Toxicidad Aguda del Aceite Esencial Tomillo
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En la siguiente presentación se encuentra resumido la extracción del aceite esencial de tomillo, rendimiento del mismo, la toxicidad aguda por el método de DL50 mediante artemias salinas y la ...

En la siguiente presentación se encuentra resumido la extracción del aceite esencial de tomillo, rendimiento del mismo, la toxicidad aguda por el método de DL50 mediante artemias salinas y la toxicidad mas especifica mediante los Polimorfonucleares.

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Toxicidad Aguda del Aceite Esencial Tomillo Toxicidad Aguda del Aceite Esencial Tomillo Presentation Transcript

  • Universidad Nacional San Agustín de Arequipa Wright SAC – Div. WrightLabTOXICIDAD AGUDA (DL50) DEL ACEITEESENCIAL de Thymus vulgaris L. “tomillo”FRENTE A Artemia sp. y EFECTO SOBRE POLIMORFONUCLEARES CONSUELO E. ORIHUELA ABARCA RENEE M. CONDORI APAZA SAUL PEREZ MONTAÑO
  • ANTECEDENTES GENERALESJUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACIÓNEl incremento del uso de los aceites esenciales en; la industria farmacológica,cosmética, aromaterapia, bebidas y productos alimenticios, han creado una grannecesidad de análisis para determinar su toxicidad y así poder realizar un usoadecuado de estas sustancias.El modo de acción de la mayoría de aceites esenciales con propiedadantibacteriana, reside en su capacidad de dañar la integridad de la membranacelular bacteriana, además de afectar el pH del medio intracelular y el equilibrio delos iones inorgánicos. Este efecto se aprecia sobre todo en aquellos aceites quetienen en su composición timol y carvacrol, como es el caso del aceite esencial detomillo.La mayoría de estos trabajos coinciden en que uno de los aceites con mayorpotencial bacteriostático y bactericida es el aceite esencial de tomillo, el queademás por su alto contenido en compuestos fenólicos, es uno de los aceites conmayor actividad antioxidante.El carácter lipofílico de los compuestos fenólicos explica la capacidadantimicrobiana del aceite de tomillo, debido a su capacidad de incorporarse a lamembrana lipídica de la célula microbiana, provocando la desestabilización de lamembrana, incrementando su fluidez y permeabilidad, deja salir el contenidocelular por lo cual la célula finalmente muere.
  • OBJETIVOSObjetivo GeneralDeterminar la toxicidad aguda del aceite esencial de Thymus vulgarisL. “tomillo” sobre Artemia sp. y su efecto en polimorfonucleares.Objetivos Específicos. Extraer aceite esencial de Thymus vulgaris L. “tomillo”. Determinar la DL50 del aceite esencial de Thymus vulgaris L. “tomillo” mediante el bioensayo con Artemia sp. Determinar el efecto del aceite esencial de Thymus vulgaris L. “tomillo” sobre la viabilidad de polimorfonucleares con la DL50 obtenida. Determinar el efecto del aceite esencial de Thymus vulgaris L. “tomillo” sobre la funcionalidad de polimorfonucleares con la DL50 obtenida.
  • TOMILLO Thymus vulgaris L.Clasificación taxonómica Reino: Plantae División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Orden: Lamiales Familia: Lamiaceae Subfamilia: Nepetoideae Tribu: Mentheae Género: Thymus Especie: T. vulgarisDescripción botánica:Es un arbusto de 0.10 a 0.40 m. Tallo tortuoso, leñoso, muy ramificado,cuadrangular. Hojas opuestas, oblongo-lineares, pequeñas (hasta 8 x 1,5 mm),de margen revoluto y no ciliado. Cáliz bilabiado, el labio superior formado portres dientes triangulares, anchos y el inferior por dos dientes largos y estrechosde márgenes ciliados. Las flores son rosadas, pequeñas, en corimbo, seencuentran dispuestas en verticilios. Los 4 estambres sobresalen de la corola yel fruto es un tetraquenio, lampiño, de color marrón.
  • Composición QuímicaEsta planta contiene no menos de 1% de aceite volátil y por lo menos de0.5% de fenoles. Los principales componentes de Thymus vulgaris sonel timol y el carvacrol (más del 64% del aceite) junto con el linalol, cimol,p-cimeno, timeno, pineno, apigenina, luteolina, y 6-hidroxiluteolinaglicosidos, así como flavonoides di-, tri- y tetrametoxilados. El fármacotambién contiene flavonoides, como luteolina, apigenina, naringenina,eriodictol, cirsilineol, salvigenina, cirsimaritina, timonina y timusina, entreotros.También contiene heterósidos monoterpénicos, ya que una pequeñaparte de timol y carvacrol se halla en forma de glucósidos o degalactósidos6. Presenta otros componentes como los ácidos fenoles:cafeico, rosmarínico; taninos y triterpernos (ácidos ursólico y oleanólico).Sus componentes alcanzan la mayor concentración durante la época defloración. Se ha visto que el aceite esencial extraído del tomillo en florllena, presenta un mayor poder bactericida.
