Operaciones Unitarias
BIOREACTORES
TIPOS DEBIORREACTORES
DEFINICIÓN:Recipiente en el que se lleva a cabouna transformación en la queinterviene un biocatalizador.
CARACTERÍSTICAS GENERALES:1. Condiciones           de   Operación suaves (Poco   aporte energético).2. Transformación   Is...
CLASIFICACIÓN DE LOS BIORREACTORES:
TIPOS DE AGITACIÓN:
TIPOS DE BIORREACTORES: 1 CSTR
TIPOS DE BIORREACTORES: 2, DE COLUMNA
TIPOS DE REACTORES DE COLUMNA:
COLUMNA DE BURBUJEO:
CARACTERÍSTICAS DEL AIR –LIFT:
BIORREACTOR TIPO AIR – LIFT:
TIPOS DE AGITACIÓN:
RECIRCULACIÓN   INTERNA   DETANQUES:
RECIRCULACIÓN EXTERNA DE TANQUES:
TIPOS DE BIOCATALIZADORES: ENZIMAS
TIPOS DE BIOCATALIZADORES: ENZIMAS
TIPOS DE BIOCATALIZADORES: CONFIGURACIÓN DEL                   TANQUE
TIPOS DE BIOCATALIZADORES: REACTOR              TUBULAR
TIPO DE INMOVILIZACIÓN: CELULAR
TIPO DE INMOVILIZACIÓN: CELULAR
INMOVILIZACIÓN PASIVA:
INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS EN TANQUES:
INMOVILIZACIÓN ACTIVA:
INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS EN REACTORES DE               MEMBRANA:
INMOVILIZACIÓN CELULAR: VENTAJAS
INMOVILIZACIÓN CELULAR: DESVENTAJAS
OTRO TIPO DE BIORREACTORES:
BIORREACTORES ESPECIALES:
BIORREACTORES PULSANTES:
REACTORES ROTATORIOS:
FOTO-BIORREACTORES: INICIO
FOTO-BIORREACTORES: TIPOS
BIBLIOGRAFÍA:
EL FERMENTADOR
DEFINICION OPERATIVA:•Contenedor en el que se mantiene unmedio ambiente favorable para laoperación de un proceso biológico...
PROCESOS DEFERMENTACIÓN
ÍNDICE:1.- INTRODUCCIÓN.2.- MATERIAS PRIMAS Y MEDIOS DE  CULTIVO.4.- CINÉTICA DE LAS REACCIONES.5.- SISTEMAS DE FERMENTACI...
1.- Introducción.
1.- INTRODUCCIÓN.1.1.- Concepto de fermentación.1.2.- Importancia de la fermentación  en la biotecnología alimentaria.1.3....
1.1.-Concepto de fermentación    • Proceso de fermentación:   MICROORGANISMOSBacterias, levaduras , hongos       MICROORGA...
1.2.- Importancia de la fermentación en la                biotecnología.• Procesos de fermentación en alimentos:   – Natur...
1.3.- Ejemplos.•   TIPOS DE FERMENTACIÓN DE VARIOS MICROORGANISMOS:     Fermentación                       Productos      ...
1.3.- Ejemplos.• Fermentación etílica:  – Se transforman los azúcares de las uva en etanol, debido a la    acción de las l...
1.3.- Ejemplos.• Levaduras saccharomyces cerevisiae (principales  responsables de la fermentación alcohólica)
1.3.- Ejemplos.• Fermentación láctica:
2.- Materias primas y  medios de cultivo.
2.- MATERIAS PRIMAS y MEDIOS DE             CULTIVO.2.1.- Criterios utilizados en la    formulación  del medio.2.2.- Prepa...
2.1.- Criterios utilizados en la       formulación del medio. CARACTERÍSTICAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:   Contener los e...
2.1.- Criterios utilizados en la        formulación del medio.–   Recuperación del producto.–   Eliminación de la represió...
2.1.- Criterios utilizados en la   formulación del medio.• INFLUENCIAS DEL MEDIO :  1.- En el crecimiento celular.  2.- En...
2.1.- Criterios utilizados en la            formulación del medio.   • 1.- INFLUENCIA DEL MEDIO EN EL CRECIMIENTO CELULAR....
2.1.- Criterios utilizados en la   formulación del medio.
2.1.- Criterios utilizados en la        formulación del medio.• Elementos en el medio:Similar a la composición elemental d...
2.1.- Criterios utilizados en la     formulación del medio.  • 2.- INFLUENCIA EN EL PROCESAMIENTO POSTERIOR:• Subproductos...
2.1.- Criterios utilizados en la           formulación del medio.3.- INFLUENCIA DEL MEDIO EN LA FISIOLOGÍA Y MORFOLOGÍA DE...
2.1.- Criterios utilizados en la       formulación del medio.•   pH:Las hifas del P. Chrysogenum se vuelven más cortas y g...
2.1.- Criterios utilizados en la       formulación del medio.•   CATIONES DIVALENTES: inducen el crecimiento en forma de g...
