Renée Condori apaza. Actividad toxicologica de la Fracción Alcaloidea de los Tallos de la Jatropha macrantha M. Arg. (Huanarpo macho) en Artemia Salina (Brine Shrimps).
La actividad toxicológica es la relación entre la concentración de un compuesto químico a la cual se expone un organismo y el consecuente efecto nocivo que le produce. Esta relación, conocida como relación dosis-respuesta, constituye entonces la base para la evaluación del peligro y el riesgo generado por las sustancias químicas en el medio donde se encuentren las muestras biológicas.
casos clínicos hidrocefalia que es tratamiento sintomas
Renée Condori apaza. Actividad toxicologica de la Fracción Alcaloidea de los Tallos de la Jatropha macrantha M. Arg. (Huanarpo macho) en Artemia Salina (Brine Shrimps).
1. Universidad Nacional San Agustín de Arequipa
ACTIVIDAD TOXICOLOGICA DE LA FRACCION ALCALOIDEA
DE LOS TALLOS DE LA Jatropha macrantha M. Arg.
(Huanarpo macho) EN ARTEMIA SALINA (Brine Shrimps).
RENEE M. CONDORI APAZA
EVELYN K. PAREDES PAREDES
2. ANTECEDENTES GENERALES
JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
La Jatropha macrantha M.Arg. (huanarpo macho) es una planta
silvestre con sustancias químicas de gran utilidad en medicina,
siendo usada por los pobladores de las zonas rurales como
energizante, sin tener conocimiento que probablemente puedan
causar algunos efectos secundarios en su salud; por ello el
estudio científico del vegetal nos sirve para conocer el grado
toxicológico de la fracción alcaloidea de esta planta, por lo que la
evaluación de la actividad toxicológica de la fracción alcaloidea se
hace imprescindible, para poder tener un criterio científico sobre
el uso de esta planta tan difundida entre nuestra población.
3. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Estudiar actividad toxicológica de la fracción alcaloidea de los
tallos de la Jatropha macrantha M. Arg. (Huanarpo macho) en
artemia salina (Brine Shrimps)
OBJETIVOS ESPECIFICOS.
Incubar y obtener la artemia salina (larvas marinas) en el estadio
adecuado para realizar nuestras pruebas de toxicidad.
Evaluar la actividad toxicológica de las fracciones alcaloideas
obtenidas mediante el método del DL5o en Artemia salina.
4. Jatropha macrantha M. Arg.
Huanarpo Macho
Esta especie pertenece a la familia Euphorbiaceae,
comprende alrededor de 290 géneros y más de 750
especies, casi cosmopolitas, particularmente rica en
trópicos, pero extendiéndose a las regiones templadas
de ambos hemisferios. En el Perú comprende 57
géneros, 305 especies de las cuales 88 son endémicas.
Las especies endémicas más comunes son: Jatropha
curcas L. y la Jatropha macrantha M. Arg.
Es un arbusto monoico algo suculento, hojas alternas
partidas palmadas trilobadas, presenta inflorescencia
reunidas en el ápice de las ramas, flores hermafroditas
actinomorfas, cáliz y corola presentes, sépalos
pentámeros con estambres, numerosos filamentos
libres, ovario súpero trilocular, fruto capsular dividido
en tres monocarpos. Arbusto latescente endémico, con
flores rojas.
5. Principios Activos
Son componentes esenciales de las plantas que nos sirven parte
esencial de los fármacos y es por eso que no todos los
componentes químicos elaborados por la planta, poseen igual
interés para la fitoquímica .Los denominados “principios activos”
son frecuentemente alcaloides o heterósidos; ambos merecen,
por ello, especial atención. Otros grupos, como los glúcidos,
grasas y proteínas, tienen importancia dietética y muchos, como
los almidones y las gomas, se emplean en técnica farmacéutica,
aunque carecen de señalada acción farmacológica. Otras
sustancias como el oxalato cálcico, sílice, lignina y materiales
colorantes, pueden ser materias coadyuvantes en la
identificación de drogas y en la detección de adulteraciones.