  • Usos y propiedadesActividad espasmolítico y antitusiva: Es atribuido a los constituyentesfenólicos timol y carvacrol, las cuales constituyen un gran porcentaje deel aceite volátil, también se debe por otra parte a las flavonasmetoxiladas. Estas últimas serían las responsables de la actividad de losextractos fluidos de tomillo, cuyo contenido en timol y carvacrol suele sermuy bajo. Por otro lado, se ha comprobado que la acción de losflavonoides derivados del luteolol potencia la acción espasmolítico de losfenoles, actuando sobre todo en la tráquea, gracias a una inhibición de lafosfodiesterasa, seguida de un incremento del nivel intracelular delAMPc.Actividad expectorante y secretomotora: Evidencias experimentalessugieren que esta actividad ha sido asociado con una saponina extraídade T. vulgaris. Se ha observado además un incremento en la secreciónmucosa de los bronquios, después del tratamiento con aceite esencialde “tomillo”. El aceite esencial de tomillo provoca una fluidificación de lassecreciones bronquiales y favorece a su eliminación, ejerce un efectorelajante del músculo liso bronquial que justifica su uso como antitusivo.
  • Actividad antifungal y antibacteriana: El aceite esencial de tomillo debido asus componentes fenólicos, timol y carvacrol, tiene actividad antibacterianafrente a bacterias Gram negativas y Gram positivas. Este efecto es debido a suacción sobre la membrana. Estudios in vitro han demostrado que el aceiteesencial de Thymus vulgaris y el timol tienen actividad antifúngica frente a unnúmero de hongos incluyendo Cryptococcus neoformans, Aspergillus,Saprolegnia, y especies de Zygorhynchus. Ambos, el aceite esencial y el timoltienen actividad antibacterial frente a Salmonella typhimurium,4 Staphylococcusaureus, Escherichia coli, especies de Candida y un número de otras especies debacterias.Por otra parte el extracto acuoso de tomillo inhibe de forma significativa, in Vitro,el crecimiento de Helicobacter pylori y su potente actividad ureasa.Otras acciones:Actividad antioxidante, en la que se encuentran implicados el timol y el carvacrolde la esencia, así como los flavonoides y otros polifenoles.Produce una considerable estimulación de la leucopoyesis y una elevación delos niveles de trombocitos en sangre, por ello se considera que puede serinteresante su uso como potenciador de la acción de otros inmunoestimulantes.Regulador hormonal: es débilmente estrogénico, compitiendo con el estradiol anivel del los receptores intracelulares. Por esta acción es posible la prevenciónde enfermedades producidas por un exceso de xenoestrógenos, como es elcaso del cáncer de mama.
  • Modo de usoLa hierba desecada se utiliza para infusión, aceite esencial y tintura.Vía oral:Infusión al 5%:Fármaco pulverizado encapsulado: 400 mg del polvo del Tomillo.Extracto fluido, 1:1 (g/ml).Extracto seco (5:1)Aceite esencial: el aceite esencial se puede administrar por vía oral (1-5gotas por dosis, sobre un terrón de azúcar o en solución acuosa), enforma de inhalaciones secas, inhalaciones húmedas o vahos, cápsulasentéricas (25-50 mg por cápsula), entre otras.Vía tópica:Decocción al 5%Gel antiséptico al aceite esencial de tomillo: 5% de extracto glucólico.Alcohol de tomillo (antiséptico).Aceite al tomillo (antiséptico).Extracto fluido (1:1): puro o diluido al 50% (colutorios o gargarismos).
  • ACEITES ESENCIALESSon mezclas complejas de diferentes sustancias químicas, (generalmente ennúmero mayor de un millar); sin embargo, sus componentes principalespueden ser menores, la proporción de estas sustancias varía de un aceiteesencial a otro, e incluso dentro de una misma especie, dándoles unaspropiedades medicinales y una toxicidad característica para cadaplanta, estas proporciones varían en función del momento de recolección dela planta.Son líquidos (en algunas casos semisólidos y muy raras veces sólidos) pocosolubles en agua pero si volatilizables con vapor, se evaporan a diferentesvelocidades bajo presión atmosférica.Los aceites esenciales son variables en sus constituyentes, observándosedos series, caracterizadas por orígenes biosintéticos distintos, la serieterpénica y la serie aromática; los compuestos arénicos son derivados delfenilpropano y existen en diversas partes de las plantas. Los terpenos sonlos constituyentes de los aceites esenciales con mayor predominanciasiendo principalmente cadenas de hidrocarbonos, monoterpénicos ysesquiterpeno con la formula general (C5H8)n que derivan de componentesoxigenados de estos hidrocarbonos donde están losalcoholes, aldehídos, esteres, éteres, cetonas, fenoles y óxidos
  • Composición de los aceites esencialesLos aceites esenciales generalmente son mezclas complejas de hasta másde 100 componentes que pueden tener la siguiente naturaleza química:Serie terpénica. Monoterpenos; Están constituidos principalmente por hidrocarburos acíclicos, monocíclicos, bicíclicos policíclicos, los que van acompañados de sus alcoholes, aldehídos, cetonas, esteres, éteres. Aunque están formados por dos isoprenos curiosamente son llamados monoterpenos. Sesquiterpenos.- La cadena al aumentar el número de ciclaciones y de modificaciones posteriores posibles crece de manera espectacular.Serie aromática.Los compuestos de esta serie son mucho menos frecuentes que los monos ysesquiterpenos, derivando en su mayoría del fenilpropano, que son productodel metabolismo del ácido shikimico.Algunos aceites esenciales contienen pequeñas cantidades de compuestosacíclicos no terpénicos como alcoholes, aldehídos, cetonas de pesomolecular bajo.