2.1.- Criterios utilizados en la     formulación del medio.• CONTROL DEL PROCESO:VARIABLES.     1.-pH     2.-ESPUMA     3....
2.1.- Criterios utilizados en la           formulación del medio.                                                1.-pH: C...
2.1.- Criterios utilizados en la         formulación del medio.                2.- ESPUMA: ORIGEN:  Desnaturalización de ...
2.1.- Criterios utilizados en la    formulación del medio.• ANTIESPUMANTES:  – Eficacia (Depende de las condiciones de fer...
2.1.- Criterios utilizados en la    formulación del medio.                  3.- OXÍGENO.– Requerimientos en procesos aerob...
2.1.- Criterios utilizados en la   formulación del medio.              4.-TEMPERATURA: – Temperatura óptima para la produc...
2.1.- Criterios utilizados en la         formulación del medio.           5.-REGULACIÓN DE LA FORMACIÓN DEL PRODUCTO. PRE...
2.- MATERIAS PRIMAS y MEDIOS          DE CULTIVO.2.1.- Criterios utilizados en la    formulación  del medio.2.2.- Preparac...
2.2.-Preparación del sustrato. OBJETIVOS:   Evitar el desarrollo de patógenos y alterantes para prolongar la vida    del...
2.- MATERIAS PRIMAS y MEDIOS          DE CULTIVO.2.1.- Criterios utilizados en la    formulación  del medio.2.2.- Preparac...
2.3.-Medios de fermentación microbiana.    • Los compuestos petroquímicos ( hidrocarburos,      alcoholes y ácidos)      C...
2.3.-Medios de fermentación microbiana.  CARBOHIDRATOS:    ALMIDÓN: es el más importante actualmente .      En forma de...
2.3.-Medios de fermentación                     microbiana. SACAROSA:   En forma cristalina o en forma bruta como zumos ...
2.3.-Medios de fermentación microbiana.• NITRÓGENO:  – Fuentes: amoniaco, nitratos, urea, y el nitrógeno presente en los  ...
2.3.-Medios de fermentación                       microbiana.   •     Substratos complejos utilizados en los medios de fer...
2.- MATERIAS PRIMAS y MEDIOS          DE CULTIVO.2.1.- Criterios utilizados en la    formulación  del medio.2.2.- Preparac...
2.4.-Medios de cultivo de células                   animales.•   SUEROS UTILIZADOS   :    – Suero fetal de ternera como me...
2.4.-Medios de cultivo de células              animales. FUNCIONES DEL SUERO EN LOS MEDIOS DE CULTIVO. Proporciona hormo...
2.4.-Medios de cultivo de células                  animales. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO:   BASALES Y BME :(medio basal d...
2.- MATERIAS PRIMAS y MEDIOS          DE CULTIVO.2.1.- Criterios utilizados en la    formulación  del medio.2.2.- Preparac...
2.5.-Medios de cultivo de células                 vegetales.•   COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE CÉLULAS   ...
2.- MATERIAS PRIMAS y MEDIOS          DE CULTIVO.2.1.- Criterios utilizados en la    formulación  del medio.2.2.- Preparac...
2.6.-Mantenimiento y esterilización. 1.- MANTENIMIENTO DE LOS MEDIOS . •   El medio de almacenamiento y subcultivo de cepa...
2.6.-Mantenimiento y esterilización.2.- ESTERILIZACIÓN DE CULTIVOS. OBJETIVOS:   Evitar el desarrollo de microorganismos...
2.6.-Mantenimiento y esterilización. ¿DONDE SE CONTROLA LA ESTERILIDAD?   Mantener la pureza del inóculo.   Esterilizar...
2.6.-Mantenimiento y esterilización.
2.6.-Mantenimiento y esterilización.   TIPOS DE ESTERILIZACIÓN.    ESTERILIZACIÓN DISCONTINUA                    ESTERILIZ...
Cinética del crecimiento•   3.1-¿Qué entendemos por crecimiento?•   3.2-Conceptos básicos•   3.3-Formas de medición del cr...
3.1-CrecimientoEl crecimiento se puede considerar como el aumentoordenado de todos los constituyentes químicos de un      ...
3.- CINETICA DELCRECIMIENTO DE LOSMICROORGANISMOS
3.2-Conceptos básicosGeneración (n)Es el número de divisiones celulares que ocurren enun determinado tiempo en un cultivo ...
El crecimiento puede ser :-A nivel de individuos dentro de población         CICLO CELULAR-Crecimiento de poblaciones celu...
Ciclo celular: fisión binaria                        Gemación,                        ej.                        levaduras
Crecimiento de poblacionesCrecimiento exponencial: es el tipo de crecimientode una población donde el número de célulasse ...
3.3- Formas de medición del  crecimiento microbiano3.3.1- Peso seco celular3.3.2- Absorción3.3.3- Peso húmedo3.3.4- Volume...
