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Comparação de metodologias para detecção de variações cromossômicas e de sequências em retardo mental não sindrômico
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Comparação de metodologias para detecção de variações cromossômicas e de sequências em retardo mental não sindrômico

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Parte da Avaliação na Disciplina Citogenética, ministrada pelo Prof. Rinaldo Pereira na Universidade Católica de Brasília (www.ucb.br)

Parte da Avaliação na Disciplina Citogenética, ministrada pelo Prof. Rinaldo Pereira na Universidade Católica de Brasília (www.ucb.br)

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  • Pode ser causado tanto por fatores ambientais como por fatores genéticos
  • O diagnóstico por bandeamento cromossômico tem-se mostrado umas das ferramentas úteis para a detecção de alterações numéricas e estruturais no material genético.
  • É de suma importância ressaltar que, tais métodos não identificam quais mutações, apenas cromossomopatias. As mutações podem ser identificadas por testes bioquímicos e testes de biologia molecular.
  • os cromossomos são desproteinizados por ação da tripsina e, posteriormente são corados com Giemsa (de onde deriva o nome bandas G). Os cromossomos mostram um padrão de bandas claras e escuras, no qual as faixas escuras correspondem ao DNA rico em bases AT e poucos genes ativos; as bandas G claras têm DNA rico em bases GC e apresentam muitos genes ativos. Importância: detecção de deleções, inversões e duplicações em humanos.
  • Bandeamento De Alta Resolução: os cromossomos são analisados em estados de prófase e pró-metáfase e apresentando compactação de metáfase. São evidenciadas mais de 2000 bandas no cariótipo humano. A técnica pode ser usada na identificação das bandas Q, G e R e detecta alterações cromossômicas pequenas, como microdeleções, importante em estudos evolutivos. Esse tipo de bandeamento cora cromossomos preparados num estágio inicial da mitose (prófase ou prometáfase) que estão ainda em uma condicão relativamente não-condensada. Hoje, os laboratórios empregam técnicas de bandeamento de alta resolução o que aumenta o número de bandas visíveis e portanto o nível de resolução com que cada cromossoma pode ser estudado.
  • Há uma série de nomenclatura para classificação do SNP no genoma. Pode ser uma substituição, podendo ser conservativa ou não, com ou sem modificações estruturais de proteínas. Conseqüência de tal substituição: podem alterar a estabilidade e estrutura do RNA mensageiro, afetando na produção das proteínas As substituições mais freqüentes que ocorrem no DNA são as que envolvem bases nitrogenadas de mesma característica estrutural, ou seja, troca entre duas purinas (A/G ou G/A) ou duas pirimidinas (T/C ou C/T) e são denominadas transições. Tais substituições são denominadas polimorfismos quando as alterações ocorram nas células germinativas e passam de geração à geração se fixando na população numa freqüência alélica de 1%. O SNP pode ser de duas formas: em halogrupo (mutações em conjunto) ou individual (mutação em uma seqüência de DNA).
  • A partir do momento que é detectado um SNP no material genético, usa-se então a metodologia dos SNPs em larga escala, que incluem técnicas como o PCR em tempo real e seqüenciamento baseado na amplificação em uma única base que permite a visualização do SNP, além dos softwares e equipamentos de alta tecnologia utilizados nessa tecnica. (MUNERATO, 2005)
  • Transcript

