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I Topi Transgenici
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I Topi Transgenici

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  • 1. I topi transgenici <ul><li>Erika Asperges </li></ul><ul><li>4°D a.s. 08/09 </li></ul><ul><li>Liceo Scientifico S. Allende </li></ul><ul><li>Milano </li></ul>
  • 2. Indice <ul><li>Introduzione all’ingegneria genetica </li></ul><ul><li>Introduzione ai topi transgenici </li></ul><ul><li>Ottenere cellule knockout </li></ul><ul><li>Selezionare cellule knockout </li></ul><ul><li>Ottenere una generazione knockout </li></ul><ul><li>Knockout condizionato </li></ul>
  • 3. La bioingegneria genetica <ul><li>Insieme di tecniche che isolano, clonano, introducono e esprimono geni in un ospite eterelogo. </li></ul><ul><li>Altera le sequenze originali in favore di altre più adatte . </li></ul><ul><li>Esprimere nuove proteine. </li></ul><ul><li>Creare gli OGM, guarire malattie genetiche. </li></ul>
  • 4. I topi transgenici <ul><li>Topo in cui viene soppressa l’espressione di un determinato gene (gene knockout) . </li></ul><ul><li>Usati per lo studio di disordini genetici. </li></ul><ul><li>Creati negli anni ’80, nel 2007 hanno guadagnato il Nobel ai loro inventori. </li></ul>
  • 5. Ottenere cellule knockout <ul><li>Studio approfondito del gene da disattivare. </li></ul><ul><li>Disattivazione del gene. </li></ul><ul><li>Scelta del vettore (spesso plasmidi) </li></ul><ul><li>Inserimento del gene per elettroporazione. </li></ul><ul><li>Ricombinazione omologa in cellule staminali. </li></ul>
  • 6. Selezionare cellule knockout Raramente la ricombinazione avviene correttamente!!! Per selezionare le cellule correttamente transfettate si usano vettori che contengono marker di selezione.
  • 7. Primo marker: <ul><li>È un plasmide resistenza </li></ul><ul><li>che contiene il gene knockout </li></ul><ul><li>Si aggiunge l’antibiotico </li></ul>È avvenuta la ricombinazione omologa: la cellula sopravvive Non è avvenuta la ricombinazione: la cellula muore
  • 8. Secondo marker: <ul><li>È una sequenza per la TK che rende tossico il Ganciclovir. </li></ul>Ricombinazione omologa: la TK non viene prodotta Ricombinazione non omologa: la TK viene prodotta Si aggiunge il Ganciclovir Le cellule sopravvivono Le cellule muoiono
  • 9. Ottenere una generazione knockout <ul><li>Le cellule selezionate sono inserite nella blastocisti di una femmina di topo gravida </li></ul><ul><li>Per controllare se le cellule knockout attecchiscono si usa il colore del pelo: la blastocisti è per il nero , le cellule staminali knockout per il bianco . </li></ul><ul><li>Le chimere devono essere bianche e nere, i topi knockout solo bianchi. </li></ul>
  • 10. Legenda dei simboli <ul><li>♀ ………………………………… ...Femmina </li></ul><ul><li>♂ ………………………………… .....Maschio </li></ul><ul><li>N .………..Allele dominante per il pelo nero </li></ul><ul><li>n .……….Allele recessivo per il pelo bianco </li></ul><ul><li>ñ ……………… Allele recessivo transgenico per il pelo bianco </li></ul><ul><li>..……………………. N on passa il turno ! </li></ul><ul><li>…………………………… Passa il turno ! </li></ul>
  • 11. Fase 1 <ul><li>Si impiantano cellule staminali knockout per pelo bianco in blastocisti per pelo nero. </li></ul>Cellule staminali con allele ñ Blastocisti con alleli NN NN ♂ o ♀ Nñ ♀ (chimera) Nñ ♂ (chimera) ♀ ♂
  • 12. <ul><li>Le chimere maschio sono incrociate con femmine bianche. </li></ul>Fase 2 ♂ ♀ N ñ n n Nn Nn nñ nñ
  • 13. Fase 3 <ul><li>Gli eterozigoti knockout sono incrociati fra loro. </li></ul>♀ ♂ n n ñ ñ nñ nñ nn ñ ñ Omozigote non knockout o knockout eteroziogote Omozigote knockout
  • 14. <ul><li>Per capire se un topo è eterozigote o omozigote e/o maschio o femmina prima che nasca, si usa la PCR . </li></ul><ul><li>Se la mutazione è incompatibile con la vita, i knockout omozigoti ottenuti (l’ oggetto di studio) muoiono durante la vita uterina o poco dopo la nascita. </li></ul>
  • 15. Il knockout condizionato <ul><li>Per evitare la morte precoce del topo, si usa il knockout condizionato, cioè si sopprime il gene solo in un tessuto. </li></ul><ul><li>L’inattivazione avviene solo dopo il processo differenziativo, perché la ricombinazione omologa avviene tardi solo in alcuni tessuti. </li></ul>
  • 16. Fine

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