3.3.1- Peso seco celular      Consiste en dejar secar volúmenesconocidos de cultivo celular lentamente hastaque alcancen p...
3.3.2- AbsorciónConsiste en el uso de celdas espectrofotométricaspues las células desvían la luz q llega al detector yesa ...
3.3.3- Peso húmedo  Consiste en una centrifugacióno filtración seguida del pesado.  Este proceso es extrarrápido, hay nece...
Recuento de viables - Filtración       por membrana
3.3.4- Volumen      Consiste en la centrifugación entubos graduados de tal forma q mepermitan determinar el volumen decélu...
3.3.5- Recuento de células           por cámara de Petroff-HausserMuestra de cultivo diluído en cámara de volumen pequeño ...
3.3.6- Mediciones físicas      El crecimiento de células origina lageneración de calor la cual estárelacionada con la conc...
3.4- Crecimiento en cultivo            intermitente      El cultivo intermitente representa elcrecimiento en un sistema ce...
Crecimiento de unmicroorganismo en medio de       cultivo líquido                   1- Fase de latencia                   ...
Fases de crecimiento•Fase lag - las células se adaptan al nuevo ambiente, aun nose dividen•Fase exponencial (log) velocida...
Cinética de crecimiento en cultivo           intermitente      El crecimiento microbiano unicelular esautocatalítico, es d...
Representación aritmética yexponencial del crecimiento
3.5- Factores que afectan a la   rapidez de crecimientoLos factores que intervienen son:      - concentración de substrato...
Efecto de la temperatura       Cada microorganismo tiene una temperatura decrecimiento adecuada       Si consideramos la v...
Tipos de microorganismos según         la temperatura   Tipode microorg   T mínima   T óptima   T máxima   Psicrófilo     ...
Veloc de              Gráfica              Psicrófiloscrecimiento                          Mesófilos                      ...
Efecto del pH      Es un parámetro crítico en el cultivo demicroorganismos ya que estos sólo puedencrecer en un rango estr...
Aspectos sobre el pH•Cada tipo de microorganismo tiene unrango de pH en el que puede viviradecuadamente, fuera de este ran...
Actividad del aguaSe denomina actividad de agua a larelación entre la presión de vapor de aguadel substrato de cultivo (P)...
Efecto de la radiación       Las radiaciones ultravioleta (uv), Rayos X yradiación γ producen efectos esterilizantes (dest...
Presión hidrostática      Las altas presiones inhiben el crecimiento de losmicroorganismos      La razón por la que las al...
Potencial redox: Concentración          de oxígeno       Este es otro factor determinante delcrecimiento y del metabolismo...
Continuación      En general, cuando un microorganismo requiereun ambiente oxidante se dice que desarrolla unmetabolismo o...
4. Sistemas de Fermentación
Sistemas de Fermentación• Son formas diferentes de cultivo de  microorganismos con el fin de obtener un  rendimiento desea...
Factores que Influyen en el           Crecimiento• Son comunes para todos los sistemas:  – Concentración de substrato  – T...
Consumo de Nutrientes y      Formación de Producto• Relacionamos el consumo de substrato y la  formación de producto con e...
Consumo de Nutrientes y         Formación de Producto• Para el Crecimiento   – Acumulación total = crecimiento – desaparic...
Rendimientos de Biomasa y            Producto• Muestran en cada caso la cantidad de  biomasa o producto producido  dependi...
Sistemas Discontinuos• Se considera un sistema cerrado, para todo  menos para la aireación• Tiene una cantidad limitada de...
Cinética de un Sistema Discontinuo• La concentración de biomasa por unidad de  tiempo es:                 x – XR = γ (SR –...
Sistema Discontinuo• Ciclo de Fermentación  discontinuo
Sistemas Discontinuos       Alimentados a Intervalos• El substrato se va añadiendo a intervalos durante el  proceso• Es un...
Sistemas Continuos• Sistemas abiertos, en los que el medio se va  añadiendo de un modo continuo a reactor• Se va eliminand...
Sistemas Continuos• Es básico controlar que el volumen de  biorreactor sea constante• Existen diferentes formas de consegu...
Sistemas Continuos• La concentración de biomasa viene dada por:                                           Ks·D            ...
Quimiostato• Suministramos nutriente esencial limitante a  medida que va siendo necesario.• Se va eliminando biomasa para ...
Quimiostato• Esquema del  fermentador
Quimiostato• La rapidez de crecimiento depende del tipo de  nutriente limitante  – Carbono  – Nitrógeno  – Fósforo  – Vita...
Turbidostato• El producto no se saca del reactor• Tenemos un circuito de reflujo, que acoge el  producto cuando hay exceso...
Turbidostato• Esquema del  turbidostato
Síntesis de Metabolitos              Secundarios• Existen productos cuya síntesis no está  relacionada con el crecimiento,...
En cuanto al biorreactor:Para cada proceso biotecnológico, elsistema de contención más apropiado debediseñarse para brinda...