6. Principales Alcaloides en el Comercio
ALCALOIDES PROCEDENCIA ACCIÓN FISIOLÓGICA SALES OFICIALES
1. Aconitina Aconitum napellus Diurético, sudorífico, antineurálgico, anestésico local.
2. Apomorfina Deshidratación de la morfina Cardiodepresor, emético, expectorante sedativo, hipnótico. Clorhidrato
3. Arecolina Areca catechu Catártico, sialagogo, miótico, antihelmíntico. Bromhidrato
4. Atropina Beleño, belladona, plantas del género Datura y otras Antiespasmódico, estimulante, anhidrótico, antisialagogo, Sulfato
solanáceas. analgésico, midriático.
5. Berberina Agracejo Antiperiódico, estomáquico, tónico.
6. Brucina Nuez vómica Como la estricnina pero más débil. Sulfato
7. Cinconidina Quina Tónico, antiperiódico, como la quinina, pero más débil. Sulfato
8. Cinconina Quina Tónico, antiperiódico, como la quinina, pero más débil. Sulfato
9. Cocaína Hojas de coca y de otras especies del género Erythroxylon Estimulante, anestésico local, sedante, antisialagogo, Clorhidrato
midriático, anodino, anhidrótico, antiprurítico.
10. Codeína Metilación de la morfina. Analgésico, hipnótico, sedante. Fosfato, sulfato.
11. Colquicina Colchicum autumnale Antigotoso, antirreumático, antineurálgico, analgésico.
12. Efedrina Efedra Vasoconstrictor, para el tratamiento de la fiebre del heno, Clorhidrato, sulfato
asma, insuficiencia circulatoria, envenenamiento con
narcóticos.
13. Emetina Ipecacuana Emético, expectorante, antipirético, amebicida (específico en Clorhidrato
la disentería amibiana).
14. Ergonovina Oxitócico, hemostático uterino. Maleato
15. Ergotamina Cornezuelo Oxitócico, hemostático uterino, antineurálgico en la jaqueca. Tartrato
16. Escopolamina Género Datura y otras solanáceas Midriático, hipnótico, sedante. Bromhidrato
17. Esparteína Spartium scoparius, Anagyris foétida Estimulante cardiaco, diurético.
18. Estricnina Nuez vómica Tónico, estimulante, eximotor. Nitrato, fosfato, sulfato
19. Fisostigmina Physostigma venenosum Sedante, antineurálgico, diaforético, depresor purgante, Salicilato
miótico, sialagogo, antitetánico.
20. Hidrastina Hydrastis canadensis Antiséptico, astringente, hemostático, tónico, alterante,
emenagogo, sedante cardiaco.
21. Hiosciamina Beleño, belladona, plantas del género Datura y otras Hipnótico, sedante cerebral, midriático Bromhidrato, sulfato
solanáceas
22. Lobelina Lobelia Expectorante, emético, estimulante respiratorio
23. Morfina Opio ( 15%) Narcótico, sedante, hipnótico, analgésico. Clorhidrato, sulfato
24. Nicotina Tabaco Irritante local, paralizante, parasiticida
25. Pilocarpina Jaborandi Diurético, sialagogo, galactogogo, galactagogo, miótico, Clorhidrato, nitrato
diaforético.
26. Quinidina Quina Inhibidor de la fibrilación auricular, antiperiódico, tónico, Sulfato, gluconato
antiséptico.
27. Quinina Quina Tónico, emenagogo, antiperiódico, antiséptico, antipirético. Sulfato, bisulfato, clorhidrato,
diclorhidrato, fosfato
28. Yohimbina Yohimbe Afrodisiaco, anestésico local, midriático.
7. Fracción Alcaloidea de la Jatropha
macrantha M. Arg. Huanarpo Macho
La fracción alcaloidea es un compuesto orgánico extraido
mediante procesos químicos de una planta de origen natural
(generalmente vegetal), nitrogenado, derivados generalmente de
aminoácidos, mas o menos básicos, de distribución restringida,
con propiedades farmacológicas importantes a dosis bajas y que
responden a reacciones comunes de precipitación.
8. ACTIVIDAD TOXICOLÓGICA
Uno de los aspectos importantes para la evaluación de la actividad toxicológica
es la relación entre la concentración de un compuesto químico a la cual se
expone un organismo y el consecuente efecto nocivo que le produce. Esta
relación, conocida como relación dosis-respuesta, constituye entonces la base
para la evaluación del peligro y el riesgo generado por las sustancias químicas
en el medio donde se encuentren las muestras biológicas.