  • Tipos deExtracción delos AceitesEsenciales
  • ARTEMIA Sp.Descripción Reino: Animalia Filo: Arthropoda Subfilo: Crustacea Clase: Branchiopoda Orden: Anostraca Familia: Artemiidae Género: Artemia Especie: Artemia sp.Del griego artemía que significa óptima conservación. Género decrustáceos branquiopodos del orden anostráceos, de pequeño tamañollegando a alcanzar 10-15 mm en etapa adulta, y desprovistos decaparazón. Viven en las aguas salobres del litoral o del interior.Presentan razas anfigónicas y partenogenéticas, adaptadas a cadamedio en particular. En las razas partenogenéticas son frecuentes lasformas polipoides. La Artemia es un filtrador no selectivo y se alimentatanto de materia orgánica particulada.
  • Ciclo de Vida y DesarrolloEl camarón de salmuera posee la propiedad de reproducirse de dosmaneras diferentes.Dependiendo de las condiciones ambientales ya sea larvas de librenatación (ovoviviparidad) o quistes o huevos latentes (oviparidad) sonliberados. La reproducción ovovivípara (nauplios como descendencia)ocurre mayormente en niveles de baja salinidad, considerando que losquistes (reproducción ovípara) son producidos en salinidades más alláde 150 ppt.
  • Cultivo de Artemias SalinasParámetros Ambientales Temperatura: Deberá mantenerse en el intervalo de 25–30°C. A temperatura por debajo de 25°C la eclosión es más lente y por encima de 30°C el metabolismo de los quistes se detiene irreversiblemente. Salinidad y pH: La composición química del medio debe de tener iones de Na, K, Mg en proporciones adecuadas. La relación Na:P es muy importante. Cabe mencionar que se han transferido especies de medios con sales de Carbonatos a medios con sales de Sulfatos, y se ha reportado que pueden adaptarse a ellos, observándose cambios de interés en la cepa adaptada diferente a la cepa original. pH: En relación al pH, se considera adecuado el rango de 8.0 a 10.0. Oxígeno: El rango de O2 es amplio desde 1.0 mg/l hasta saturación de O2 .AlimentaciónSe han encontrado en análisis del contenido del tubo digestivo desde algasy detritus hasta granos de arena, lo que demuestra que es un organismofiltrador no selectivo, por lo que puede ingerir materiales contaminados.Ingiere partículas de 1.2 a 50 μ. Sólo se alimenta de partículas, no dealimentos solubles. La Artemia no regula su nutrición (se alimenta las 24 h).
  • Proceso de EclosiónEs un fenómeno químico puro (intercambio iónico), relacionado con laconcentración de glicerol que posee el embrión, a mayor producción deglicerol hay mayor absorción de agua; en etapas críticas de presión osmóticala membrana se rompe, y después la concentración de glicerol súbitamentebaja a cero, el glicerol es liberado. Si bien se ha observado que en altasdensidades de quistes la presencia de glicerol es importante, pues intervieneen la sincronía de la eclosión (ya que no actúa tóxicamente sobre las larvas).Bioensayo con Artemia spLos bioensayos permiten evaluar la bioactividad presentada por algunosmetabolitos secundarios y las respuestas que generan al establecerse lainteracción del producto natural con los organismos.Actualmente, la Artemia se utiliza como especie de bioensayo para unavariedad de objetivos tales como:Investigación de la fuente de toxicidad en mezclas de sustancias químicas ymuestras ambientales, tamizaje de toxicidad aguda de sustancias químicas,extractos vegetales, detección de toxinas naturales en comestibles yfarmacéuticos, estudios de modelos de acción toxica de sustancias, yestudios de la transferencia trófica de contaminantes.
  • EVALUACION DE LA ACTIVIDAD TOXICOLÓGICAUno de los aspectos importantes para la evaluación de la actividadtoxicológica es la relación entre la concentración de un compuestoquímico a la cual se expone un organismo y el consecuente efectonocivo que le produce. Esta relación, conocida como relación dosis-respuesta.Dosis Letal DL50La dosis letal 50 % (DL50) es un término muy utilizado para expresar lamagnitud de la virulencia de microorganismos (virus, bacterias) y latoxicidad de sustancias sintetizadas por éstos.Análisis ProbitEl análisis estadístico Probit es un tipo de regresión utilizado paraanalizar las variables de respuesta binomial. La cual transforma larespuesta de la curva de dosis-respuesta de forma sigmoide en unalínea recta que luego pueden ser analizados por la regresión o bien através de los mínimos cuadrados o máxima verosimilitud.
  • RELACION DOSIS - RESPUESTA
  • INTRODUCCIÓN AL SISTEMA INMUNITARIOLas células fagocíticas son muy importantes en la defensa de los seresvivos frente a lo que les es extraño. Esta acción protectora se vereforzada por el resto de los sistemas de defensa que junto a lasprimeras, constituyen el sistema inmunológico:a) La inmunidad inespecífica o innata, se compone de las barreras naturales, los factores celulares y los humorales.b) La inmunidad específica o adaptativa, surge tras la interacción entre el agente reconocido como extraño y el sistema inmune. Existen dos tipos de inmunidad específica.