Equipos accesorios.  •Manómetros  •Válvulas de control  •Tuberías  •Control de temperatura  •Control de pH  •Control de es...
El medio ambiente puede considerarse entres aspectos: •BIOLOGICO •QUIMICO •FISICO
AIREACION Y AGITACION.La agitación es necesaria para:1- incrementar la velocidad detransferencia de oxígeno desde lasburbu...
2- aumentar la velocidad detransferencia de oxígeno y nutrientesdesde el medio a las células. Debido almovimiento se evita...
5- aumentar la tasa o la eficiencia de latransferencia de calor entre el medio ylas superficies de refrigeración delfermen...
Tipos de fermentador:•Crecimiento en suspensión. •Crecimiento con soporte.
En el crecimiento en suspensión, los organismosestán sumergidos y dispersados en el medionutritivo y su movimiento sigue a...
TECNOLOGIA DE BIOPROCESOS -      FERMENTACION
Las etapas en la manufactura de productosen la tecnología de bioprocesos son,esencialmente, similaresindependientemente de...
En todos los ejemplos, se cultiva gran númerode células en condiciones controladas.Los organismos deben cultivarse y“motiv...
PRINCIPIOS DE CRECIMIENTO       MICROBIANO
El crecimiento de microorganismospuede verse como el incremento en elmaterial celular, expresado en términosde masa o núme...
Tiempo de duplicación:Se refiere al tiempo requerido paraduplicar el peso de la biomasa. Tiempo de generación: Se refiere ...
En un proceso biotecnológico, existen tres formasde hacer crecer a los microorganismos en unbiorreactor:-Por lotes (batch)...
Modos de operación de losfermentadores: •Operación por lotes: El reactor se carga con la especie reactiva y, a medida que ...
El ambiente nutricional dentro delbiorreactor cambia en forma continua y,por lo tanto, fuerza cambios en elmetabolismo cel...
La naturaleza compleja del crecimientode microorganismos por lotes, se muestratal como sigue:
La fase 1 o “log”, es un tiempo de aparente nocrecimiento, pero estudios bioquímicosdemuestran actividad metabólica, indic...
Existe, luego, una fase de aceleracióntransitoria cuando el inóculo comienza acrecer que es seguida, rápidamente, poruna f...
Sin embargo, en cultivos por lote, elcrecimiento exponencial es de duraciónlimitada y, a medida que las condicionesnutrici...
La fase final del ciclo es la fase de muerte,cuando la velocidad de crecimiento hacesado.La mayoría de los procesos biotec...
Algunos medios para prolongar la vida de uncultivo por lotes:-Adición gradual de componentes nutritivosconcentrados (carbo...
•Operación continua: Existe un flujocontinuo de reactivos frescos hacia elreactor y el producto fluye continuamentehacia f...
Los organismos pueden separarse de lacorriente que lleva al producto y reciclarsepara inocular el líquido de alimentación....
Esta práctica de cultivo continuo, proveeun crecimiento casi balanceado, conpequeña fluctuación de nutrientes,metabolitos,...
Este método de cultivo continuo, permite alos organismos crecer en condiciones deestado estacionario, en las que elcrecimi...
En un sistema de cultivo perfectamentemezclado, se pasa medio estéril albiorreactor, a un flujo constante y unamezcla de c...
Ventajas de un proceso por lotes:Las principales son: menor riesgo decontaminación, flexibilidad operacionalcuando los fer...
Desventajas del proceso por lotes:La principal es la alta proporción de tiempoimproductivo en la operación del fermentador...
Los fermentadores deben ser vaciados,limpiados, esterilizados y recargadosantes de cada fermentación, operacionestodas ese...
Esterilización:•Esterilización de fermentadores.   •En el laboratorio, el método estándar de   esterilización es el calor:...
•Esterilización del fermentador y el medioconjuntamente.   •El calentamiento se consigue mediante:      •Inyección de vapo...
•Esterilización por separado del fermentadory el medio.    •Este sistema ofrece ventajas ya que    reduce el tiempo en el ...
Pasos a tener en cuenta:-Cambio de escala-Diseño de medios para procesos defermentación-Fermentación en sustratos sólidos-...
Procesamiento posterior de la         muestra.        Purificación.
El diseño y la operación eficiente de losprocesos de purificación, son elementosvitales para obtener los productosdeseados...
Este procesamiento final involucrará,principalmente, la separación inicial de lamezcla de cultivo hacia una fase líquida y...
El procesamiento involucrará más de una etapa:-Destilación-Centrifugación-Filtración-Ultrafiltración-Extracción con solven...
GRACIAS
unitarias
unitarias
unitarias
unitarias
unitarias
unitarias
unitarias
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unitarias
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  1. 1. Operaciones Unitarias
  2. 2. BIOREACTORES
  3. 3. TIPOS DEBIORREACTORES
  4. 4. DEFINICIÓN:Recipiente en el que se lleva a cabouna transformación en la queinterviene un biocatalizador.
