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IV. PROCEDIMIENTO:
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1. Agar MacConkey:
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VII. CONCLUSIÓN:
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aislamiento e identificación bacteriana

  1. 1. qwertyuiopasdfghjklzxcvbnmq wertyuiopasdfghjklzxcvbnmqw UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA ertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwe E.A.P. INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL rtyuiopasdfghjklzxcvbnmqwert yuiopasdfghjklzxcvbnmqwerty uiopasdfghjklzxcvbnmqwertyui AISLAMIENTO E opasdfghjklzxcvbnmqwertyuio IDENTIFICACIÓN BACTERIANA pasdfghjklzxcvbnmqwertyuiop asdfghjklzxcvbnmqwertyuiopa CURSO: Laboratorio de Microbiología sdfghjklzxcvbnmqwertyuiopas dfghjklzxcvbnmqwertyuiopasg DOCENTE: Mblgo. Carlos Azañero Díaz dfghjklzxcvbnmqwertyuiopasd GRUPO: ¨D¨ fghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfg ALUMNA: Aburto Rodríguez Ruddy hjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghj klzxcvbnmqwertyuiopasdlfghjk lzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklz Aislamiento E Identificación Bacteriana Microbiología 0
  2. 2. Aislamiento E Identificación Bacteriana I. INTRODUCCIÓN Las bacterias son capaces de modificar el ambiente que los rodea, captando sustancias necesarias para su multiplicación y liberando al medio, productos de desecho, enzimas, exotoxinas, etc. Las interacciones que cada tipo bacteriano establece con el entorno son propias y características, esta especificidad depende del genotipo de la bacteria y se expresa en un determinado equipo enzimático. Por ello, la caracterización de dichas enzimas es una útil herramienta para la identificación y caracterización bacteriana. Por lo anterior, el examen y conocimiento de características, no solomorfológicas, sino bioquímicas o fisiológicas, combinadas todas permiten conocer caracteres fenotipos útiles para la identificación de los microorganismos, y ponen en evidencia sus características que ayudan a explicar propiedades ecológicas de los microorganismos en estudio. La bacteria de pruebas bioquímicas que se empleara serán las clásicas y general de identificación, en este caso, para enterobacterias (Gram negativos); sin embargo, actualmente estos métodos están siendo sustituidos por micropruebas en sistemas semiautomáticos, que permiten una identificación más rápida y menos laboriosa imprescindible en grandes laboratorios (sistema API,etc.). También se emplean otros métodos no bioquímicos basados en técnicas serológicas o en técnicas biomoleculares (Hibridación de ácidos nucleicos, PCR, etc.). II. OBJETIVO Aplicar e interpretar algunas de las pruebas bioquímicas de identificación y/o caracterización bacteriana. Microbiología 1
  3. 3. Aislamiento E Identificación Bacteriana Aplicar la técnica del agotamiento por estrías para la obtención de cultivos puros y practicar la técnica de transferencia aséptica. Conocer y ejercitar el uso de diversos tipos de claves diagnósticos para la determinación de géneros y especies de microorganismos III. MATERIALES Material biológico Cultivo puro de Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella y Klebsiella Cultivos bacterianos de la familia enterobacteriaceae: bacilos Gramnegativas, aislados de placas con Agar MacConkey (1 cultivos Lactosa positivos y 1 cultivos Lactosa negativos). Material de Laboratorio Tubos de ensayo con agar TSI, medio SIM Tubos de ensayo con Agar citrato de Simmons Tubos de ensayo con caldo común Tubos de ensayo con caldo RMVP Prueba de citocromo oxidasa 1 Reactivo de Kovacs Rojo de metilo (pH 4) Hidróxido de potasio 0,1M Alfa naftol Microbiología 2
  4. 4. Aislamiento E Identificación Bacteriana IV. PROCEDIMIENTO: 1. Colonias Gram: Colocar cultivos puros (Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella y Klebsiella)en un tubos por el método de suspensión bacteriana. Luego coger una asada y esparcirla en el Agar MacConkey. Colocar las placas Petri a incubar a 37ºC por 12h. Observar la agrupación de colonias. 2. Catalasa: Se coloca una asada de cultivos puros de Staphylococcus y Proteus vulgaris en cada esquina del portajetos. Se agrega gotas de agua oxigenada y se mezcla. Se observa si hay presencia de burbujeo. Microbiología 3