  • LEUCOCITOSHace aproximadamente un siglo, Paul Ehrlich sentó las bases de lainmunidad inespecífica al describir la existencia de tres tipos de célulasfagocíticas en la sangre: los neutrófilos, los eosinófilos y losmonocitos, pero fue Elie Metchnikoff quien delimitó poco más tardesus funciones al observar que durante la respuesta inflamatoria losleucocitos ingerían microorganismos mediante el proceso quedenominó fagocitosis. Existen dos tipos de fagocitos: los leucocitospolimorfonucleares (PMN), que son células circulantes que emigran alos sitios de inflamación y los fagocitos mononucleares, que circulanpor la sangre o bien se encuentran fijos en los tejidos y que también seacumulan en los lugares de inflamación.En la sangre se encuentras seis tipos de glóbulos blancos:polimorfonucleares neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos,linfocitos, y células plasmáticas. Además hay un gran número deplaquetas.
  • POLIMORFONUCLEARES NEUTRÓFILOS (PMN)Se llaman polimorfonucleares por su núcleo multilobulado, neutrófilos porcarecer de coloración citoplasmática específica. Son los leucocitos másnumerosos en la circulación. Los PMN neutrófilos son células sanguíneasde vida efímera y sumamente móviles que penetran rápidamente en laszonas de infección para ingerir y destruir a los microorganismos.ProducciónLa médula ósea es el sitio de producción de los polimorfos y su desarrollose puede dividir en dos etapas una primera fase proliferativa o mitóticaseguida de una segunda fase de maduración.FunciónLa función de la célula fagocítica en la defensa del hospedador contra losmicrobios depende de los siguientes pasos 58: migración de los fagocitossanguíneos al interior de los tejidos y establecimiento de contacto con losmicrobios invasores, fagocitosis, y acontecimientos post fagocíticas queconducen a la muerte intracelular y digestión de los microbios.
  • Migración de los neutrófilos al interior de los tejidos.La secuencia de sucesos en la migración de los neutrófilos comienzacon la adherencia de la célula al endotelio vascular, especialmente a lasvénulas postcapilares.El receptor MAC-1, también llamado MO-1 y OKM-1, se encuentra enPMN y también en monocitos, células NK y en algunos linfocitos; estamolécula funciona como el receptor de C3b~ (CR3).Quimiotaxis.Los leucocitos son capaces de responder frente a determinadassustancias con un movimiento dirigido, desde una concentración menora una mayor. Este es el fenómeno de la quimiotaxis y depende delcomplemento e indirectamente de las inmunoglobulinas lgM e lgG que alunirse a los anticuerpos superficiales del organismo activansecuencialmente los componentes del complemento.
  • Funciones de los PMN
  • Fagocitosis.Es el proceso por el cual las células ingieren sustancias particuladas. Enella hay un reconocimiento previo a la ingestión. Para que una partículasea ingerida es necesario que se una a determinadas áreas de la célulafagocítica. Los microorganismos encapsulados evitan esa unión y por lotanto resisten la ingestión, contribuyendo este hecho a su patogenicidad.Esta propiedad antifagocitaria puede quedar limitada por el proceso deopsonización.Acontecimientos postfagocíticos.a) Desgranulación. Es el proceso por el cual gránulos citoplásmicos sefusionan con la membrana del fagosoma y vierten su contenidoenzimático al interior de aquél. Este fenómeno se ve acompañado de unacaída del pH en el interior del fagosoma hasta valores de 3,5 o 4, acideznecesaria para activar las hidrolasas ácidas vertidas por los gránulos.b) Estimulación del metabolismo celular oxidativo. También llamadoestallido respiratorio; implica un marcado aumento en el consumo deoxígeno y a un sistema enzimático, NADPH oxidasa, que cataliza latransferencia de un electrón del NADPH al oxigeno molecular. El productode esta reacción es el anión superóxido (O;) con la consiguienteformación de agua oxigenada gracias al pH ácido del fagosoma.
  • CANDIDA ALBICANSEs un levadura polimórfica asociada obligatoriamente a animales desangre caliente. Normalmente está presente en el hombre comocomensal, pero puede presentarse como patógeno produciendoinfecciones. Este Hongo dimorfo que forma largas seudohifas, hifas yblastoconidios (células gemantes subesféricas de 3-8 x 2-7 μm).Asimilan y fermentan azúcares. Numerosas clamidosporas unicelulares,redondas u ovaladas, con gruesa pared refringente (8-16 μm dediámetro), situadas al final de las hifas, seudohifas o laterales sobreblastoconidios ovalados. Se caracteriza de la siguiente forma: Reino: Fungi Phylum: Ascomycota Orden: Sacharomycetales Familia: Sacharomicetaceae Género: Candida Especie: C. albicans
  • Interacciones entre Quimioterápicos, Microorganismos y CélulasFagocíticas:La evolución favorable de las enfermedades infecciosas dependeesencialmente de la eficacia de las células fagocíticas para destruirmicroorganismos y de una quimioterapia adecuada. Esto hace que seanecesario conocer las interacciones que se establezcan entremicroorganismos, células fagocíticas y quimioterápicos. Interacción de Quimioterápicos con Agente Patógeno y Hospedador (Triángulo de Davis)
  • Interacción de los Quimioterápicos con la Actividad Funcional delas Células Fagocíticas:Los quimioterápicos pueden actuar directamente sobre las célulasfagocíticas modificando su capacidad funcional. Las funciones quepueden quedar alteradas son la quimiotaxís, la fagocitosis y la capacidadmicrobicida.Efecto de los quimioterápicos en las interacciones leucocito-microbio: efectos PAE, PAFE Y PALE. (efecto post antibiótico, postantifúngico y efecto post antibiótico leucocitario):Los efectos de los quimioterápicos sobre las células fagocíticas descritosanteriormente se pueden suplementar con los efectos independientes delos quimioterápicos sobre los propios agentes patógenos.
