Diapo de erupcion dental

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Diapo de erupcion dental

  1. 1. <ul><li>ANDREA ROJAS </li></ul>Factor de diferenciación de las osteoprotegerinas y osteoclastos G.E. Wise, S.J. Lumpkin, H. Huang y Q. Zhang
  2. 2. Materiales y métodos <ul><li>Cultivo de células y modelos animales </li></ul><ul><li>Ratas de 6 a 7 días de nacido y Ratones de 3 a 4 días de nacido – exodoncia de 1º y 2º molar mandibular </li></ul>
  3. 3. <ul><li>Experimentos in vivo e in vitro : </li></ul><ul><li>In vitro: </li></ul><ul><li>Las células de las ratas o ratones fueron usadas las del 5º pasaje y las trataron con PTHrP humano o CSF-1 humano </li></ul><ul><li>Para experimentos tiempo-dependientes del PTHrP las células fueron incubadas con 10ng/mL por 5 min, 30 min, 1h y 3h </li></ul>
  4. 4. <ul><li>Para experimentos tiempo-dependientes del CSF-1, las células fueron incubadas con 10ng/mL por 5, 15, 30 min y 1, 3, 12, 24 y 48 horas. </li></ul><ul><li>Efectos dosis-dependiente: se trato las células con 1, 10, 25, 50 o 100 ng/mL de PTHrP por 30 o 24 horas </li></ul><ul><li>In vivo </li></ul><ul><li>Los folículos dentales fueron removidos de las ratas y ratones a 1, 3, 5, 7, 10 días de nacidos </li></ul><ul><li>6 folículos se necesitaron para el análisis de RNA y la expresión del OPG. </li></ul>
  5. 5. <ul><li>Aislamiento de RNA y transcripción reversa/ </li></ul><ul><li>cadena- reacción de la polimerasa (RT- PCR) </li></ul><ul><li>2µg- RNA – 1ª línea de la síntesis de cADN – transcriptasa reversa M-MLV. </li></ul><ul><li>Para examinar la expresión de mRNA del OPG en ratas y ratones se selecciono secuencia de nucleótidos del cADN </li></ul><ul><li>El cADN fue amplificado con PCR por 45 seg a 94°C, 1 min a 60°C y 2 min a 72°C </li></ul>
  6. 6. RESULTADOS <ul><li>El gen del OPG es expresado in vivo en el folículo dental de las ratas y ratones. </li></ul><ul><li>Cronológicamente hay una caída en la expresión a los 3 días de nacidos en las ratas y a los 5 días en los ratones. </li></ul><ul><li>In vitro , la expresión del OPG se inhibe cuando las células son incubadas en PTHrP (1ng PTHrP) </li></ul><ul><li>La inhibición en el tiempo se vio después de 30 min de incubación en PTHrP </li></ul>
  7. 7. <ul><li>La incubación de las células foliculares con CSF-1 inhibe la expresión del gen OPG (1ng CSF-1) </li></ul><ul><li>En estudios tiempo-dependiente muestra que el CSF-1 inhibe la expresión del OPG después de 12 h de incubación. </li></ul><ul><li>Moléculas como MCP-1 y IL-1 α , no inhiben al OPG </li></ul>
  8. 8. DISCUSION <ul><li>inhibición in vivo de la expresión del gen del OPG a los 3 días en ratas y 5 días en ratones tiempo cuando hay un máximo numero de osteoclastos alrededor del hueso alveolar del 1er molar mandibular </li></ul><ul><li>Simonet et al 1997, Yasuda et al. 1998 – 1999: OPG inhibe la formación y activación del osteoclasto, la reducción en la expresión del OPG permite que el osteoclasto se forme. </li></ul>
  9. 9. <ul><li>Yasuda el al. 1998 </li></ul><ul><ul><li>El ODF induce la activación del osteoclasto </li></ul></ul><ul><ul><li>la reducción de la expresión OPG puede ser critico para la reabsorción inicial del hueso alveolar por la activación de los osteoclastos </li></ul></ul><ul><li>Wise et al. 1995 y Philbrick et al. 1998 </li></ul><ul><ul><li>el CSF-1 y PTHrP son moléculas de la erupción que reducen la expresión del OPG, están localizadas en el folículo dental y adyacente al retículo estrellado </li></ul></ul><ul><li>La respuesta de la dosis del PTHrP en la expresión del OPG: hay un aumento en la expresión de las células foliculares de las ratas, pero es baja en los niveles control. </li></ul>
  10. 10. <ul><li>Wise et al. 1997 </li></ul><ul><ul><li>Ya que el CSF-1 inhibe la expresión de su propio receptor en concentraciones de 100ng/mL en las células del folículo dental, no es de sorprender el efecto sobre la expresión del OPG a estas concentraciones. </li></ul></ul><ul><li>Sakata et al. 1999 </li></ul><ul><ul><li>El gen del OPG también se expresa en células mesenquimales dentales en humanos. Hay una transcripción del OPG presente en fibroblastos gingivales, células del ligamento periodontal y células pulpares . </li></ul></ul><ul><li>La ausencia de la expresión del ODF en el folículo dental sugieren que las señales del ODF para la formación del osteoclasto viene del hueso alveolar adyacente a el folículo </li></ul>
