Sequenciamento de última geração na identificação de inversões e translocações  Ana Barbara Moura Cristiana Fuchs Jessyca ...
Principais variações cromossômicas (SNPs e SVs) O genoma humano possui um diversificado leque de variações genômicas SNPs ...
O banco de dados de variantes genômicas (DGV) Ferramentas de suporte para auxiliar técnicas moleculares e geneticistas, as...
Metodologias de sequenciamento  Pirosequenciamento – Método rápido O nucleotídeo adicionado a fita crescente de DNA é dete...
Próxima geração de sequenciamento (NGS) Tecnologias de sequenciamento de nova geração Sequenciamento de DNA em plataformas...
Pirosequenciamento – Método rápido
Solexa da Illumina
Applied Biosystems (SOLiD Syste)
Como surgiu a próxima geração de sequenciamento (NGS) Possibilidade a descoberta de variações estruturais na população hum...
Metodologias NGS <ul><li>Algoritmos baseados em densidade tag </li></ul><ul><li>Emparelhamento com o fim de mapeamento (PE...
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Emparelhamento com o fim de mapeamento (PEM) <ul><li>Emparelhamento no fim do mapeamento (PEM) são técnicas baseadas na mi...
Profundidade em cobertura (DOC) <ul><li>A alta cobertura da próxima geração de sequenciamento permite identificar um tipo ...
Aplicações das novas metodologia <ul><li>Análise genômica </li></ul><ul><li>Detecções de SNPs, SVs  </li></ul><ul><li>Dete...
CONCLUSÃO <ul><li>Em particular, quase metade do genoma humano consiste de sequências repetitivas, mas as leituras das reg...
REFERÊNCIAS <ul><li>1 A Closer Look at SNPs Suggests Difficulties. Elizabeth Pennisi. 1998. Science. 281:1787-1789. </li><...
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Sequenciamento de ultima geracao na identificacao de inversoes e translocacoes

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Avaliação na disciplina Citogenética ministrada pelo Prof. Rinaldo Pereira na Universidade Catolica de Brasilia (www.ucb.br)

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  • Sequenciamento de ultima geracao na identificacao de inversoes e translocacoes

    1. 1. Sequenciamento de última geração na identificação de inversões e translocações Ana Barbara Moura Cristiana Fuchs Jessyca Souza Kellyanne Rangel Patrícia Alves Universidade Católica de Brasília Citogenética Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira Pró-Reitoria de Graduação
    2. 2. Principais variações cromossômicas (SNPs e SVs) O genoma humano possui um diversificado leque de variações genômicas SNPs - Polimorfismos de um único nucleotídeo 1998 - Um único par de bases do DNA. Um nucleotídeo é trocado por outro qualquer. Modificações em Éxons ou Íntrons SNPs silenciosos – substituições sinônimas de códons Não alteram a composição de aminoácidos da proteína resultante Marcadores moleculares de predisposição do indivíduo a certos tipos de doenças dentre elas o câncer, ou ainda como alvos terapêuticos no desenvolvimento de novas drogas SVs - variações estruturais como inserções e deleções, rearranjos que podem ser inversões e translocações Mediadores de doenças e suscetibilidade a doenças que podem ser sistematicamente comparadas
    3. 3. O banco de dados de variantes genômicas (DGV) Ferramentas de suporte para auxiliar técnicas moleculares e geneticistas, assim com diagnósticos Armazena as sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos com suas anotações e algoritmos para posterior análise desses dados 60.000 CNVs, 850 e 30 000 inversões identificado em indivíduos saudáveis. Estudos de associação da doença genômica do câncer e estudos evolutivos. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html