  • INTERACCIONES PMN-QUIMIOTERAPICO
  • Métodos para medir la fagocitosis:Se puede medir desde la incubación con partículas inertes con bacterias.Microscopía: Consiste en contar el número de partículas ingeridas enfunción del tiempo, su ventaja es que provee una vía visual directa ycomo tal es de gran valor para validar los resultados obtenidos con otrosmétodos o para contar el número de partículas ingeridas por undeterminado número de fagocitos.Algunos autores utilizan antibióticos para combatir bacteriasextracelulares, pero puede producirse interacciones no deseables.Durante el ensayo se puede contabilizar la ingesta de partículasintracelulares o bien se puede contabilizar las partículas ingeridasrestando del total adicionado las que se observan en el sobrenadantedespués de un pase de centrifugación. Con éste método se intentadistinguir entre la ingesta completa de la partícula y los elementosadheridos a la célula.
  • METODOLOGIA Determinación de la toxicidad aguda (DL50) del aceite esencial de“tomillo” (Thymus vulgaris L.) en Artemia sp. y Efecto sobre PMNs
  • Obtención del aceite esencial de Thymus vulgaris L.Se adquirió material vegetal seco consistente en hojas y flores deThymus vulgaris (tomillo) .El método que se empleó para la obtención de aceite esencial, fue elmétodo de destilación por arrastre con vapor de agua, siendo este elmétodo más usado actualmente, porque permite aislar el aceite esencialcon buen rendimiento y tratar una cantidad grande de material. Entoncesse colocó aproximadamente 1Kg de material seco dentro de unalambique de acero inoxidable, el material se encontraba separadomediante una plataforma perforada del agua en ebullición, de tal maneraque no hacía contacto directo con el agua, pero si tenia un contactodirecto con el vapor de agua, este vapor mas el aceite esencial pasa através de un condensador de serpentín, que desemboca en una probetagraduada, donde el aceite se separa del agua y se ubica en la parteexterior, el aceite fue separado del agua poco a poco haciendo uso deuna jeringa. Se extrajo 12ml de aceite esencial, que fue conservado enun frasco de vidrio ámbar, en un lugar fresco y protegido de la luz, hastasu posterior utilización.
  • Procedimiento para el Bioensayo en Artemia sp. Huevos de Artemia sp Aceite esencial de Thymus Desactivación de la vulgaris diapausa Eclosión de huevos y Preparación de diluciones separación de nauplios de con DMSO Artemia sp Bioensayo Experimental 5 tubos x Blanco x 5 tubo (10 Control x 5 tubos cada dilucion (10 indiv. indiv. x tubo) (10 indiv. x tubo) x tubo) Incubación con Incubación con dilución de aceite Incubación con solución salina y solución salina esencial+DMSO en DMSO solución salina 24 horas de incubación Conteo de individuos muertos Determinación de la DL50 mediante el método de Finney
  • Evaluación del efecto tóxico en Polimorfonucleares - PMNs
  • Obtención de PMNs:Se tomaron muestras de sangre venosa periférica de un donante sano. Secolocaron dos gotas separadas de sangre en una lámina portaobjetoslimpia, se prepararon cinco láminas para control, y cinco láminas para lamuestra experimental, todas las láminas fueron llevadas a incubar encámara húmeda a una temperatura de 37ºC durante 30 minutos.Transcurrido este tiempo, se extrajo de la estufa, la cámara húmeda y seprocedió a cubrir las gotas de sangre con PBS (solución buffer fosfatosalino), para luego comenzar a despegar cuidadosamente los bordes delos coágulos con una aguja desechable, seguidamente se procedió con laremoción del coágulo y lavado de la lámina mediante un chorro continuode PBS con la ayuda de una pipeta Pasteur, concluido este proceso seobtuvieron dos áreas de PMNs adheridos en cada lámina portaobjetos.Prueba de viabilidadEl punto de partida de los tratamientos será la Dosis letal media (DL50hallada en el bioensayo con Artemia sp.), para comprobar el efecto sobrela viabilidad de los PMNs. La solución de aceite esencial fue preparadacon PBS y utilizando DMSO como diluyente.