  11. 11. Expresion de MyD88 en el folículo dental de la rata: implicaciones para la osteoclastogenesis y la erupción dental. Dawen Liu, Shaomian Yao, Gary E. Wise
  12. 12. Materiales y metodos <ul><li>Aislamiento del DF y cultivo de células del DF : </li></ul><ul><li>In vitro </li></ul><ul><li>El DF de las ratas fue aislado quirúrgicamente del primer molar mandibular a los 1, 3, 5, 7, 9 y 11 días postnatal para aislar el RNA. </li></ul><ul><li>Para el cultivo de las células el DF del 1er molar mandibular de ratas de 5 – 6 días de: tripsinizacion en un medio esencial mínimo (MEM) 10% penicilina/ estreptomicina y 0.2 %de fungizona. </li></ul><ul><li>células del 6-9 pasaje. </li></ul>
  13. 13. <ul><li>Aislamiento del ARN </li></ul><ul><li>El total del ARN fue aislada del DF o de sus celulas usando Tri- Reagent. </li></ul><ul><li>El ARN: DNasa I a 37°C por 1h. </li></ul><ul><li>El total del ARN fue cuantificada con una absorbancia de 260nm, usando un espectrofotometro. </li></ul><ul><li>La pureza del ARN fue confirmada con un radio de A260/A280 de 2.0 o mas alto. </li></ul>
  14. 14. <ul><li>Análisis de la micromatriz del ADN </li></ul><ul><li>Se realizo para determinar la expresión del Myd88 in vivo . </li></ul><ul><li>El total del ARN (1-1.5µg) del DF de las ratas a los 1-11 días de nacidas fue etiquetado con biotin -16-UTP. </li></ul><ul><li>La etiqueta del cRNA (4µg) fue hibridizado para las quimioquinas de las ratas y el receptor oligo del ADN (113 genes), en un horno a 60°C por 18h. Seguido por 2 lavadas a la misma temperatura </li></ul>
  15. 15. <ul><li>Después de la hibridación, la matriz fue bloqueada con un buffer a temperatura ambiente por 40 min. </li></ul><ul><li>Incubada con estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina por 10 min y lavada 4 veces por 5 min cada una. </li></ul><ul><li>La matriz fue visualizada por la incubación con un sustrato quemiluminescente CDP- Star a temperatura ambiente por 5 min. </li></ul>
  16. 16. <ul><li>La matriz fue visualizada por la incubación con un sustrato quemiluminescente CDP- Star a temperatura ambiente por 5 min. </li></ul><ul><li>Los datos de la expresión del gen fue analizado usando un software </li></ul><ul><li>los niveles de la expresión del gen fue expresado como una relación del gen Myd88 para el control interno del gen GAPDH. </li></ul>
  17. 17. <ul><li>TRANSCRIPCIÓN INVERSA EN TIEMPO REAL – </li></ul><ul><li>REACCIÓN DE LA CADENA POLYMERASA (RT-PCR) </li></ul><ul><li>Para detectar la expresión del gen 2µg del total del ARN fue inversamente trancrito usando la M-MLV para analizar la primera línea del cADN. </li></ul><ul><li>La transcripción inversa fue hecha a 37°C por 1h seguido por 10 min de incubación a 70 °C para inactivarla. </li></ul>
  18. 18. <ul><li>El RT-PCR fue usado para analizar la expresión del Myd88, NFKB1, MCP-1 y RANKL en las células del DF. </li></ul><ul><li>Los primers fueron designados basados en su secuencia de mRNA. </li></ul>
  19. 19. <ul><li>Inmunotincion: </li></ul><ul><li>mandíbulas de las ratas a los 5 días de nacidas fueron puestas con 10% de buffer neutro formalin, descalcificado, deshidratado, embebido en parafina y seccionado a 5µm de grosor. Para la detección de la expresión del Myd88 in vivo </li></ul><ul><li>La actividad endógena de la peroxidasa fue apagada por las secciones incubadas en 3% de hidrogeno de peróxido por 10 min. </li></ul><ul><li>se lavo 3 veces con TBS que contenía 0.025% de Triton X-1oo </li></ul>
  20. 20. <ul><li>Las secciones fueron bloqueadas a temperatura ambiente por 1h en TBS 2% de suero normal de conejo e incubadas con policlonal de cabra anti-humano Myd88 a concentraciones de 4µg ml -¹ en la noche a 4°C en TBS que contiene 2% de suero normal de conejo. </li></ul><ul><li>Para controles el anticuerpo primario fue remplazado con IgG de cabra. </li></ul>