  5. 5. Aislamiento E Identificación Bacteriana 3. Prueba oxidasa: Las tiras de papel que contienen parafinilendiamina se humedecen con cultivos puros de Escherichia coli y Pseudmonas. 4. Identificación bacteriana: A cada uno de los cultivos de Entereobacterias realizar la prueba de la Citocromo c oxidasa. Con un asa de siembre de platino o con un palillo de madera, entender el cultivo sobre la tira de papel reactiva para el Citocromo c oxidasa. Observar si aparece una coloración azul (posee citocromo c, prueba positiva). Esta prueba permite diferenciar el grupo Enterobacteriaceae (carece de citocromo c) de género Pseudmonas (que posee citocromo c). A partir de cada cultivo de bacilos Gramnegativas sembrar en los siguientes medios diferenciales;medio SIM, agar TSI, agar citrato de Simmons, calcio común y caldo RMVP. Incubar todos los medios a 37ºC durante 2hrs. Añadir los reactivos correspondientes a los cultivos según correspondan. Anotar los cambios de color en las distintas pruebas. Con ayuda de las figuras y tablas en anexo identificar las bacterias analizadas. Microbiología 4
  6. 6. Aislamiento E Identificación Bacteriana V. RESULTADOS: 1. Agar MacConkey: Suspensiónde Escherichia coli. Suspensión 1: Se observa formación de colonias rosadas y pequeñas dispersas por todo el agar MacConkey. Suspensión de Proteus vulgaris. Suspensión 2: Se observa formación de colonias muy finas amarillentas agrupadas y dispersas por todo el agar MacConkey. Microbiología 5
  7. 7. Aislamiento E Identificación Bacteriana Suspensión de E. coli y Proteus vulgaris: Suspensión 1 y 2: Se observa formación de colonias rosadas mezcladas con colonias amarillentas que crecen juntas por todo el agar MacConkey. Suspensión deSalmonella: Suspensión 3: Se observa formación de colonias circulares finas amarillentas agrupadas y dispersas por todo el agar MacConkey. SuspensiónKlebsiella: Suspensión 4: Se observa formación de colonias finas dispersas por todo el agar MacConkey. Suspensión de Salmonellay Klebsiella: Suspensión 3 y 4: Se observa formación de coloniasdispersas y combinadas por todo el agar MacConkey. Microbiología 6
  8. 8. Aislamiento E Identificación Bacteriana 2. Catalasa: 1 2 Muestra de Proteus vulgaris (1)y Staphylococcus (2): Se producen burbujeo para ambas muestras ya que ambas bacterias son aerobios facultativos. 3. Reacción Oxidasa: 2 1 Muestra de Pseudomonas(1)yE. coli (2): (1): colorea a azul indofenol ya que la bacteria tiene citocromoxidasa. (2): no colorea ya que está en estado reducido. 4. Identificación bacteriana: Medio SIM: Muestra de Escherichia coli: Precipitadoamarillo, la bacteria no puede degradar el triptófano y formación de gas. Difuminación de la bacteria hacia los lados, crecimiento difuso de la bacteria hacia ambos lados. Muestra de Salmonella: Precipitado negro Medio de cultivo se queda igual. La bacteria sólo crece en la línea de inoculación y formación de un ligero gas. Microbiología 7
  9. 9. Aislamiento E Identificación Bacteriana Agar TSI: Muestra de Escherichia coli: Observamos la fermentación de la lactosa, ya que cambio de color a amarillo y hubo rompimiento del agar por la producción de gas. Muestra de Salmonella: Observamos una coloración fucsia-negra, glucosa fermentada y producción de H2S Agar Citrato de Simmons: Muestra de Escherichia coli: Obtuvouna Reacción negativa, no se observa crecimiento y medio de color verde. Muestra de Salmonella: Se obtuvo una Reacción positiva, crecimiento y el medio de color turquesa en pico de flauta. Microbiología 8
  10. 10. Aislamiento E Identificación Bacteriana Agar RMPV: Muestra de Escherichia coli y Salmonella para VP: La muestra mantiene su color amarillento y por lo tanto es una prueba negativa puesto que el color rojo es evidencia de acetoína. Muestra de Escherichia coli y Salmonella para RM: La muestra vira a color rojo cereza evidenciando presencia de acetoína, prueba positiva. Caldo común: Muestra de Escherichia coli: Observamos que la muestra viró a color melón y un anillo rosado. Muestra de Salmonella: Observamos en la superficie la aparición de un anillo color amarillo. Microbiología 9