  • Se dispusieron 5 láminas para ser expuestas a la acción del aceiteesencial y 5 láminas para servir en calidad de control.Se cubrió las áreas de PMNs adheridos, con las soluciones quecorrespondían, según se trataba de controles o de muestrasexperimentales, se llevaron las láminas a incubar a 37ºC durante 30 ó 60minutos, según era el caso. Al cabo de este tiempo se procedió a lavar lasláminas con PBS, luego se cubrió el área de PMNs con una gota de Azulde Tripán al 0.4% (peso/volumen en solución isotónica salina), se colocóun cubreobjetos a fin de eliminar el exceso de colorante. Luego seprocedió al conteo de PMNs en un microscopio óptico a 40X,diferenciando las células vivas (refringentes) de las muertas (azules).Con los datos se obtuvo los porcentajes de viabilidad de las muestras yde los controles, valores con los cuales se halló el índice de viabilidad,haciendo uso de las siguientes fórmulas:
  • Se consideró una concentración como tóxica cuando su índice deviabilidad fue menor a 90%. Así mismo las láminas control quepresentaron una viabilidad menor del 95% fueron descartadas.Prueba de funcionalidad de polimorfosLa cepa de Candida albicans fue obtenida del laboratorio UPSIPROBI eidentificada por el método del tallo germinativo, una vez identificada la cepase procedió a su siembra en agar Saboraud y a su posterior incubación a 37ºC por 24 horas. Concluido este tiempo se extrajo la placa de la estufa y semantuvo en refrigeración hasta su posterior utilización, se realizó larenovación del cultivo cada cuatro días.Para la preparación de la suspensión se tomó una muestra de las coloniasde Candida albicans formadas en la placa con un asa de siembra, se disolvióen 5ml de PBS (buffer fosfato salino, pH 7.4). Seguidamente se colocó sobreuna lámina portaobjetos, una gota de la suspensión preparada, se vertió unagota de azul de Tripán y se procedió a leer la viabilidad de la C. albicans enun microscopio óptico a 40x, se descartaron las muestras que presentaronuna viabilidad menor a 95%.Luego se realizó el conteo de levaduras de la suspensión en una cámara deNewbauer, luego se ajustó la suspensión a 2x106 C. albicans/ml en unasolución de PBS con 20% de suero autólogo para la opsonización de laslevaduras.
  • Prueba de funcionalidadPara esta prueba se utilizó la Dosis letal media hallada en el bioensayocon Artemia sp.Los PMNs aislados fueron expuestos durante 30 y 60 minutos a la accióndel aceite esencial de T. vulgaris, luego de transcurrido el tiempo, se lavólas láminas con PBS y se cubrió los PMNs con aproximadamente 0.5mlde la suspensión de C. albicans preparada previamente, la cual contenía2x106 candidas/ml y 20% de suero antólogo.Se incubaron las láminas en cámara húmeda a 37ºC por 30 minutos,luego del cual se lavaron las láminas con PBS. Seguidamente se fijaroncon metanol absoluto durante 30 a 60 segundos, se enjuagaron con aguay se procedió a teñir con Giemsa .3%, cubriendo el área con el colorantey dejándolo actuar durante 7 a 10 minutos, a continuación se lavó lasláminas y se las dejó escurriendo hasta el momento de su lectura enmicroscopio óptico a 100X.Se contabilizó el número de PMNs que lograron fagocitar y la cantidad departículas ingeridas por cada PMN, se contarán un total de 100 PMNs encada área de las láminas expuesta al aceite esencial, es decir 200 PMNspor lámina portaobjetos.
  • Luego se obtuvieron los índices fagocíticos de las muestras y de loscontroles, índices que fueron relacionados en una fórmula, para obtenerde este modo las eficiencias fagocíticas para cada muestra.Se consideró una concentración como tóxica siempre y cuando en lasláminas expuestas a esta concentración presentaron una eficienciafagocítica menor al 95%.Metodología estadísticaPara analizar los experimentos se compararon los 4 grupos (DL50 a los30min, DL50 a los 60min y sus respectivos controles) por medio de unanálisis de varianza, con un nivel de significancia de p< 0.05.Adicionalmente se comparó a través de una prueba de T de student paradatos emparejados (resultados de los tratamientos con sus respectivoscontroles), con un nivel de significancia de p< 0.05.
  • RESULTADOS Y DISCUSIÓNRendimiento y densidad del aceite esencial de ThymusvulgarisLuego de la extracción del aceite de Tomillo se logro determinar unrendimiento de 1.5%, lo cual significa que para obtener un litro de aceiteesencial de tomillo se requieren aprox. 67 kilos de tomillo desecado.En otro estudio se encontró un rendimiento de 2.05% utilizando lamisma metodología empleada en esta investigación, es tambiénimportante mencionar que el rendimiento de los aceites depende defactores climáticos y calidad de los suelos.La densidad del aceite esencial de tomillo obtenido fue de 0.969g/ml,este valor no difiere mucho del encontrado en otro estudio (0.939g/ml).Esto es muy relativo ya que como puede variar el rendimiento y lacomposición por diversos factores, también otros parámetros físicoscomo la densidad también puede variar debido a la variación dequimiotipos, etapa del ciclo de vida de la planta, diferentes partes de laplanta, factores ambientales y estacionales, condiciones estacionales decultivo.
