Hit Triage in RNAi Screens
                          
  Making Use of Interac1on and Pathway Data   
                     ...
Outline 

•  The NCGC RNAi infrastructure 
•  Selec:on & Triage 
•  Case Studies 
Trans‐NIH RNAi Ini6a6ve ‐ Mission 

To establish a state of the art RNAi screening facility to perform
genome-wide RNAi sc...
Pilot Phase Screens
                   
RNAi Informa6cs Toolset 

• Local databases (screen data, pathways, 
  interac:ons, etc). 
• Commercial pathway tools.  
•...
Back End Services
                                                  

•  Currently all computa:onal analysis performed 
  ...
User Accessible Tools 
RNAi Analysis Workflow 
                                  Raw and              GO 
                                 Process...
Hit Selec6on Methods
                                        

•  Thresholding                        Negative
           ...
Hit Triage Methods
                                              

•  Given that we end up with a rela:vely small 
   numb...
CPT Sensi6za6on 




       TOP1 poisons prevent DNA religation resulting in replication-dependent double
       strand br...
Screening Protocol
                                                           




Screen conducted in the human breast ca...
Hit Selection
                                                  Follow-Up Dose Response Analysis
                         ...
Triage  with PPIs
                                                                       

                 •  For each ge...
Looking in Pathways
                                           

•  Using the ini:al hit list based on differen:al 
   anal...
Looking in Pathways
                                              
•  We then iden:fy genes from these pathways 
   that w...
Looking in Pathways
                                         

•  The reconfirma:on rate of pathway‐derived 
   hit list me...
Are These Genes Relevant? 

•  Some are well known to be CPT‐sensi:zers 
•  Consider a HPRD PPI sub‐network 
   correspond...
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection

1,259

Published on

Published in: Technology
0 Comments
2 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total Views
1,259
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
16
Comments
0
Likes
2
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Hit Triage in RNAi Screens マking Use of Interaction and Pathway Data - Enhance Hit Selection