  5. 5. CARACTERÍSTICAS GENERALES:1. Condiciones de Operación suaves (Poco aporte energético).2. Transformación Isotérmica (poca variación en el proceso una vez ya estable).3. Productividad (Actividad y estabilidad en el
  6. 6. CLASIFICACIÓN DE LOS BIORREACTORES:
  7. 7. TIPOS DE AGITACIÓN:
  8. 8. TIPOS DE BIORREACTORES: 1 CSTR
  9. 9. TIPOS DE BIORREACTORES: 2, DE COLUMNA
  10. 10. TIPOS DE REACTORES DE COLUMNA:
  11. 11. COLUMNA DE BURBUJEO:
  12. 12. CARACTERÍSTICAS DEL AIR –LIFT:
  13. 13. BIORREACTOR TIPO AIR – LIFT:
  14. 14. TIPOS DE AGITACIÓN:
  15. 15. RECIRCULACIÓN INTERNA DETANQUES:
  16. 16. RECIRCULACIÓN EXTERNA DE TANQUES:
  17. 17. TIPOS DE BIOCATALIZADORES: ENZIMAS
  18. 18. TIPOS DE BIOCATALIZADORES: ENZIMAS
  19. 19. TIPOS DE BIOCATALIZADORES: CONFIGURACIÓN DEL TANQUE
  20. 20. TIPOS DE BIOCATALIZADORES: REACTOR TUBULAR
  21. 21. TIPO DE INMOVILIZACIÓN: CELULAR
  22. 22. TIPO DE INMOVILIZACIÓN: CELULAR
  23. 23. INMOVILIZACIÓN PASIVA:
  24. 24. INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS EN TANQUES:
  25. 25. INMOVILIZACIÓN ACTIVA:
  26. 26. INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS EN REACTORES DE MEMBRANA:
  27. 27. INMOVILIZACIÓN CELULAR: VENTAJAS
  28. 28. INMOVILIZACIÓN CELULAR: DESVENTAJAS
  29. 29. OTRO TIPO DE BIORREACTORES:
  30. 30. BIORREACTORES ESPECIALES:
  31. 31. BIORREACTORES PULSANTES:
  32. 32. REACTORES ROTATORIOS:
  33. 33. FOTO-BIORREACTORES: INICIO
  34. 34. FOTO-BIORREACTORES: TIPOS
  35. 35. BIBLIOGRAFÍA:
  36. 36. EL FERMENTADOR
  37. 37. DEFINICION OPERATIVA:•Contenedor en el que se mantiene unmedio ambiente favorable para laoperación de un proceso biológicodeseado.
  38. 38. PROCESOS DEFERMENTACIÓN
  39. 39. ÍNDICE:1.- INTRODUCCIÓN.2.- MATERIAS PRIMAS Y MEDIOS DE CULTIVO.4.- CINÉTICA DE LAS REACCIONES.5.- SISTEMAS DE FERMENTACIÓN.
  40. 40. 1.- Introducción.
  41. 41. 1.- INTRODUCCIÓN.1.1.- Concepto de fermentación.1.2.- Importancia de la fermentación en la biotecnología alimentaria.1.3.- Ejemplos.
  42. 42. 1.1.-Concepto de fermentación • Proceso de fermentación: MICROORGANISMOSBacterias, levaduras , hongos MICROORGANISMO MEDIO DE CULTIVO CO2 CONDICIONES AMBIENTALES PRODUCTO Intra o extra celular
  43. 43. 1.2.- Importancia de la fermentación en la biotecnología.• Procesos de fermentación en alimentos: – Naturales o espontáneas (fermentación del cacao,ensilado,). – Inoculadas ( vino, yogurt).• Procesos de fermentación en medios de cultivo: – Producción de biomasa (proteína unicelular, levadura de pan, levadura de cerveza). – Obtención de metabolitos primarios ( alcohol, ácidos orgánicos) y secundarios ( enzimas, polisacáridos).
  44. 44. 1.3.- Ejemplos.• TIPOS DE FERMENTACIÓN DE VARIOS MICROORGANISMOS: Fermentación Productos Organismos Alcohólica Etanol + CO2 Levadura(Sccharomyces) Ácido láctico Ác. láctico Bacterias del ácido láctico Ácido mixto Ác. láctico,acético,etanol, CO2, H2 Bacterias entéricas(Escherichia, salmonella) butanediol Butanediol, ác. láctico, acético, etanol, CO2, H2 Bacterias entéricas(Aerobacter, Serratia) Ácido buritico Ác. burítico, acético, CO2, H2 Clostridios(Clostridium butyricum) Acetona- butanol Acetona, butanol, etanol Clostridios(Clostridium acetobutylicum) Ácido propiónico Ác. propiónico Levadura(Sccharomyces)
  45. 45. 1.3.- Ejemplos.• Fermentación etílica: – Se transforman los azúcares de las uva en etanol, debido a la acción de las levaduras.