    • 1. Componentes: Daisy de Farias Martins; Luciana Vieira de Almeida; Ludmilla Rodrigues de Souza; Yorrana Fortes de Carvalho. Professor : Dr. Rinaldo Wellerson Pereira Disciplina: Citogenética Brasília – DF, Junho 2011
    • 2. Retardo Mental
      • Limitações no funcionamento intelectual;
      • Mudança de comportamento do indivíduo.
        • Fatores ambientais;
        • Fatores genéticos;
      http://3.bp.blogspot.com/_L4g1GKn-bVo/SFnY-b8qu-I/AAAAAAAAAJU/W4lUnZPWUN4/s320/down.jpg
    • 3. Causas Importantes
      • Condições genéticas :
        • Muitas vezes é causada por genes anormais herdado dos pais, outra razão é o erro de combinação dos genes.
      • Problemas durante a gravidez :
        • Resultado da má formação do bebê durante sua formação, pode acontecer um erro na divisão ou até mesmo na multiplicação das células. Ou, quando a mãe apresenta alguma infecção durante a gravidez, ou ingere álcool frequentemente na gestação.
      http://www.not1.com.br/wp-content/uploads/2011/04/mutacao-gen%C3%A9tica.jpg
    • 4.
      • Problemas no nascimento :
        • Oxigenação insuficiente durante o parto.
      • Problemas de saúde :
        • Algumas doenças como Coqueluche, sarampo, meningite podem, causar deficiência intelectual. A desnutrição e a exposição a substâncias tóxicas também aumenta a probabilidade de ocorrência da doença.
    • 5. Prevalência
      • Crianças e adolescentes apresentam uma maior prevalência da doença;
      • Afeta cerca de 2-3% da população;
      • Alguns dos sintomas apresentados pelas crianças são:
        • Atraso na fala,
        • Alteração do comportamento,
        • Baixo rendimento escolar.
    • 6.  
    • 7.
      • Quando o Retardo Mental está associado com os demais sintomas clínicos ou anormalidades físicas, há muitas vezes, informações suficientes para o diagnóstico médico;
      • Mas, quando a doença não tem nenhuma dessas relações, acaba dificultando o diagnóstico médico prévio sendo, necessário um aprofundamento maior.
    • 8.
      • Com isso, passa-se a utilizar técnicas moleculares cada vez mais modernas para auxiliar na determinação do diagnóstico (Muhammad Ayub, 2010).
      • Essas novas técnicas, permitem detalhar melhor o genótipo, realizando uma comparação fenotípica, o que muitas vezes se torna difícil de detectar por técnicas mais antigas.
    • 9. Bandeamento cromossômico
      • Detecção de cromossomopatias
            • Alterações numéricas ;
            • Alterações estruturais ;
      • Observação precisa da morfologia dos cromossomos;
      • Visualização de bandas claras e escuras;
      • Detecção de falhas
    • 10. É importante ressaltar que ...
      • Tais métodos não identificam quais mutações, apenas cromossomopatias. As mutações podem ser identificadas por testes bioquímicos e testes de biologia molecular.
    • 11. Bandeamento cromossômico
      • Pareamento cromossômico;
        • Bandeamento G ;
        • Bandeamento C;
        • Bandeamento Q;
        • Bandeamento R;
        • Bandeamento T;
        • Bandeamento NOR;
        • Bandeamento de alta resolução;
        • FISH;
        • Troca de cromátide-irmãs;
    • 12. Bandeamento G
      • Corante
      • Giemsa
      • Tripsina
      • DNA rico em bases GC . Genes ativos
      • DNA rico em bases AT. Genes ativos
    • 13. Bandeamento de alta resolução
      • Cromossomos analisados na metáfase.
      • Estudo de anomalias cromossômicas não detectáveis através do cariótipo de banda G.
      • Tem maior resolução
    • 14.
      • Princípio do Método
        • Hibridização entre uma sonda marcada e um cromossomo proveniente de uma amostra de interesse.
        • Valor limitado para a descoberta de pequenas aberrações cromossômicas.
        • Baixa resolução
          • Estudos tem sido realizados a fim de amentar a resolução.
      http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/images/fish.gif
    • 15. FISH
      • Detectam anormalidades não previstas pelo bandeamento;
      • Porém não detectam pequenos rearranjos e desequilíbrios nos cromossomos verificados pelo CGH-array, que possui maior resolução.
    • 16. CGH array
      • É uma técnica de hibridização genômica comparativa;
      • Método rápido;
      • Avalia ganhos e perdas submicroscópicas do material genético.
    • 17. Hibridização genômica comparativa
      • DNA de referência;
      • Lâmina de vidro contendo sondas de DNA.
      http://www.cghtmd.jp/CGHDatabase/about_e/559.pdf
    • 18. CGH array
      • São divididos em 2 grupos:
        • BACs array - cromossomos artificiais de bactérias;
        • Oligonucleotídeos array - possui uma potência alta de resolução;
        • Os oligonucleotídeos variam de 25 para 85mers de comprimento.
    • 19. CNV
      • Número de Cópias Variantes;
      • Ocorrem durante a meiose dos gametas dos pais;
      • Identificação de novos distúrbios genômicos.
    • 20. CGH array
      • Teste genético de escolha :
        • Idiopática de retardo mental;