  • RESULTADOS DEL BIOENSAYO EN Artemia sp. Dosis Porcentaje de Log (Dosis) Probit (ppm) Mortalidad (%) 3.03 0.48 6.7 3.50 6.06 0.78 35.5 4.63 12.11 1.08 91.7 6.39 24.23 1.38 100.00 8.72 48.45 1.69 100.00 - 96.9 1.99 100.00 -El grado de mortalidad parece guardar una correlación con la dosisempleada, ya que a dosis mayores se puede apreciar una porcentaje demortalidad mayor, así se puede apreciar que el menor porcentaje demortalidad se encuentra a la dosis de 3.03ppm y el mayor porcentaje demortalidad a las dosis de 24.23ppm, también se puede notar que la DL50podría hallarse entre la concentraciones de 6.06ppm a 12.11ppm.
  • PROBIT VS LOGARITMO DE DOSISPara fines de lograr una regresión lineal se han transformado losporcentajes de mortalidad a Probits (Tabla de Finney) y la concentraciónen logaritmo de dosis, según la gráfica, el coeficiente de correlación (R2)tiene un valor de 0.976, por lo tanto si conocemos el valor del Probitpodremos predecir con un 97.6% de confiabilidad el valor del Log de ladosis y un valor preliminar de 6.18ppm para la DL50 del aceite de tomillo.
  • Resultados del Segundo Bioensayo en Artemia sp. Dosis Porcentaje de Log (Dosis) Probit (ppm) Mortalidad (%) 1.6 0,2 1,5 2.83 3.2 0,5 7,8 3.58 6.4 0,8 44,9 4.87 12.8 1,10 85,5 6.06 25.6 1,40 98,3 7.12En el segundo bioensayo se han utilizado dosis intermedias a lasempleadas en el primer bioensayo para hallar un valor de DL50 másexacto.En los resultados obtenidos se puede apreciar que la DL50 se encuentramás cercana a la dosis de 6.4ppm.
  • PROBIT VS LOGARITMO DE DOSISLa gráfica corresponde a la regresión lineal obtenida entre los Probits y elLogaritmo de las dosis utilizadas, el coeficiente de correlación (R2) en estebioensayo, es de 0.9943, lo cual indica que existe una mejor correlaciónque en la regresión del primer bioensayo, por lo tanto en éste segundobioensayo luego de aplicar el método de Finney y de realizar los cálculosrespectivos se ha determinado el valor de 6.75ppm para la DL50 del aceitede tomillo siendo este valor más exacto.
  • La toxicidad hallada en este experimento es más elevada a la que seencontró en larvas del insecto Spodoptera frugiperda (0.277g/ml lo queequivale a 277000ppm), lo cual es lógico debido a que estas larvaspresentan una estructura más compleja que las larvas de Artemia sp.La toxicidad observada es un indicativo de la presencia de potentescomponentes citotóxicos, de hecho, se ha comprobado en numerososcasos la actividad biológica del aceite esencial de tomillo, así, numerososestudios consideran que el aceite esencial de tomillo está entre los máspotentes aceites esenciales con respecto a las propiedadesantimicrobianas, sumado a esto, de manera aislada los componentesmayoritarios del aceite esencial de tomillo (timol y carvacrol) tienencomprobada actividad citotóxica, así es que están considerados entre losmás activos compuestos agonistas de múltiples patógenos transmitidospor alimentos, el timol, compuesto fenólico monocíclico con actividadbactericida, también se le ha encontrado propiedades moluscicidas einsecticidas.Es conocido que la Na-K-ATPasa es una enzima fundamental paramantener el equilibrio iónico dentro del fluido corporal interno de laArtemia, en este contexto algún factor externo que perturbe el adecuadofuncionamiento de esta enzima denotaría graves alteraciones fisiológicas,que podrían concluir con la muerte del organismo.
  • Resultados de la Prueba de Viabilidad de PMNs Fuente de GL SC MS Fc variación Tratamiento 3 348.9 116.3 9.9487 Error 36 421 11.69 Total 39 769.9 Fc > Ft; p<0.05Luego de aplicar la prueba de Análisis de Varianza con un 99.5% deconfianza se ha determinado que existe diferencia significativa entre losgrupos de investigación evaluados .
  • T de Student para la Prueba de Viabilidad de PMNs Dosis Tiempo x ds t p 7ppm 93.4 ± 5.19 30min 3.683 <0.05 control 99.5 ± 0.71 7ppm 93.8 ± 4.26 60min 4.169 <0.05 control 99.5 ± 0.71 7ppm 30min 93.4 ± 5.19 0.188 >0.05 7ppm 60min 93.8 ± 4.26 12ppm 75.3 ± 4.97 30min 15.248 <0.05 control 99.5 ± 0.71El T de Student con un 99.5% de confianza ha demostrando que existe unefecto del aceite esencial sobre los PMNs, no obstante como se puedeobservar, los valores promedio de viabilidad en los tratamientos no sonmenores a 90% en ninguno de los casos, siendo este el valor que se tomacomo parámetro de normalidad. Dado que la viabilidad es normal, no seconsidera que exista un efecto tóxico del aceite esencial sobre PMNs a laconcentración empleada. Sin embargo cuando la concentración del aceiteesencial es de 12ppm, el porcentaje de viabilidad se reduce a 75.3% locual indica la existencia de un efecto tóxico al compararlo con losparámetros normales de referencia, además, la diferencia estadística conel control es mayor que en los casos anteriores.