  11. 11. Aislamiento E Identificación Bacteriana 10 VI. DISCUSIÓN: Agar MacConkey, este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobias y anaerobias facultativas. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacterias desarrollan en el mismo. En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los dos agentes que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Este produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y las precipitación de las sales biliares. Los microorganismos no fermentados de lactosa producen colonias incoloras. Cuadro 1: fórmula para producir Agar MacConkey. Cuadro 2: resultados de algunas pruebas de microorganismos cultivados en Agar MacConkey. Microbiología
  12. 12. Aislamiento E Identificación Bacteriana 11 En la prueba de Catalasa; bacterias anaerobios facultativos son bacterias que proliferan mediante procesos oxidativos, utilizando oxigeno como aceptor terminal de electrones, o en anaerobiosis, empleando reacciones de fermentación para obtener energía. Ej. Streptococcus, E. coli(bacterias utilizadas en la práctica). La inmediata aparición de burbujas indica la presencia de catalasa. Las burbujas proceden del O2 generado en la reacción con la catalasa. En la reacción Oxidasa, las colonias bacterianas que tienen actividad enzimática, como en este caso, desarrollan un color azul oscuro, esto se debe a la reacción de la oxidasa que presenta un sistema citocromoxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana.El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones.un método en el cual las colonias oxidasa positivas en agar puede detectarse es sumergiendo la placa en un reactivo, y buscando colonias azuladas o marrones. La prueba de SIM determina si un organismo es móvil o inmóvil, si es capaz de liberar ácido sulfhídrico por acción enzimática de los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro y por último la capacidad de desdoblar el indol de la molécula triptófano, además que la consistencia del medio permite la observación de la movilidad de algunas bacterias. La prueba de TSI determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la determinación de posible Microbiología
  13. 13. Aislamiento E Identificación Bacteriana ácido sulfhídrico. En el agar tres azúcares de Kligler, en las enterobacterias todas fermentan la glucosa y algunas fermentan la lactosa y sacarosa. El indicador utilizado es rojo fenol que hace que vire a amarillo en medio ácido (fermentación). De lo contrario el medio se alcaliniza y el indicador vira al rojo (se libera NH3 al consumirse las peptonas del medio).Si hay producción de gas durante la fermentación de cualquiera de los azúcares: Hay formación de burbujas con quebraduras del fondo del agar. Si se produce sulfuro: Se observa ennegrecimiento del medio en el fondo o debajo de la superficie del agar, debido a la formación de FeS. La fermentación es un proceso metabólicode óxido-reducción que ocurre en un medio ambiente anaeróbico y en lugar de oxígeno, un sustrato orgánico sirve como el aceptor final de hidrógeno (electrones). En los sistemas de prueba bacteriológicos, este proceso se detecta observando cambios en indicadores de pH a medida que se forman productos ácidos. La prueba de Citratodetermina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento, provocando alcalinidad. Este método es utilizado para determinar habilidad de las bacterias para producir ácidos estables por fermentación de la glucosa. La utilización del citrato como única fuente de carbono produce la alcalinización del medio. Un medio con azul de bromotimol como indicador de pH. Buscar un color azul intenso (pH alcalino). La utilización de ácido cítrico, un ácido de seis carbonos que contiene tres grupos ácidos carboxílicos, se acompaña de una elevación de pH, de tal manera que la adición al medio de prueba de un colorante específico vira el color cuando se dan condiciones alcalinas. En la utilización por Salmonella en el agar citrato de Simmons. El cambio pH provoca un viraje en el color del indicador. Microbiología 12