La actividad biológica es la capacidad que tiene el material de interactuar
químicamente con los tejidos del organismo, es una expresión que describe los
efectos beneficiosos o nocivos de una droga o extracto en organismos vivos.
Tanto las investigaciones biológicas básicas como las investigaciones
aplicadas, han determinado muchos adelantos importantes de la ciencia
médica. Por eso resulta indispensable seguir realizando investigaciones en
ambas clases con el fin de descubrir las causas, mecanismos, prevención y
tratamiento de enfermedades que aun no son bien conocidas por el hombre, así
como para probar la eficacia e inocuidad de muchos de los principios activos
utilizados en medicina humana y veterinaria, y en general para avanzar en el
conocimiento biológico.
9. DOSIS LETAL DL50
La DL50 se utiliza para encontrar umbrales de toxicidad para determinadas
sustancias; en el desarrollo de pesticidas se utiliza para determinar los
límites de resistencia de insectos, por ejemplo, ante ciertos biocidas. En la
investigación fitoquímica valiéndose del principio de la farmacología es
simplemente la toxicología a bajas concentraciones o toxicología es la
farmacología a concentraciones altas, se puede correlacionar la bioactividad
con el valor de la DL50 y al mismo tiempo su grado de toxicidad.
La determinación de la DL50 requiere de la estadística cuantal, para lo cual es
necesario transformar los valores de respuesta obtenidos en unidades Anglit,
Logit o Probit y las dosis suministradas en unidades logarítmicas conocidas
como dosis metamétricas. Existen algunos programas especializados que
realizan este tipo de cálculos automáticamente, pero su confiabilidad
depende de la persona o institución que los haya desarrollado.
El periodo de tiempo durante el cual se expone el estimulo debe ser
especificado, por ejemplo, 24 horas, esto con el fin de comparar y estimar la
potencia relativa del estimulo. Como organismo de prueba se puede utilizar
Artemia salina.
10. Análisis Probit Mediante Tabla Finney
El análisis Probit requiere de la Tabla correspondiente a Finney para
Convertir el % de mortalidad a Probits .
11. ARTEMIA SALINA (Brine Shrimps)
La artemia salina es un pequeñísimo camarón que vive en las aguas salobres
e hipersalinas de todo el mundo. Este pequeño crustáceo pertenece a la
subclase de los anostráceos su nombre científico es Brine Shrimps y
conforma el plancton de las aguas continentales salobres.
Son unos pequeños seres (alrededor de dos centímetros de longitud como
máximo) que no paran quietos en ningún momento, moviendo su cola
frenéticamente, y realizando multitud de tareas mientras los observamos.
En su estado adulto alcanza un tamaño de 8 - 13 mm. de longitud.
12. ARTEMIA SALINA (Brine Shrimps)
CLASIFICACIÓN SISTEMÁTICA
La clasificación sistemática de la artemia hasta el nivel de género es dado por
Flossner (1972):
Clase: Crustacea
Subclase: Branquiopoda
Orden: Anostraca
Familia: Artemiidae
Género: Artemia
MORFOLOGÍA Y CICLO DE VIDA
Los lagos salados y estanques de las salinas con poblaciones de Artemia
se encuentran distribuidos por todo el mundo. En ciertos momentos del
año, grandes cantidades de minúsculas partículas marrones (de 200 a 300
micras de diámetro) aparecen flotando en la superficie del lago y son
arrojadas sobre las orillas por la acción de las olas y el viento. Este polvo
aparentemente inerte está formado por quistes secos inactivos en estado
de criptobiosis (“durmientes”) manteniéndose así tanto tiempo como
permanezcan secos.
13. ARTEMIA SALINA (Brine Shrimps)
Una vez puestos en agua de mar, los quistes bicóncavos se hidratan tomando
forma esférica y el embrión recobra su metabolismo reversible interrumpido.
Tras unas 24 horas la membrana externa de los quistes se rompe (“breaking”)
y aparece el embrión rodeado de la membrana de aclosión. Durante las horas
siguientes, el embrión abandona completamente la cáscara del quiste:
colgando entretanto de la cáscara vacía a la cual permanece todavía unido
(estado de “umbrella”). Dentro de la membrana de eclosión se completa el
desarrollo del nauplio, sus apéndices comienzan a moverse y en un breve
periodo de tiempo la membrana de eclosión se rasga (= “hatching”)
emergiendo el nauplio que nada libremente.
