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I Topi Transgenici
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I Topi Transgenici

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Transcript

  • 1. I topi transgenici
    • Erika Asperges
    • 4°D a.s. 08/09
    • Liceo Scientifico S. Allende
    • Milano
  • 2. Indice
    • Introduzione all’ingegneria genetica
    • Introduzione ai topi transgenici
    • Ottenere cellule knockout
    • Selezionare cellule knockout
    • Ottenere una generazione knockout
    • Knockout condizionato
  • 3. La bioingegneria genetica
    • Insieme di tecniche che isolano, clonano, introducono e esprimono geni in un ospite eterelogo.
    • Altera le sequenze originali in favore di altre più adatte .
    • Esprimere nuove proteine.
    • Creare gli OGM, guarire malattie genetiche.
  • 4. I topi transgenici
    • Topo in cui viene soppressa l’espressione di un determinato gene (gene knockout) .
    • Usati per lo studio di disordini genetici.
    • Creati negli anni ’80, nel 2007 hanno consentito ai loro inventori di ottenere il Nobel .
  • 5. Ottenere cellule knockout
    • Studio approfondito del gene da disattivare.
    • Disattivazione del gene.
    • Scelta del vettore (spesso plasmidi)
    • Inserimento del gene per elettroporazione.
    • Ricombinazione omologa in cellule staminali.
  • 6. Selezionare cellule knockout Raramente la ricombinazione avviene correttamente!!! Per selezionare le cellule correttamente transfettate si usano vettori che contengono marker di selezione.
  • 7. Primo marker:
    • È un plasmide resistenza
    • che contiene il gene knockout
    • Si aggiunge l’antibiotico
    È avvenuta la ricombinazione omologa: la cellula sopravvive Non è avvenuta la ricombinazione: la cellula muore
  • 8. Secondo marker:
    • È una sequenza per la TK che rende tossico il Ganciclovir.
    Ricombinazione omologa: la TK non viene prodotta Ricombinazione non omologa: la TK viene prodotta Si aggiunge il Ganciclovir Le cellule sopravvivono Le cellule muoiono
  • 9. Ottenere una generazione knockout
    • Le cellule selezionate sono inserite nella blastocisti di una femmina di topo gravida
    • Per controllare se le cellule knockout attecchiscono si usa il colore del pelo: la blastocisti è per il nero , le cellule staminali knockout per il bianco .
    • Le chimere devono essere bianche e nere, i topi knockout solo bianchi.
  • 10. Legenda dei simboli
    • ♀ ………………………………… ...Femmina
    • ♂ ………………………………… .....Maschio
    • N .………..Allele dominante per il pelo nero
    • n .……….Allele recessivo per il pelo bianco
    • ñ ……………… Allele recessivo transgenico per il pelo bianco
    • ..……………………. N on passa il turno !
    • …………………………… Passa il turno !
  • 11. Fase 1
    • Si impiantano cellule staminali knockout per pelo bianco in blastocisti per pelo nero.
    Cellule staminali con allele ñ Blastocisti con alleli NN NN ♂ o ♀ Nñ ♀ (chimera) Nñ ♂ (chimera) ♀ ♂
  • 12.
    • Le chimere maschio sono incrociate con femmine bianche.
    Fase 2 ♂ ♀ N ñ n n Nn Nn nñ nñ
  • 13. Fase 3
    • Gli eterozigoti knockout sono incrociati fra loro.
    ♀ ♂ n n ñ ñ nñ nñ nn ñ ñ Omozigote non knockout o knockout eteroziogote Omozigote knockout
  • 14.
    • Per capire se un topo è eterozigote o omozigote e/o maschio o femmina prima che nasca, si usa la PCR .
    • Se la mutazione è incompatibile con la vita, i knockout omozigoti ottenuti (l’ oggetto di studio) muoiono durante la vita uterina o poco dopo la nascita.
  • 15. Il knockout condizionato
    • Per evitare la morte precoce del topo, si usa il knockout condizionato, cioè si sopprime il gene solo in un tessuto.
    • L’inattivazione avviene solo dopo il processo differenziativo, perché la ricombinazione omologa avviene tardi solo in alcuni tessuti.
  • 16. Fine

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