    4. 4. Metodologias de sequenciamento Pirosequenciamento – Método rápido O nucleotídeo adicionado a fita crescente de DNA é detectado diretamente pela liberação e transformação de uma pirofosfato. Quimiluminescência detectada Roche diagnostic, Genome Sequencer 20 System Cascata com a polimerização do DNA – liberação do ppi taq polimerase ppi é convertido em ATP ATP sulfurilase ATP fornece energia Luciferase Oxida Luciferina que emite luz
    5. 5. Próxima geração de sequenciamento (NGS) Tecnologias de sequenciamento de nova geração Sequenciamento de DNA em plataformas capazes de gerar informação sobre milhões de pares de bases em uma única corrida. Plataforma 454 FLX da Roche - combinação de reações enzimáticas com liberação de um pirofosfato, oriundo da adição de um desoxinucleotídeo à cadeia 250pb Câmera CCD (charge-coupled device) acoplada ao sistema Solexa da Illumina - síntese usando DNA polimerase e nucleotídeos terminadores marcados com diferentes fluoróforos. Clonagem in vitro dos fragmentos em uma plataforma sólida de vidro (PCR) Applied Biosystems (SOLiD Syste) - catalisada por uma DNA ligase. fragmentado em um sonicador em fragmentos de 60- 90pb, para as bibliotecas de tags únicas. Alta eficiência e sensibilidade da plataforma analisa 320 amostras
    6. 6. Pirosequenciamento – Método rápido
    7. 7. Solexa da Illumina
    8. 8. Applied Biosystems (SOLiD Syste)
    9. 9. Como surgiu a próxima geração de sequenciamento (NGS) Possibilidade a descoberta de variações estruturais na população humana Expandir a base de dados destas variações para ajudar a compreender os fatores genéticos atrás das várias doenças. Fornece novas tecnologias de sequenciamento de alta cobertura, utilizando uma resolução muito maior. Ampliação clonal é realizada por métodos baseados em PCR, em vez de transformação bacteriana.
    10. 10. Metodologias NGS <ul><li>Algoritmos baseados em densidade tag </li></ul><ul><li>Emparelhamento com o fim de mapeamento (PEM) </li></ul><ul><li>Profundidade em cobertura (DOC) </li></ul>
    11. 11. Algoritmos baseados em densidade tag <ul><li>A maioria dos algoritmos baseados em densidade tag supõem que a sequência de leituras finais são únicas, embora também possam ser aplicados a dados de pareamento final. </li></ul><ul><li>A estratégia geral destes algoritmos é a busca de regiões genômicas cuja marca de contagens são significativamente diferentes. </li></ul><ul><li>No entanto, estes algoritmos geralmente só conseguem detectar a dosagem de alteração de variações estruturais como indels e CNVs e não pode detectar variações estruturais de dosagem invariável, tais como inversões e translocaçõesdas contagens esperadas. </li></ul>
    12. 12. Emparelhamento com o fim de mapeamento (PEM) <ul><li>Emparelhamento no fim do mapeamento (PEM) são técnicas baseadas na mineração de pares que têm sido usadas com sucesso para descobrir variantes estruturais, incluindo eventos de cópias invariáveis, em uma resolução muito maior do que os métodos baseados em arranjos. </li></ul><ul><li>As vantagens dos métodos baseados em PEM incluem a capacidade de detectar variações estruturais com dosagem invariável, maior sensibilidade para detectar menores variações estruturais, e a precisão da localização do ponto de interrupção. </li></ul><ul><li>Mas estes algoritmos têm poder limitado em detectar variações maiores que o tamanho de inserção. </li></ul>
    13. 13. Profundidade em cobertura (DOC) <ul><li>A alta cobertura da próxima geração de sequenciamento permite identificar um tipo completamente diferente de assinatura, baseado na profundidade da cobertura (DOC). </li></ul><ul><li>Em contraste com a maioria das assinaturas PEM, assinaturas DOC pode ser usado para detectar grandes eventos, na verdade, o evento maior, mais forte é a assinatura. </li></ul><ul><li>No entanto, eles não são capazes de identificar pequenos eventos que as assinaturas PEM, mesmo com baixa cobertura, são capazes de detectar, pois eles também são muito mais pobres em localizar pontos de interrupção. </li></ul>