14. ARTEMIA SALINA (Brine Shrimps)
(
El primer estado larvario (también llamado estado I) mide entre 400 y 500
micras de longitud, tiene un color pardo anaranjado (por acumulación de
reservas vitelinas) y posee tres pares de apéndices: el primer par de antenas
(también llamadas anténulas y que tienen una función sensorial) el segundo par
de antenas (con función locomotora y filtradora) y las mandíbulas (con una
función de toma de alimento). Un único ocelo de color rojo también llamado ojo
nauplial se encuentra situado en la cabeza entre el primer par de antenas. La
cara ventral del animal se encuentra cubierta por un amplio labro que interviene
en la toma de alimento (transfiriendo las partículas desde las setas filtradoras
hasta la boca). El estado larvario I no se alimenta ya que su aparato digestivo
no es todavía funcional (permaneciendo aún cerrados la boca y el ano).
Tras aproximadamente 24 horas, el animal muda al segundo estado larvario
(también llamado estado II). Pequeñas partículas alimenticias (tales como
células de microalgas, bacterias, detritus) con un tamaño que varía entre 1 y 40
micras son filtradas por el segundo par de antenas, siendo entonces ingeridas
por un aparato digestivo ya funcional.
15. ARTEMIA SALINA (Brine Shrimps)
La larva continúa su crecimiento apareciendo diferenciaciones a lo largo de las
15 mudas. Así van apareciendo unos apéndices lobulares pares en la región
torácica que se diferenciarán posteriormente en toracópodos, se desarrollan
ojos complejos laterales a ambos lados del ojo nauplial. Desde el estado X en
adelante, se producen importantes cambios tanto morfológicos como
funcionales por ejemplo: las antenas pierden su función locomotriz y se
transforman en elementos de diferenciación sexual. Los futuros machos
desarrollan unos apéndices curvados y prensiles mientras que las antenas de
las hembras degeneran en apéndices sensoriales. Los adultos de Artemia
miden hasta 10 mm de longitud en las poblaciones bisexuales y hasta 20 mm
en las poblaciones partenogeneticas.
16. IMPORTANCIA DE LA ARTEMIA SALINA
EN LAS INVESTIGACIONES
Actualmente, la Artemia salina se utiliza como especie de bioensayo para una variedad de
objetivos tales como:
Investigación de la fuente de toxicidad en mezclas de sustancias químicas y muestras
ambientales, tamizaje de toxicidad aguada de sustancias químicas, detección de
toxinas naturales en comestibles y farmacéuticos, estudios de modelos de acción
toxica de sustancias, y estudios de la transferencia trófica de contaminantes.
El potencial de Artemia para investigación y aplicaciones en toxicología acuática se ha
explorado desde 1975 en el laboratorio de Investigación Biológica en Toxicología
Acuática de la Universidad Estatal de Ghent, Bélgica. En 1981 se desarrollo el primer
ensayo estandarizado de ecotoxicología marina: el ensayo ARC (Agencia de Residuos
de Cataluya), que es un ensayo de 24 horas para determinar la concentración letal
media (CL50 o DL50) en nauplios de instares II y III.
La confiabilidad y precisión de este ensayo fue investigado durante un extenso
ejercicio de calibración involucrando a 80 laboratorios americanos y europeos, dando
resultados muy satisfactorios. La experiencia obtenida desde entonces ha abierto el
camino para mejorar uno de los ensayos de tamizaje más sencillos, más reproducible y
rentable en toxicología acuática
17. DESARROLLO EXPERIMENTAL
Toxicidad frente artemia salina
DESCAPSULAMIENTO DE QUISTES DE ARTEMIA SALINA
Hidratar el huevo de artemia y tenerlo por una hora con aireación.
Lavar los quistes con HCl 1 N (4 – 7 min).
Regresar los huevos al papel filtro y lavarlos con agua de la llave
hasta que pierdan el olor a cloro (unos 5 minutos).
Pasar los huevos a la incubadora con agua de mar y esperar la
eclosión en 24 horas, teniendo en cuenta las siguientes
especificaciones:
T = 26 a 28 ºC.
Salinidad = 32'5 gr/l. o 1.022
Tiempo de 24 a horas.