  • Resultados de prueba de funcionalidad en PMNs Fuente de GL SC MS Fc variación Tratamiento 3 81.23 27.08 1.025 Error 20 528.17 26.41 Total 23 609.40 Fc < Ft; p>0.05Luego de la prueba estadística aplicada se ha determinado con un 99.5%de grado de confianza que no existe diferencia significativa entre losgrupos evaluados.
  • T de Student para el porcentaje de fagocitosis Dosis Tiempo x ds t p 7ppm 83.0 ± 7.68 30min 1.604 >0.05 control 88.5 ± 3.39 7ppm 60min 80.83 ± 4.75 0.827 >0.05 control 82.83 ± 3.54Aplicando la prueba T de Student, con un 99.5% de confianza se hadeterminado que no existe diferencia significativa entre los tratamientosy los respectivos controles. Debido a estos resultados se puede inferirque no existe efecto tóxico del aceite esencial a la concentraciónprobada.
  • Eficiencia fagocítica de PMNs sometidos al aceite esencial Tiempo de Eficiencia Dosis exposición Fagocítica (%) 30 min 94.88 7ppm 60 min 90.48 Los resultados de la tabla indican los porcentajes de eficiencia fagocítica de los PMNs luego de ser sometidos a dos tiempos de exposición. Los porcentajes se encuentran dentro de los parámetros normales que se ha tomado como referencia en el presente estudio (mínimo 85%), lo cual indica que no ha existido efecto tóxico del aceite esencial sobre la funcionalidad de los PMNs, a la dosis evaluada.
  • Análisis del promedio de levaduras fagocitadas porPMNsFuente de Dosis Tiempo x ds t p GL SC MS Fc variación 7ppm 30min 2.41 ± 0.3 0.610 >0.05 control 2.54 ± 0.42Tratamiento 3 1.98 0.66 7ppm 3.725 60min 2.85 ± 0.31 1.515 >0.05 controlError 20 3.53 0.1767 3.15 ± 0.38 7ppm 30minTotal 23 5.51 2.41 ± 0.3 2.5 <0.05 7ppm 60minFc > Ft; p<0.05 2.85 ± 0.31Se ha determinado con un 99.5% de confianza que existe diferenciasignificativa entre los grupos evaluados y al aplicar la prueba de T deStudent con un 99.5% de confianza se ha determinado que no existediferencia significativa entre los tratamientos con aceite esencial y losrespectivos controles.Sin embargo se ha encontrado una diferencia significativa entre los tiemposde tratamiento, lo cual demuestra que el tiempo ha influenciado en elnúmero de levaduras fagocitadas por PMNs. Siendo mayor el promedio alos 60min.Por lo tanto al incrementar el tiempo de exposición con la suspensión deCandida albicans, los PMNs han logrado fagocitar un mayor número de
  • CONCLUSIONES Se extrajo el aceite esencial de Thymus vulgaris L. “tomillo”, obteniéndose con un rendimiento de extracción de 1.5% y una densidad de 0.969g/ml. Mediante la DL50 se determino el grado de toxicidad del aceite esencial Thymus vulgaris L. “tomillo” mediante el bioensayo con Artemia sp obteniéndose un grado de toxicidad a 6.75ppm. Se ha determinado que no existe efecto tóxico del aceite esencial de Thymus vulgaris L. “tomillo” sobre la viabilidad de polimorfonucleares al emplearse la dosis hallada por la DL50 obtenida en el bioensayo. Sin embargo el efecto tóxico se manifiesta a la dosis de 12ppm. Se ha determinado que no existe efecto tóxico del aceite esencial de Thymus vulgaris L. “tomillo” sobre la funcionalidad de polimorfonucleares con la dosis de la DL50 obtenida en el bioensayo.
  • REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Cosentino S, Tuberoso CIG, Pisano B, Satta M, Arzedi E, Plamas F: In vitro antimicrobial activity and chemical composition of Sardinians Thymus essential oils. Lett Appl Microbiol 1999; 29:130-135. Crespo ME, Jimenez J, Gomis E, Navarro C: Antibacterial activities of the essential oil of Thymus serpylloides subspecies gadorensis. Microbios 1990; 61:181-184. Culici M, Capretti V, Dal Sasso M, Guffanti EE, Mucci M, Braga PC: Evaluation of thymol inhibition of Candida albicans adhesiveness to human vaginal cells. GIMMOC (submitted), 2005. Dal Sasso M, Culici M, Guffanti EE, Mucci M, Braga PC: Thymol inhibitory activity on Escherichia coli and Staphylococcus aureus adhesion to human vaginal cells. J Essent Oil Res (submitted), 2005. Dorman HJ, Deans SG: Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. J Appl Microbiol 2000; 88:308-316. Vardar-Ünlü G, Candan F, Sökmen A, Daferera D, Polissiou M, Sökmen M, Dönmez E, Tepe B: Antimcirobial and antioxidant activity of the essential oil and methanol extracts of Thymus pectinatus Fisch, et Mey. Var. pectinaus (Lamiaceae). J Agric Food Chem 2003; 51:63-67.
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