus subtilis. MEDIO DE CULTIVO EN CALDO • Cultivamos Bacillus en una medio de cultivo en caldo, y se obtuvo el siguiente resultado: Se logra apreciar la turbidez en la parte inferior del tubo de ensayo, dándonos una respuesta de que el Bacillus es anaeróbico y contrastando con daros bibliográficos, esta bacteria puede ser aerobia o también Página 11 anaerobia facultativa.
  12. 12. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS • Cultivamos Escherichia coli en un medio de cultivo en caldo, obteniendo el siguiente resultado: Se aprecia una turbidez en la parte inferior del tubo, pero en mayor concentración a diferencia del resultado obtenido anteriormente. Entonces, decimos también que la Escherichia coli también es anaeróbico. VII. DISCUSIONES  Según, BROCK (2001): “Una vez que se ha preparado un medio de cultivo, puede ser inoculado (es decir, se le añaden organismos) y a continuación incubado en condiciones que favorezca el crecimiento bacteriano. En general, se tratará del crecimiento de un cultivo axenico o puro, esto es, de un cultivo que contiene solo un único tipo de microorganismo. Para obtener y mantener un cultivo axenico o puro es esencial evitar la entrada en el, de otros organismos. Los organismos no deseados, llamados contaminantes, son muy ubicuos, por lo que se han diseñando técnicas microbiológicas para evitarlos. Un método importante para obtener cultivos axenicos o puros y para asegurara la pureza de un cultivo es el uso de medios sólidos en placas de Petri”.  Según PELCZAR, REID Y CHAN (1995) refieren que: “Para mejorar las condiciones de aislamiento de algunos tipos fisiológicos poco frecuentes de bacterias, los procedimientos de siembra en placa deberán estar presedidos del desarrollo de las bacterias en un cultivo de enriquecimiento. El principio de esto, es procurar un Página 12
  13. 13. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS ambiente de cultivo diseñado (medio de composición conocida y condiciones específicas de incubación) que pueda favorecer el desarrollo de cierto tipo concreto de bacterias que necesitamos para que no sea adecuado para los demás. Lo medios de enriquecimiento se usan generalmente cuando el tipo de bacteria que queremos aislar se encuentra en muy pequeñas cantidades y se desarrolla con mayor lentitud que muchas de las otras especies presentes en el inoculo”.  Según BROCK: “Los medios de cultivo se preparan con frecuencia en forma semisólida o solida mediante la adición al medio liquido de un agente solidificante. Los medios sólidos inmovilizan a las células, permitiéndoles crecer y formar masas aisladas visibles llamadas colonias. Las colonias bacterianas pueden ser de forma y tamaño variable dependiendo del organismo, las condiciones del cultivo, el suministro de nutrientes (como la cantidad de oxigeno presente), y otros parámetro fisiológicos. Algunas bacterias producen pigmentos que dan color a las colonias. Independientemente de su posible pigmentación, las colonias permiten al microbiólogo reconocer la pureza del cultivo; las placas que contengan más de un tipo de colonia no fueron sembradas con cultivo axenico o puro. Los medios sólidos se preparan igual que los líquidos salvo que antes de esterilizar los medios, se les añade agar como gelificante, normalmente al 1.5%. El agar se funde durante el proceso de esterilización y el medio fundido se vierte sobre placas de cristal o de plástico, y se deja que solidifique antes de usarse.  Según PELCZAR, REID Y CHAN refieren que: “las técnicas de siembra en placa por estrías o por difusión se pueden hacer convenientemente y con un equipo mínimo; estos son procedimientos de rutina que se efectúan para asilar bacterias en cultivo puro. Aunque una de las limitaciones es que solo pequeñas cantidades de la muestra pueden ser esparcidas sobre la superficie del medio de cultivo. El principio de la técnica de la placa vertida es la dilución (adelgazamiento) de la muestra en tubos con agar fundido y enfriado. Se necesita hacer diluciones en más de un tubo para obtener colonias bien aisladas, si es que no se conoce la magnitud de la población bacteriana de la muestra antes de manejarla. El medio se mantiene al estado liquido a una temperatura de 45º C para permitir que el inoculo se distribuya adecuadamente en el medio. Una vez sembrado se pone en cajas de petri, se observaran colonias tanto en la superficie como entre el medio cuando este solidifica. Las técnicas de siembra por estrías (o por diseminación) y las de placa vertida para aislar cierta clase de bacterias, pueden mejorarse con medios de cultivos selectivos o diferenciales. También es posible tratar el medio para eliminar otro tipo de bacterias diferentes de las que se desea aislar, antes de sembrar en las placas. Por ejemplo: supóngase que la tarea es aislar solamente bacterias Página 13