    14. 14. Aplicações das novas metodologia <ul><li>Análise genômica </li></ul><ul><li>Detecções de SNPs, SVs </li></ul><ul><li>Detecção de mutações </li></ul><ul><li>Genotipagem </li></ul><ul><li>Identificação genética microbiana Ciências forenses </li></ul><ul><li>Análise filogenética </li></ul>
    15. 15. CONCLUSÃO <ul><li>Em particular, quase metade do genoma humano consiste de sequências repetitivas, mas as leituras das regiões ricas em repetir que alinham em vários locais são tipicamente ignorados. </li></ul><ul><li>Em vez de ignorar as leituras com alinhamentos múltiplos, é possível criar vários modelos para atribuir uma posição 'melhor' para essas leituras e usá-los para a descoberta de variações estruturais. </li></ul><ul><li>Por isso surgiu às novas metodologias de sequenciamento. </li></ul><ul><li>A medida que o conhecimento evoluiu, houve a necessidade de a tecnologia usada se adaptar á descoberta de translocações e inversões antes ignoradas. </li></ul><ul><li>A próxima geração de sequenciamento de demonstra promissora no estudo de genomas desconhecidos e na descoberta de atividades desconhecidas no genoma conhecido como o genoma humano. </li></ul>
    16. 16. REFERÊNCIAS <ul><li>1 A Closer Look at SNPs Suggests Difficulties. Elizabeth Pennisi. 1998. Science. 281:1787-1789. </li></ul><ul><li>2 Detecting structural variations in the human genome using next generation sequencing. Xi R, Kim TM, Park PJ. Brief Funct Genomics. 2010 Dec;9(5-6):405-15. Epub 2011 Jan 6. Review. </li></ul><ul><li>3 Fine-scale structural variation of the human genome. Eray Tuzun, Andrew J Sharp, Jeffrey A Bailey, Rajinder Kaul, V Anne Morrison, Lisa M Pertz, Eric Haugen, Hillary Hayden, Donna Albertson, Daniel Pinkel, Maynard V Olson & Evan E Eichler. 2005 Nature Genetics </li></ul><ul><li>4 Computational methods for discovering structural variation with next-generation sequencing. Medvedev P, Stanciu M, Brudno M. Nat Methods. 2009 Nov;6(11 Suppl):S13-20. Review. </li></ul><ul><li>5 Next generation DNA sequencing and its applications in plant genomics. Mayra Costa da Cruz Gallo de Carvalho, Danielle Cristina Gregorio da Silva. Ciência Rural, Santa Maria, v.40, n.3, p.735-744, mar, 2010. </li></ul><ul><li>6 A new class of cleavable fluorescent nucleotides: synthesis and optimization as reversible terminators for DNA sequencing by synthesis. TURCATTI, G. et al Nucleic acids research, v.36, e25, 2008. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articlesPMC2275100/?tool=pubmed>. Acesso em: 5 jun. 2009. doi: 10.1093/nar/gkn021 </li></ul><ul><li>7 Next -gene r a t ion DNA s equenc ing. Nature biotechnology, v. 26, n. 10, p.1135 - 1145, 2008. SHENDURE, J; J I, H. Disponível em: http://www.nature.com/nbt/journal/v26/n10/abs/ nbt1486.html>. Acesso em: 5 jun. 2009. doi:10.1038/nbtl486. </li></ul><ul><li>8 Reagents, methods, and libraries for bead-based sequencing. MCKERNAN, K. et al. US patent application 20080003571, 2006. </li></ul><ul><li>9 Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing. CLOONAN, N. et al. Nature methods, v.5, n.7, p.613-619, 2008. Disponível em: <http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n7/abs/nmeth.1223.html>. Acesso em: 5 jun. 2009. doi :10.1038/nme th.1223. </li></ul><ul><li>10 Bancos de Dados de Genomas. Luiz Fernando Bessa Seibel, Melissa Lemos e Sérgio Lifschit. Departamento de Informática Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro. </li></ul><ul><li>11 http://www.ibb.unesp.br/extensao/acidos_nucleicos/material_didatico/12_sequenciamento_DNA_metodos_e_principios.pdf </li></ul>
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