  21. 21. <ul><li>expresión del MCP-1 en las células del DF: las células fueron transfectadas con el control siRNA o con Myd88 siRNA </li></ul><ul><li>A las 48 h las células transfectadas: etanol frio por 5min y secadas con aire </li></ul><ul><li>Las células fueron incubadas con anticuerpos de conejo, anti- ratas MCP-1 a concentraciones de 5µg ml -1 </li></ul><ul><li>Para los controles los anticuerpos fueron remplazados con IgG de conejo. </li></ul>
  22. 22. <ul><li>Tratamientos IL-1 α </li></ul><ul><li>Las células del Df fueron tratadas con IL-1 α a concentraciones de 5ng ml -1 por 1, 3, 6 y 12 h </li></ul><ul><li>Las células fueron aisladas para el RNA seguido para el análisis del RT-PCR en tiempo real usando primers para determinar la expresión del Myd88 </li></ul><ul><li>Tratamientos IL-1 α fueron también aplicados para las células del DF. </li></ul><ul><li>48h de la transfeccion IL-1 α (5ng ml -1 ) por 1-2h. </li></ul><ul><li>La expresión del NFKB1, MCP-1 Y RANKL se determino usando RT-PCR en tiempo real. </li></ul>
  23. 23. Análisis estadístico <ul><li>Datos de la micromatriz del ADN, ensayos quimiotacticos y osteoclastogenesis in vitro fueron analizados usando el programa SAS. </li></ul><ul><li>Se llevaron a cavo análisis de varianza (anova) para evaluar la expresión del gen cronológicamente </li></ul><ul><li>La media fue separada usando el test de la ultima diferencia significativa (LSD) con un nivel de significancia de P ≤ 0.05 </li></ul><ul><li>Datos de otros experimentos fueron analizados usando t.test a P ≤ 0.05 </li></ul>
  24. 24. resultados <ul><li>Expresión del Myd88 en el DF </li></ul><ul><li>la micromatriz de DNA fue hecha para determinar los niveles de la expresión del Myd88 y cambios cronológicos en el DF </li></ul><ul><li>Myd88 fue expresado en el DF desde el día 1 al día 11 postnatal </li></ul><ul><li>La expresión de Myd88 fue mas fuerte en el día 3 que es mas alta que en los otros días </li></ul><ul><li>Los niveles de expresión en el día 3 fue 1.7, 1.4 y 1.9 veces mas alto que en día 1, 5 y 7. </li></ul>
  25. 25. <ul><li>Para determinar si la proteína del Myd88 fue expresado, secciones del primer molar mandibular de las ratas fueron inmunomanchados para la expresión de las proteínas. </li></ul><ul><li>La mancha del DF para el Myd88 pero no hubo para el reticulo estrellado. </li></ul><ul><li>La mancha fue observada en el hueso alveolar y en el ápex de los ameloblastos </li></ul>
  26. 26. <ul><li>Regulacion de la expresion del Myd88 en las celulas </li></ul><ul><li>del DF por IL-1 α </li></ul><ul><li>Ya que la expresion del Myd88 fue mas alta al dia 3, los experimentos fueron conducidos para determinar que molecula contribuye a su regulacion. </li></ul><ul><li>fue usado la IL-1 α el cual es expresado en los dias 1-3 postnatal en el reticulo estrellado. </li></ul><ul><li>La expresion del Myd88 se aumento en las celulas del DF despues de 3h de tratameinto. </li></ul><ul><li>Alcanzo su expresion maxima despues de 6h </li></ul>
  27. 27. <ul><li>Reducción de la expresión del NFKB1 y MVP-1 en las </li></ul><ul><li>células del DF con la inhibición del Myd88 </li></ul><ul><li>Dicer siRNA inhibe la expresion del Myd88 por un 95-98% de 24 a 72h despues de la transfeccion determinado por el RT-PCR en tiempo real </li></ul><ul><li>La expresion del NFKB1 fue reducido a las 24 a laas 72 h despues de la transfeccion del siRNA </li></ul><ul><li>La expresion del MCP-1 esta sin cambios despues de 24 h de la transfeccion pero fue reducida a las 48 y 72h. </li></ul>
  28. 28. <ul><li>La expresión del EMAP-II se mantuvo sin cambios a las 24-72h </li></ul><ul><li>El Myd88 contribuye a la regulación del NFKB1 y MCP-1 pero no a la del EMAP-II. </li></ul><ul><li>La inhibición del Myd88 reduce la proteína del MCP-1 comparando sin inhibirla. </li></ul><ul><li>La inhibición del Myd88 reduce la expresión del mRNA y la expresión de la proteína. </li></ul>