        • Anomalias congênitas múltiplas.
    • 21. SNPs - single-nucleotide polymorphism
      • Os polimorfismo de nucleotídeos únicos (SNPs) são alternância dos nucleotídeos A, C, G, T em uma freqüência alélica mínima de 1% numa dada população e podem estar presentes em regiões codificadoras e não-codificadoras dos cromossomos (BROOKES, 1999).
    • 22. Nomenclaturas para os SNPs
      • Substituição
        • Conservativa ou não-conservativa
        • Com ou sem modificações estruturais de ptn
        • Transições - troca de duas bases da mesma característica
          • Mais comum
        • Polimorfismos – células germinativas
      • SNP
          • Halogrupo
          • Individual
    • 23.
      • SNP detectado
      • Metodologia SNP em larga escala
      • PCR em tempo real
      • Seqüenciamento na amplificação de uma única base
      • Softwares e equipamentos de alta tecnologia
    • 24. Next-Generation Sequencing (NGS)
      • Tecnologia de última geração;
      • Sequenciamento do genoma
        • Regiões de éxons.
      • Detecta a presença de cópias ou variação de um único nucleotideo
        • Detecção se dá pela comparação da localização das seqüências obtidas mediante a presença de uma sequencia de DNA de referência.
      • Utilização de sistemas de filtragem;
      • Menor custo;
      • Mais informações.
    • 25. Next-Generation Sequencing (NGS)
      • Interpretação dos resultados
      • Cautela – resultados falso-positivos e falso-negativos.
          • Existência de milhares de variantes comuns no genoma humano, de origem diversa, por exemplo, devido a mutações sem sentido.
      • Difícil interpretação
        • Associação de variantes raras como potencias patogênicos ou não.
          • É provável que cada indivíduo, saudável ou não, carregue essas múltiplas variações de sequencia em seu genoma, dessa maneira mesmas podem estar presentes em pessoas sadias.
        • Complicação na identificação da variante responsáveis pela patologia apresentada, já que as mesmas se encontram em grande quantidade no genoma.
    • 26. Next-Generation Sequencing (NGS)
      • Aplicação do sequenciamento de éxons.
      • Irmãos possuíam uma mutação no éxon 8 do gene TECR e uma substituição do aminoácido prolina pela leucina na proteína TECR, responsável pela síntese de ácidos graxos relacionada com o desenvolvimento normal do sistema nervoso central.
      Minal CALISKAN, et al 2011. Exome sequencing reveals a novel mutation for autosomal recessive non-syndromic mental retardation in the TECR gene on chromosome 19p13. Human Molecular Genetics, 2011, Vol. 20, No. 7 1285–1289.
    • 27. Conclusão
      • Vantagens:
        • Técnicas mais sensíveis e específicas;
        • Diagnóstico mais rápido e eficaz;
      • Desvantagem:
        • Informações abrangentes e sem respostas.
    • 28.
      • ALKAN, Can, et al. Personalized copy number and segmental duplication maps using next-generation sequencing . Nature Genetics volume 41 | number 10 | october 2009.
      • APARACIO, Samuel, et al. Does massively parallel DNA resequencing signify the end of histopathology as we know it? Journal of Pathology J Pathol 2010; 220 : 307–315.
      • BALKAN et, al. Cytogenetic analysis of 4216 patients referred for suspected chromosomal abnormalities in Southeast Turkey. Genetics and Molecular Research 9 (2): 1094-1103 (2010).  
      • BALLARATI, et al. Cytogenetic, FISH and array-CGH characterization of a complex chromosomal rearrangement carried by a mentally and language impaired patient . European Journal of Medical Genetics 52 (2009) 218–223.
      • CALISKAN, Minal et al . Exome sequencing reveals a novel mutation for autosomal recessive non-syndromic mental retardation in the TECR gene on chromosome 19p13. Human Molecular Genetics, 2011, Vol. 20, No. 7 1285–1289.
      •  
    • 29.
      • KAULFMAN, et al. The genetic basis of non-syndromic intellectual disability: a review . J Neurodevelop Disord (2010) 2:182–209
      • MOROZOVA, Olena; MARRA, Marco. From cytogenetics to next-generation sequencing technologies: advances in the detection of genome rearrangements in tumors. Biochem. Cell Biol. 86 : 81–91 (2008) .
      • ROBINSON, Peter N . Whole-exome sequencing for finding de novo mutations in sporadic mental retardation. Robinson Genome Biology 2010, 11:144.
      • SHAW-SMITH, C et al. Microarray based comparative genomic hybridization (array-CGH) detects submicroscopic chromosomal deletions and duplications in patients with learning disability/mental retardation and dysmorphic features . J Med Genet 2004;41:241–248. doi: 10.1136/jmg.2003.017731.
      • SISMANI, et al. Cryptic genomic imbalances in patients with de novo or familial apparently balanced translocations and abnormal phenotype. Molecular Cytogenetics 2008, 1:15.
      • VASCONCELOS, Marcio M. Mental retardation . J Pediatr (Rio J). 2004; 80(2 Supl):S71-S82.

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