Oxigenación casi a saturación
18. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES
A EVALUAR
Las fracciones de alcaloides obtenidas denominadas ECl2(Esta
fracción proviene de extracción clorofórmica) y EEAT (Esta fracción
proviene del extracto de acetato de etilo de alcaloides totales) por los
métodos descritos anteriormente libres de los diferentes solventes
que los extrajeron (estado sólido) se disolvieron en dimetilsulfóxido
(DMSO ≤ 0.2 %), para formar una solución patrón de 15000 ppm en el
caso de la fracción ECl2 y una solución patrón de 10000 ppm en el
caso de la fracción EEAT, a partir de las cuales se prepararon las
diluciones para obtener diferentes concentraciones.
19. BIOENSAYO
Luego de incubar los huevos de artemia salina por 24 horas, se
colectaron las artemias con una pipeta Pasteur, a cada tubo de
ensayo se agregó 10 de estos organismos, cada tubo contenía 5 ml
solución salina, las diluciones preparadas y levadura que se uso
como alimento adicional para las artemias. Se incluyeron grupos
control y blanco en cada evaluación (solución salina y solución
salina + DMSO), dichos tubos se incubaron en el equipo de cultivo
para artemia salina con oxigenación. La evaluación se inicio en forma
paralela. Los experimentos se establecieron bajo un diseño
completamente aleatorio, con cuatro repeticiones incluyendo los
grupos control y blanco. La evaluación de mortalidad de artemia
salina se registró a las 24 horas después de la aplicación de los
tratamientos.
20. BIOENSAYO
Luego de la incubación se examinaron los tubos de ensayo, haciendo el
respectivo conteo de la cantidad de artemias salinas muertas (no
móviles).
Se procedió de la misma manera en las dos muestras seleccionadas a
evaluar (ECl2 y EEAT). El cálculo de la concentración de la fracción o
sustancia que provocó la muerte del 50% de las artemias se determinó a
través del análisis Probit.
28. CÁLCULO DE LA DOSIS LETAL DL50
PARA LA FRACCIÓN EEAT
CALCULO EXPERIMENTAL :
M = 0.50 – 0.3407
M = 0.1593
Log DL50 = Log (125) + (0.1593 Log 2)
Log DL50 = 2.0969 + 0.0479
Log DL50 = 2.1448
DL50 = 139.57 ppm
CALCULO SEGÚN FINNEY :
y = 0.561x + 2.91
Donde: y = 5
5 = 0.561x + 2.91
0.561x = 5 – 2.91
x = 5 – 2.91 / 0.561
x = 2.09
Como x = Log dosis
Log dosis = 2.09
Dosis = 123.02 ppm
29. CONCLUSIONES
En el transcurso del presente estudio de investigación el ensayo de
letalidad en Artemia Salina es muy usualmente utilizado para
evaluar la bioactividad de extractos de plantas y muy en especial en
especies de plantas de medicina tradicional, por tanto mediante la
DL50 se logro obtener la dosis letal de las fracciones alcaloideas
siguientes; con respecto a la primera fracción alcaloidea EEAT =
123.02 ppm y la segunda fracción alcaloidea ECl2 = 239.88 ppm.
En el ensayo de letalidad por medio de las artemias salinas en el
estadio de nauplio que es el más adecuado para este análisis
podemos decir que el posible mecanismo por el cual actúan los
extractos de la fracción alcaloidea es a traves de la bomba sodio y
potasio ya que está presente en toda célula viva.
30. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Finney, D. J., Ed. (1952). Probit Analysis. Cambridge, England,
Cambridge University Press.
Finney, D. J. and W. L. Stevens (1948). "A table for the calculation of
working probits and weights in probit analysis." Biométrica 35(1-2).
Greenberg, B. G. (1980). "Chester I. Bliss, 1899-1979." International
Statistical Review / Revue Internationale de Statistique 8(1).
Bordwell F.G. (1988). Equilibrium acidities in dimethyl sulfoxide
solution.
The Survival of Artemia Salina (Brine Shrimp) in various media, P. C.
Croghan-Department of Zoology, University of Cambridge (Received
10 July 1957).
Boone, E. & Baas Becking, L. G. M. (1931). Salt effects on eggs and
nauplii of Artemia talina L.J. gen. Pkytiol.
Jacobi, E. F. & Baas Becking, L. G. M. (1933). Salt antagonism and
effect of concentration innauphi of Artemia salina L. Tijdschr. ned.
Dierk..