  29. 29. <ul><li>requisito de Myd88 para la IL-1 α una mayor </li></ul><ul><li>expresión de NFKB1, MCP-1 y RANKL </li></ul><ul><li>Ya que Myd88 reporto estar involucrado en los caminos de señalización de la IL-1 α y que esta mejora la expresión de NFKB1, MCP-1 y RANKL, hicieron experimentos para determinar si la expresión depende del Myd88 </li></ul><ul><li>Reporto que el Myd88 se requiere para que la IL-1 α mejore la expresión del NFKB1, MCP-1 y RANKL </li></ul>
  30. 30. <ul><li>La reducción de la actividad quimiotactica y la </li></ul><ul><li>osteoclastogenesis in vivo por el CM de las células del </li></ul><ul><li>DF con la inhibición de Myd88 </li></ul><ul><li>El ensayo quimiotactico fue hecho para determinar si Myd88 esta involucrado en el reclutamiento de las células mononucleares (precursores de osteoclastos) usando CM de las células del DF con el Myd88 inhibido. </li></ul>
  31. 31. <ul><li>Los resultados sugieren que la inhibición del Myd88 reduce la actividad quimiotactica del CM de las células del DF y el Myd88 es requerido para mejorar la actividad quimiotactica por la IL-1 α </li></ul><ul><li>Para determinar si la reducción de la actividad quimiotactica afecta la osteoclastogenesis, las células mononucleares fueron atraídas por el CM donde fueron cultivadas medio de diferenciación de la osteoclastogenesis </li></ul><ul><li>Los resultados sugieren que el Myd88 contribuye a la osteoclastigenesis y es mejorado por la IL-1 α . </li></ul>
  32. 32. DISCUSION <ul><li>Myd88 es una molécula adaptadora involucrada en la señalización de la IL-!/IL-18/ TLR y esta presente en muchos tipos de células y tejidos. </li></ul><ul><li>Esta expresado en las células del DF in vivo. </li></ul><ul><li>la máxima expresión fue vista en el día 3 de las ratas, lo cual se correlaciona con la influencia de células mononucleares en el DF y una gran explosión de osteoclastogenesis a este punto </li></ul>
  33. 33. <ul><li>La osteoclastogenesis requiere de el reclutamiento de los precursores de osteoclastos y en el DF esto esta regulado por las moléculas quimioatractantes como CSF-1, MCP-1 y EMAP-II. </li></ul><ul><li>Las inhibición de la expresión del Myd88 reduce la regulación de la expresión del MCP-1 por la IL-1 α </li></ul><ul><li>In vivo la IL-1 α es tempranamente expresado en el retículo estrellado, un tejido adyacente al DF. </li></ul>
  34. 34. <ul><li>Los ensayos quimiotacticos presentados en este estudio confirman que Myd88 promueve el reclutamiento de los precursores de osteoclastos (células mononucleares) por las células del DF. </li></ul><ul><li>La reducción de la expresión del gen MCP-1 en las células del DF provocado por la inhibición del Myd88 se refleja en la reducción quimiotaxica de los precursores de los osteoclastos. </li></ul><ul><li>El efecto de Myd88 en el reclutamiento de los precursores de los osteoclastos se traduce en un efecto en la osteoclastogenesis. </li></ul>
  35. 35. <ul><li>In vitro reducir la expresión del Myd88 en las células del DF reduce la actividad quimiotactica y por lo tanto reduce la formación de osteoclastos. </li></ul><ul><li>Otros estudios han demostrado que Myd88 es esencial para elevar la expresión de MPC-1 inducido por infecciones bacterianas o por una lesión. </li></ul><ul><li>El reclutamiento de los precursores de osteoclastos y la señalización de la fusión celular por RANKL es esencial en la osteoclastogenesis. </li></ul>
  36. 36. <ul><li>RANKL es expresado en el DF y es regulado in vitro por la IL-1 α , TNF- α y transformado por TGF- β . </li></ul><ul><li>Los precursores de osteoclastos de ratones con Myd88 deficiente y ratones salvaje diferenciados en osteoclastos de forma similar sugieren que Myd88 no esta directamente involucrado en la osteoclastogenesis o que Myd88 independiente del NF- kB de señalización pueden existir en los precursores de osteoclastos. </li></ul>
  37. 37. <ul><li>Este estudio demostró que la inhibición de Myd88 en las células del DF da como resultado la reducción en la expresión del NFKB1 y MCP-1. </li></ul><ul><li>Myd88 también puede jugar un papel adaptador para la respuesta inmune innata, Myd88 esta involucrado en el camino del TLR a la inmunidad innata contra bacterias. </li></ul>

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