  14. 14. Aislamiento E Identificación Bacteriana La prueba de caldo VP-RM determina la capacidad de algunos organismos de producir un producto final neutro, la acetoína a partir de la fermentación de glucosa.La reacción de VP se basa en la detección acetoína como producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. Ésta es metabolizada en ácido pirúvico, intermediario clave en la glucólisis. A partir del ácido pirúvico, una bacteria puede seguir muchas vías. La producción de acetoína (precursor de la producción de 2,3-butanediol) que es uno de los ciclos para la degradación de la glucosa en las bacterias. La formación de acetoína y butilenglicol es una vía alternativa del metabolismo del ácido pirúvico. Las bacterias que utilizan esta vía producen solo pequeñas cantidades de ácidos mixtos que son insuficientes para disminuir el pH del medio de rojo de metilo, lo bastante como para producir un cambio de color. Por este motivo muchas de las especies de Enterobacterias son VP positivas, con pocas excepciones son RM negativas y viceversa. En la prueba del Caldo Común se da la conversión del triptófano de las proteínas en indol, la detección del indol se realiza en medio de cultivo con dimetilaminobenzaldehído. Este método empleado para determinar si la bacteria a través de Triptofanasas puede degradar el Triptófano a indol, también para la determinar si hay producción de H2S a partir de aminoácidos azufrados y por último para determinar si la bacteria es móvil. Microbiología 13
  15. 15. Aislamiento E Identificación Bacteriana 14 VII. CONCLUSIÓN: Agar MacConkey: Los microorganismos no fermentados de lactosa producen colonias incoloras. La suspensión de Escherichia coli, Klebsiella evidencian formación de colonias rosadas;mientras que la suspensión deProteus vulgaris,Salmonella se observa colonias transparentes, finas, amarillentas, agrupadas y dispersas por todo el agar, lo cual indica que no se fermentó con la lactosa. En la prueba de Catalasa ambas bacterias (Proteus vulgaris y Staphylococcus) burbujean ya que son aerobios facultativos. En la reacción Oxidasa, las colonias bacterianas que tienen actividad enzimática, como en este caso, desarrollan un color azul oscuro; esta reacción fue positiva para la Pseudomonas, con laE. coliresultó negativo. Mediante la prueba de SIM los organismos móviles migraron de la línea de siembra y se difunden en el medio provocando turbulencia, es una reacción positiva, para nuestro caso se trató de la Escherichia coli; un crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea de siembra; es una reacción negativa, tratándose de la Salmonella. En la prueba de TSI, con la Escherichia coIise evidenció la fermentación de la lactosa, crecimiento microbiano y producción de gas, ocasionando la ruptura del agar; con la Salmonella se observó la variación a color guinda, la fermentación de glucosa y producción de H2S. En la prueba del Citrato una prueba positiva está representada por la aparición de un color turquesa en 12 o 24 horas, lo que indica que el microorganismo en estudio ha utilizado el citrato contenido en el medio con la producción de productos alcalinos, reacción ocurrida con la Salmonella y reacción negativa con la Escherichia coli. Microbiología
  16. 16. Aislamiento E Identificación Bacteriana La prueba de Caldo VP-RM determina la capacidad de algunos organismos de producir un producto final neutro, la acetoína a partir de la fermentación de glucosa. Para la prueba de VParrojó negativo en acetoína; pero para la prueba de RM es positiva porque hay presencia de acetoína y variación de color traslucido a rosa. La prueba de Caldo Comúnes positiva cuando hay presencia de indol, puesto que hay formación de un anillo rojo cereza en la superficie de la muestra; reacción positiva para el Escherichiacoli y negativa tratándose de la Salmonella. VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS: MIDIGAN/ PARKERA/ MARTINKO, Broock – Biología de los Microorganismos, Editorial Mc Graw Hill,10ma Edición, Impreso en España 1998, Capitulo 5, 6 y 24, Páginas:162, 108, 797-809. http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/morfologiayestructurabacteriana.pdf http://es.wikipedia.org/wiki/Incubadora http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap16.htm Microbiología 15

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