  46. 46. 1.3.- Ejemplos.• Levaduras saccharomyces cerevisiae (principales responsables de la fermentación alcohólica)
  47. 47. 1.3.- Ejemplos.• Fermentación láctica:
  48. 48. 2.- Materias primas y medios de cultivo.
  49. 49. 2.- MATERIAS PRIMAS y MEDIOS DE CULTIVO.2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio.2.2.- Preparación del sustrato.2.3.- Medios de fermentación microbiana.2.4.- Medios de cultivo de células animales.2.5.- Medios de cultivo para el crecimiento de células vegetales.2.6.- Mantenimiento y esterilización.
  50. 50. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio. CARACTERÍSTICAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:  Contener los elementos para la síntesis celular y para la formación de producto  Medio ambiente favorable para el crecimiento y/o formación del producto.  Económicamente rentable.  Máxima producción.  Adaptación constante al proceso de fermentación.
  51. 51. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio.– Recuperación del producto.– Eliminación de la represión catabólica.– Materiales de fácil disposición en cantidad suficiente.– Bajos costes de transporte.– Impedir que las impurezas dificulten la recuperación de producto.
  52. 52. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio.• INFLUENCIAS DEL MEDIO : 1.- En el crecimiento celular. 2.- En el procesado posterior. 3.- En la fisiología y morfología de los microorganismos.
  53. 53. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio. • 1.- INFLUENCIA DEL MEDIO EN EL CRECIMIENTO CELULAR. – Los microorganismos necesitan:CarbonoNitrógenoMinerales BiomasaFactores de crecimiento Microorganismos Biosíntesis yAgua mantenimiento celularOxígeno(aerobios) Condiciones medioambientales: pH, Temperatura...
  54. 54. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio.
  55. 55. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio.• Elementos en el medio:Similar a la composición elemental de los microorganismos. C H O N S Cu, Mn,Co,Mo,B.... 45 7 33 10 2,5 Trazas – La cantidad de carbono necesaria en condiciones aerobias, se determina por el coef. de rendimiento de biomasa: Biamasa producida( g ) γc = Substrato carbono utilizado ( g )• Factores de crecimiento: aminoácidos, vitaminas o nucleótidos.(Por necesidad p para aumentar la velocidad de crecimiento)
  56. 56. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio. • 2.- INFLUENCIA EN EL PROCESAMIENTO POSTERIOR:• Subproductos proceso de recuperación más caro y complejo. (Procesos de purificación de productos y tratamiento de desechos).• Necesidad de adicionar antiespumantes Problemas en el procesado de productos asociados con el crecimiento microbiano
  57. 57. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio.3.- INFLUENCIA DEL MEDIO EN LA FISIOLOGÍA Y MORFOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS.• Las condiciones relacionadas con el medio que han demostrado tener influencia en la morfología : pH Cationes Viscosidad divalentes Polímeros Morfología Agentes aniónicos quelantes Presencia de Agentes sólidos tensoactivos
  58. 58. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio.• pH:Las hifas del P. Chrysogenum se vuelven más cortas y gruesas a medida que el pH es más alcalino, forman gránulos.
  59. 59. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio.• CATIONES DIVALENTES: inducen el crecimiento en forma de gránulos, sus efectos pueden contrarrestarse con AGENTES QUELANTES. – La presencia de cationes influye en la floculación de las levaduras (importante en su sedimentación y eliminación en la producción de bebidas alcohólicas no destiladas). – El manganeso afecta a la composición celular de la pared celular de A. Niger.• AGENTES TENSOACTIVOS: Algunos aumentan la velocidad de secrección de los enzimas microbianos extracelular.• NITRÓGENO: niveles bajos inducen la formación de esporas.• AMINOÁCIDOS: niveles elevados inhiben la formación de esporas.
  60. 60. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio.• CONTROL DEL PROCESO:VARIABLES. 1.-pH 2.-ESPUMA 3.-OXÍGENO 4.-TEMPERATURA 5.-REGULACIÓN DE LA FORMACIÓN DE PRODUCTO.
  61. 61. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio. 1.-pH: Control necesario para el desarrollo celular y formación de producto. Control de forma indirecta o de forma directa:  Directamente (Añadiendo agentes buffer):  Fosfato inorgánico pH entre 6.0 y 7.5.  Ácidos orgánicos pH bajos.  Carbonato cálcico frente a la producción de ácidos.  Hidroxisales, amoniaco, ácidos sulfúrico y clorhídrico.  Indirectamente ( mediante un balance equitativo entre las fuentes de carbohidrato y nitrógeno).  Los carbohidratos bajan el pH (formación de ácidos orgánicos).  Asimilación del nitrato alcalinidad.  DESVENTAJAS: Efectos represivos sobre la formación del producto.
  62. 62. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio. 2.- ESPUMA: ORIGEN: Desnaturalización de las proteínas en la interfase gas- líquido. PROBLEMAS: Ascender hasta ocupar totalmente la cabeza del fermentador. Evacuar parte del contenido del aparato por la salida del aire. SOLUCIÓN: Antiespumantes ( agentes tensoactivos que reducen la tensión superficial de las espumas hasta dispersarlas ). Disociadores mecánicos.