  1. 1. Hit Triage in RNAi Screens   Making Use of Interac1on and Pathway Data   to Enhance Hit Selec1on  Rajarshi Guha  NIH Chemical Genomics Center   March 18, 2010  GeneGO User Group Mee5ng, Boston, MA 
  2. 2. Outline  •  The NCGC RNAi infrastructure  •  Selec:on & Triage  •  Case Studies 
  3. 3. Trans‐NIH RNAi Ini6a6ve ‐ Mission  To establish a state of the art RNAi screening facility to perform genome-wide RNAi screens with investigators in the intramural NIH community. •  Gene func:on  •  Pathway analysis  •  Target ID  •  Compound MoA  •  Drug antagonist/ agonist 
  4. 4. Pilot Phase Screens  
  5. 5. RNAi Informa6cs Toolset  • Local databases (screen data, pathways,  interac:ons, etc).  • Commercial pathway tools.   • Custom soKware for loading, analysis and  visualiza:on. 
  6. 6. Back End Services   •  Currently all computa:onal analysis performed  on the backend  •  R & Bioconductor code  •  Custom R package (ncgcrnai) to support NCGC  infrastructure  –  Partly derived from cellHTS2  –  Supports QC metrics, normaliza:on, adjustments,  selec:ons, triage, (sta:c) visualiza:on, reports  •  Some Java tools for  –  Data loading  –  Library and plate registra:on 
  7. 7. User Accessible Tools 
  8. 8. RNAi Analysis Workflow  Raw and  GO  Processed  annota:ons  Pathways  Data  Interac:ons  • Summary  Normaliza:on  • Thresholding  Hit Triage  sta:s:cs  • Median  • Hypothesis  • GO seman:c  • Correc:ons  • Quar:le  tes:ng  similarity  • Background  • Sum of ranks  • Pathways  • Interac:ons  QC  Hit Selec:on  Follow‐up  Hit List 
  9. 9. Hit Selec6on Methods   •  Thresholding  Negative Positive ! ! 150 ! ! ! ! ! Sample ! ! ! ! ! •  Hypothesis tes:ng  ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! !! !! ! ! ! ! ! !! ! ! !! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! !! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! !! !! ! ! !! !! ! ! ! ! !! !! !! ! ! !! !! ! !!! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !! ! !! ! !! ! ! ! !! !! ! !! ! !! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !! ! ! ! !! ! ! ! !! ! !!! ! ! !! ! !!! ! ! !! !!! ! !! ! ! ! !! ! !!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! !! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! !! !! ! ! !! ! ! !! ! ! !! ! ! ! !! ! ! ! !! Signal ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! !! !! ! !! !! ! ! !! ! !! ! ! ! !! ! ! !! ! ! ! ! !! 100 ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! !! ! !! !! !! ! ! !!! ! !!!! ! ! ! !! !!!! ! !!! !! !!! ! !!!!!! ! ! ! ! ! ! !!! ! !!! !! !! !! ! ! ! !! ! ! ! ! !! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! !! ! ! ! ! ! !! !! ! ! ! !! !! !!!!! !! ! ! !!! ! !! ! ! ! ! !!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !! ! ! ! !! ! !!! !! !! ! ! ! ! !! !! ! !!!!! ! !!! ! ! ! ! !! !!! !! ! ! !!!! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !!! ! !!!! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !!!! !! ! ! ! ! !! ! !! ! !! ! ! ! ! ! ! ! !!! ! ! !! ! ! !! ! ! ! !! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! !! !! !! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !!! !! ! ! ! ! !! !! ! !! ! ! ! ! !!! ! ! !!! ! !! ! !! ! ! !!! ! !!!! ! ! ! ! ! !!!! !!!! !! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! !! !! ! ! !! ! ! ! ! !! ! !!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !!! ! !!! ! ! ! ! !!! ! ! ! ! ! ! ! ! !! !! !!! !! ! ! !! ! ! ! !! ! !!! ! ! ! ! !! ! ! ! ! !! ! !! !! ! ! ! !! !!! ! !!!!!! !!! !! !! ! ! ! ! !!! ! ! ! ! ! !! !! ! ! !! !! !! ! !! ! ! ! !!! ! !! ! !! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! !! ! !! ! ! !! ! ! ! ! ! !! !! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! ! ! ! ! !! !! ! !! ! ! ! ! ! !! ! !! !! ! ! ! ! !!! !! ! !! ! !! !! ! ! !!!!!! ! ! !! !!! ! !!! !! ! !! ! !! !! ! ! ! ! !! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !!! !!! ! ! ! ! !!!! ! !! ! ! ! !!! ! ! !! ! ! !! ! !! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! !!!! !!!!! ! !! !!! ! ! !! ! ! ! !!! !! ! !! ! ! ! ! !!! ! ! ! !! !!! ! ! ! !! ! !!! !!!! !! !! ! !! ! !! !! !! ! ! !! !!! ! !! ! !! ! ! !! !!! •  Sum/mean of ranks  ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! !! ! !! ! ! !!! ! !! ! !!! ! !! ! ! ! ! ! ! ! !! ! !!! ! ! ! ! ! ! ! !!! ! ! ! !! ! ! ! ! !! ! ! !! !!! !! !! ! ! !!! ! !!!! !! ! !!!! !! ! ! !! ! ! !! !! !!!!! ! !! !! ! ! !! ! ! !! ! ! ! !!! ! ! ! ! ! ! !! !! ! ! !! !! !!! ! !! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! !! ! ! !! ! ! ! ! ! !! !! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! !! !! ! ! ! !! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! !! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !!! !!! ! ! ! ! !!! !!! !!!!! ! ! ! !!!! !!! ! !!!!! !!! ! !!! !! !! ! ! ! ! ! ! ! !! !!! ! !! !! ! ! !!! ! ! !!! !! !! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! !!!! !! ! !! !!! !! !! !!!! !! ! ! !! !! ! ! ! ! ! !!! ! ! ! ! ! ! !!! ! ! !! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! !!!! ! !!! ! ! !! ! ! !!! ! ! !! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! !! ! ! ! ! ! ! ! !! ! !!! ! !! !! ! ! ! ! !! ! !!!!!!! ! ! ! ! !! ! ! ! !! ! !! ! ! !! ! ! !! ! !!! ! ! ! ! !! ! ! ! !! ! !! ! ! ! ! !! !! !!! ! !! !! ! ! !! ! !! ! ! !! ! ! !! !! ! ! !! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! !! !!! ! ! ! ! !! !! ! !! ! !! !! ! !! ! ! !! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! !! !! !!! ! ! !! !! ! !! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !!! ! ! ! ! !! ! ! ! ! !!! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! !!! !!! ! ! !! !!! ! ! ! !!!! !! !! ! !! ! ! ! !! ! ! ! ! !! ! !! ! ! ! ! ! !! ! !! ! !! ! ! ! ! ! !! !! ! ! ! !!!! !! !! !! ! ! ! ! !! ! !! ! ! !! !! !!! !! ! ! ! !! ! !! ! ! !! ! !! ! ! ! ! !! !! !! ! !! ! ! ! ! ! !! !! !! ! ! ! ! !! !! !!! ! ! ! ! ! !! ! !! ! ! ! !! !!! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! !! ! !! ! ! ! !! 50 !! ! !!! !! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! !! ! ! ! ! !! ! ! !! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !!! !! !! !! ! ! ! ! ! ! ! !! ! !! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !!! !! !! !! ! !! !! ! !!! ! ! ! ! !!! !! !! !!! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !! ! ! ! ! !!! !! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! !!! ! ! !! ! ! ! ! !! ! !! !! ! ! ! !! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !! !!! !!!! !! !! ! !!!!! ! ! !! ! ! ! !! !! ! !!! ! !!! ! ! ! ! ! !! !! ! ! ! ! ! !! !! !! !! !!! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! !! !!! ! !! ! ! ! ! !! ! !! ! !! ! !!!!! ! ! ! ! !! ! ! !! ! !! !! ! ! !! ! ! !! ! ! ! ! ! !! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !! !! ! !! ! ! ! ! ! !! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! !! !!! ! !! ! ! !! ! !! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !!!! ! ! !! !! ! ! !!!! !! !! ! ! !! ! !! ! ! ! ! !! ! !! ! ! !! ! ! ! ! ! !!! !!! ! ! ! ! ! ! !!! ! !!!! ! ! !!! ! !! ! ! ! !! ! ! ! !! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! !! ! ! ! !! !! ! ! ! ! ! ! ! !! ! !! ! ! ! ! ! !! !! ! ! ! ! !! ! !! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! !! ! !! !! ! ! ! ! !! ! ! ! !! !! ! ! ! ! ! ! ! !! !!! ! ! ! ! !! ! ! !! ! !! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! !! ! ! ! !! !! !! ! ! !! ! ! ! ! ! !! ! !! ! ! ! ! ! !! ! ! !! ! ! ! !! ! ! ! !!!!! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! !!! ! ! ! !! ! ! !! ! ! ! !! ! ! ! !! !! ! ! !! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! !!! ! !! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! !! !! ! ! !! !! ! ! ! ! !! ! !!! ! ! ! ! ! ! ! !! ! !! ! ! ! !! !! !! !! ! !!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! !!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !!! !! ! ! ! !! ! ! ! !! ! !! ! ! ! ! ! !! ! !!!! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! !! !!! !! ! !! ! !! ! !!! ! ! !! ! ! ! !! !! !! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !! ! ! ! ! !! ! ! ! !! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! 0 Plate Number •  In all cases, some degree of abitrariness  •  In many cases, poor concordance between  selec:on methods  •  Gives us a selec:on of siRNA’s  •  Iden:fy genes based on number of siRNA’s 
  10. 10. Hit Triage Methods   •  Given that we end up with a rela:vely small  number of hit genes, we need to expand it  •  Triage iden:fies other “relevant” or  “borderline” genes to be included for follow‐up  •  Methods  –  Protein‐protein interac:on data  –  Pathway membership data  –  GO terms  –  Network sta:s:cs 
  11. 11. CPT Sensi6za6on  TOP1 poisons prevent DNA religation resulting in replication-dependent double strand breaks. Cell activates DNA damage response (e.g. ATR). Pommier, Y., Nat. Rev. Cancer, 2006.
  12. 12. Screening Protocol Screen conducted in the human breast cancer cell line MDA-MB-231. Many variables to optimize including transfection conditions, cell seeding density, assay conditions, and the selection of positive and negative controls.
  13. 13. Hit Selection Follow-Up Dose Response Analysis ATR Screen #1 siNeg siATR-A Viability (%) siATR-B siATR-C Sensitization Ranked by Log2 Fold Change CPT (Log M) Screen #2 MAP3K7IP2 siNeg siMAP3K7IP2-A Viability (%) siMAP3K7IP2-B siMAP3K7IP2-C siMAP3K7IP2-D Sensitization Ranked by Log2 Fold Change CPT (Log M) Multiple active siRNAs for ATR, MAP3K7IP2, and BCL2L1.
  14. 14. Triage  with PPIs   •  For each gene in the hit list iden:fy interac:on  partners  –  Currently using HPRD  –  Will be switching to MIMI  •  This added MAP3K7 to the hit                              list, which   MAP3K7                              reconfirmed nicely  siNeg Viability (%) siMAP3K7-A siMAP3K7-B siMAP3K7-C •                                               siMAP3K7-D CPT (Log M) http://www.eecs.umich.edu/db/mimi/
  15. 15. Looking in Pathways   •  Using the ini:al hit list based on differen:al  analysis we get a list of relevant pathways 
  16. 16. Looking in Pathways   •  We then iden:fy genes from these pathways  that were not ini:ally selected  •  3 genes from the IL‐10 signalling pathway  were each knocked down by a single siRNA  –  CD14  –  PIK3CD  –  PIK3R3  •  Similarly, we add in  genes from other  pathways 
  17. 17. Looking in Pathways   •  The reconfirma:on rate of pathway‐derived  hit list members was low (< 10%)  •  Not too surprising   •  PPI‐derived hit list members worked beger 
  18. 18. Are These Genes Relevant?  •  Some are well known to be CPT‐sensi:zers  •  Consider a HPRD PPI sub‐network  corresponding to the Qiagen HDG gene set  •  How “central” are these selected genes?  –  Larger values of betweenness  3.0 indicate that the node lies on  2.5 many shortest paths  2.0 log Frequency –  Makes sense ‐ a number of   1.5 them are stress‐related  1.0 –  But some of them have very low  0.5 betweenness values  0.0 0 2 4 6 log Betweenness
  1. A particular slide catching your eye?

    Clipping is a handy way to collect important slides you want to go back to later.

×