  14. 14. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS formadoras de esporas. Como las esporas son muy resistentes al calor, la muestra se someterá a temperaturas de más o menos 85ºC durante 5 minutos antes de sembrar las placas. El tratamiento con calor destruirá toda o la mayoría de las formas esporuladas, y cada colonia que se desarrolle será de las que formen esporas”.  Según BROCK: “el problema más común es la contaminación ambiental a través del aire, ya que este siempre contiene polvo en suspensión que generalmente lleva a una comunidad de microorganismos. Cuando las placas o tubos se abren deben manejarse de tal modo que los contaminantes del aire no penetren. La transferencia aséptica de un cultivo desde un tubo con medio a otro, se realiza habitualmente con el asa o aguja de siembra previamente esterilizada a la llama por incandescencia. Los cultivos en los que ha habido crecimiento se pueden transferir luego a la superficie de placas con agar donde se desarrollaran colonias como resultado del crecimiento y división de las células aisladas que han sido sembradas” VIII. • CONCLUSIONES Los medios de cultivo satisfacen las necesidades nutritivas de los microorganismos y pueden ser químicamente definido o complejo. • Los compuestos químicos presentes en una célula viva se forman a partir de nutrientes. • Los microorganismos se pueden cultivar en medios de cultivos que contienen los nutrientes necesarios. La obtención de cultivos puros requiere la puesta en práctica de técnicas asépticas. • Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la técnica aséptica se utiliza para prevenir la introducción de organismos adicionales al cultivo. Se han aplicado procesos de desinfección y esterilización para limitar o eliminar la presencia de microorganismos. IX. CUESTIONARIO Página 14
  15. 15. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS 1) ¿Que es un medio de cultivo? “Un medio de cultivo consiste en una mezcla equilibrada de agua y los nutrientes necesarios para lograr el crecimiento de un microorganismos.” Un medio de cultivo se refiere a aquel lugar en el espacio en el que se reúnen las características necesarias para el crecimiento y desarrollo, en este caso microbiano. Las sustancias necesarias para el crecimiento de los microorganismos pueden ser proporcionadas por un sistema vivo(in Vitro). 2) ¿Con que fin se realiza la siembra de estriación? Método de estriación o siembra por estría en superficie: se utiliza con el fin de aislar bacterias solas de un grupo con múltiples géneros. Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri (a las placas Petri también se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad, cultivos axénicos. 3) ¿Qué se entiende por cultivo puro y por cultivo mixto? • Cultivo axenico o puro: Se refiere a un cultivo microbiano que contiene una única clase de microorganismo. Para mantener u cultivo axenico o puro es esencial evitar la entrada en el de otros organismos.los Página 15
  16. 16. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS organismos no deseados, llamados contaminantes, son muy ubicuos, por lo que se han diseñado técnicas microbiológicas para evitarlos. Un método importante para obtener cultivos puros o axenicos y para asegurar la pureza de un cultivo es el uso de medios sólidos en placas petri. • Cultivo mixto: Es cuando contiene más de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Los cultivos puros se obtienen habitualmente de cultivos mixtos (que contienen varias especies), por métodos que separan las células de modo que, cuando se multiplican, cada una formará una colonia distinta, que luego puede usarse para establecer nuevos cultivos con la seguridad de que tendrán sólo un tipo de organismo. 4) ¿Por qué se incuba a 37c la mayoría de los cultivos? Porque es la temperatura más propicia para que las bacterias crezcan y se dividan más rápido y así formar colonias en un tiempo máximo de 24 horas, por ese se les pone fuente nutritiva a partir del agar, y así poder trabajar con ellas. 5) ¿En la figura siguiente describa los pasos de la técnica aséptica o transferencia aséptica? Técnica aséptica: técnica Técnica aséptica: técnica usada usada para para evitar evitar la la Contaminación durante la Contaminación durante la manipulación de cultivos yy manipulación de cultivos de medios de cultivos de medios de cultivos Página 16
  17. 17. MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA, AISLAMIENTO, TÉCNICA ASÉPTICA Y TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS TRANSFERENCIA ASEPTICA a) El asa de siembra se calienta hasta la incandescencia y se enfría brevemente al aire. b) El tubo se destapa c) Se pasa el extremo del tubo por la llama d) Se extrae la muestra con el asa esterilizada e) Tras tomar la muestra con el asa, se vuelve a flamear el extremo del tubo y la muestra se deposita en un medio estéril f) Se vuelve a tapar el tubo. El asa se recalienta de nuevo antes de finalizar su utilización. X. BIBLIOGRAFÍA • http://es.scribd.com/doc/14173131/5-Tecnicas-Basicas-Para-El-Cultivo-deMicroorganismos • BROCK –Biología de los microorganismos • http://html.rincondelvago.com/agar-agar.html • http://claudiazambrano.wordpress.com/category/bacterias/ • Pelczar, reid y chan (1995) Página 17

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