  63. 63. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio.• ANTIESPUMANTES: – Eficacia (Depende de las condiciones de fermentación): • Composición del medio, cepas microbianas, etapa de crecimiento, configuración de las vías de aireación y del fermentador. – Selección y cantidad del antiespumante: • Procedimientos de ensayo y error. • Uso de soportes(aceites orgánicos y minerales) • Cantidad de antiespumante mínima ( afecta a la velocidad de transferencia de oxígeno hasta u 50%) • No deben ser tóxicos ni peligrosos, esterilizables por el calor y economicos baratos.
  64. 64. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio. 3.- OXÍGENO.– Requerimientos en procesos aerobios.– Influencia sobre los procesos metabólicos.– Velocidad de absorción específica de oxígeno concentración de oxígeno disuelto– Antioxidantes como protección del producto.
  65. 65. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio. 4.-TEMPERATURA: – Temperatura óptima para la producción celular o de metabolitos. – Uso de termostatos
  66. 66. 2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio. 5.-REGULACIÓN DE LA FORMACIÓN DEL PRODUCTO. PRECUSORES INDUCTORES  incorporarse al medio el inductor específico  mediante adiciones continuas o discontinuas INHIBIDORES:  minimizar la formación de otros intermedios metabólicos.  Prevenir el metabolismo posterior al producto deseado Ejemplos:  Fuente de N utilizable rápidamente inhibe la producción de algunos antibióticos.  El ácido fenilacético es el ppal percusor en la producción de bencilpenicilina por fermentación.
  67. 67. 2.- MATERIAS PRIMAS y MEDIOS DE CULTIVO.2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio.2.2.- Preparación del sustrato.2.3.- Medios de fermentación microbiana.2.4.- Medios de cultivo de células animales.2.5.- Medios de cultivo para el crecimiento de células vegetales.2.6.- Mantenimiento y esterilización.
  68. 68. 2.2.-Preparación del sustrato. OBJETIVOS:  Evitar el desarrollo de patógenos y alterantes para prolongar la vida del alimento.  Favorecer el desarrollo de los microorganismos deseados.  Hacer accesible el sustrato a los microorganismos que deben llevar a cabo la transformación.  Mejorar la textura, el aroma o el sabor del producto final. EJEMPLOS:  Adición de proteínas durante la fabricación del yogurt.  Prensado de la uva( se favorece el acceso al sustrato).
  69. 69. 2.- MATERIAS PRIMAS y MEDIOS DE CULTIVO.2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio.2.2.- Preparación del sustrato.2.3.- Medios de fermentación microbiana.2.4.- Medios de cultivo de células animales.2.5.- Medios de cultivo para el crecimiento de células vegetales.2.6.- Mantenimiento y esterilización.
  70. 70. 2.3.-Medios de fermentación microbiana. • Los compuestos petroquímicos ( hidrocarburos, alcoholes y ácidos) Cuando el petróleo era barato no mucha extensión. • En la actualidad: materias primas renovables que contienen azúcar y almidón y menos grasas y aceites. • Futuro: los productos de la hidrólisis de la lignocelulosa las materias primas más importantes en los procesos de la fermentación .( La lignocelulora representa el 50% de la producción anual mundial de biomasa).
  71. 71. 2.3.-Medios de fermentación microbiana.  CARBOHIDRATOS:  ALMIDÓN: es el más importante actualmente .  En forma de granos o raices, enteros o molidos, de plantas como el maíz, arroz, trigo , patatas y mandioc como almidón purificado, modificado o como dextrinas.  CELULOSA:  Presente en la madera combinado con la hemicelulosa y la lignina en forma de lignocelulosa  La lignina hace a la celulosa resistente al ataque microbiano No son rentables los métodos químicos y enzimáticos que convierten la lignocelulosa en azúcares fermentables. ( Para obtener champiñones y substrato para producir enzimas celulolíticas)
  72. 72. 2.3.-Medios de fermentación microbiana. SACAROSA:  En forma cristalina o en forma bruta como zumos o melazas ( subproducto de la manufactura de azúcares más barato varía su composición , causando problemas en la reproductibilidad de la fermentación). LACTOSA:  En el suero de la leche ( 4% al 5%).  La baja concentración, , caro su transporte.Solo se utiliza en lugares próximos a la factoría de quesos proveedora. GLUCOSA:  Se obtiene a partir de la conversión enzimática directa del almidón.  Glucosa refinada, en forma de jarabe o cristalina para productos de mayor valor. ACEITES VEGETALES ( de soja, palma y semillas de algodón como complemento delos carbohidratos), METANOL, ETANOL......
  73. 73. 2.3.-Medios de fermentación microbiana.• NITRÓGENO: – Fuentes: amoniaco, nitratos, urea, y el nitrógeno presente en los cereales y raíces y sus subproductos. – Los aminoácidos purificados como percusores.• SUBSTRATOS COMPLEJOS: – Son una fuente barata de carbono, nitrógeno y otros nutrientes. – Presentes en plantas enteras y subproductos vegetales, animales y microbianos.
  74. 74. 2.3.-Medios de fermentación microbiana. • Substratos complejos utilizados en los medios de fermentación microbiana. FUENTE INGREDIENTES PROT. CARBOH. GRASA FIBRA CENIZA Cereales enteros Cebada 11,5 68,0 1,8 7,0 2,5 Cebada malteada 13,0 70,0 2,0 3,5 2,5 Maiz 9,9 69,2 4,4 2,3 1,3 Avena 12,0 54,0 4,5 12,0 4,0 Arroz 13,0 65,0 2,0 10,0 4,5 Trigo 8,2 69,0 1,9 2,6 1,8 Subpr.derv. plantas Melazas 3,0 54,0 0,4 9,0 Pulpa de remolacha 8,9 59,1 0,6 18,3 3,1 Pulpa de agrios (seca) 6,0 62,7 3,4 13,0 6,9 Harina de germen de maiz 22,6 53,2 1,9 9,5 3,3 Salvado de arroz 13,0 45,0 13,0 14,0 16,0 Harina integral de soja 42,0 29,9 4,0 6,0 6,5 Subp. deriv.animales Sangre 80,0 2,5 1,0 1,0 3,0 Harina de pescado 72,0 7,5 1,0 Harina de hueso 50,0 0,0 8,0 3,3 31,0Subp deriv microorganismos Hidrolizado de levaduras 52,5 0,0 1,5 10,0
  75. 75. 2.- MATERIAS PRIMAS y MEDIOS DE CULTIVO.2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio.2.2.- Preparación del sustrato.2.3.- Medios de fermentación microbiana.2.4.- Medios de cultivo de células animales.2.5.- Medios de cultivo para el crecimiento de células vegetales.2.6.- Mantenimiento y esterilización.
  76. 76. 2.4.-Medios de cultivo de células animales.• SUEROS UTILIZADOS : – Suero fetal de ternera como medio de cultivo de células de mamífero . • INCONVENIENTES: Existencias limitadas y alto precio. – Sueros de ternera, ternera recién nacida y caballo.• FORMAS DE UTILIZAR LOS SUEROS: – Suero entre un 5-10% del volumen del medio de cultivo, puede reducirse al 1-2%.
  77. 77. 2.4.-Medios de cultivo de células animales. FUNCIONES DEL SUERO EN LOS MEDIOS DE CULTIVO. Proporciona hormonas y factores de crecimiento necesarios para la función celular. Suministra los factores necesarios para la unión al soporte. Actúa como agente tamponante. Se une e inactiva o secuestra compuestos tóxicos. Contienen proteínas que estabilizan y/o transportan nutrientes y hormonas a la célula. Suministra nutrientes para el metabolismo de la célula. Contiene inhibidores de proteasas. Contiene elementos traza ( Selenio..)
  78. 78. 2.4.-Medios de cultivo de células animales. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO:  BASALES Y BME :(medio basal de Eagle), muy usado en el cultivo de células de mamífero( especie humana, bovina, equina...)  Tiene concentraciones elevadas de los nutrientes más comunes.  Ideales para estimular la proliferación.  SUPLEMENTADOS CON NUTRIENTES INTERMEDIOS:  Para el crecimiento de células de mamíferos secundarios y de líneas celulares inmortales.  QUIMICAMENTE DEFINIDOS (medios sin suero):  Para que los científicos investiguen los procesos en cultivos celulares con el mínimo de influencias extrañas.  Fácil aislamiento y purificación de productos .
  79. 79. 2.- MATERIAS PRIMAS y MEDIOS DE CULTIVO.2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio.2.2.- Preparación del sustrato.2.3.- Medios de fermentación microbiana.2.4.- Medios de cultivo de células animales.2.5.- Medios de cultivo para el crecimiento de células vegetales.2.6.- Mantenimiento y esterilización.
  80. 80. 2.5.-Medios de cultivo de células vegetales.• COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE CÉLULAS VEGETALES: – Fuente de carbono orgánico. • El más común la sacarosa, también mono y disacáridos como glucosa, fructosa, maltosa y lactosa. – Fuente de nitrógeno. • Nitratos, a veces también sales amónicas. • Algunas células necesitan nitrógeno orgánico en aminoácidos ( positivo en las primeras etapas del crecimiento microbiano). – Sales orgánicas. – Reguladores del crecimiento. • Hormonas vegetales (auxinas, que inducen la división celular). • Citoquininas ( Regulación del crecimiento en plantas).
  81. 81. 2.- MATERIAS PRIMAS y MEDIOS DE CULTIVO.2.1.- Criterios utilizados en la formulación del medio.2.2.- Preparación del sustrato.2.3.- Medios de fermentación microbiana.2.4.- Medios de cultivo de células animales.2.5.- Medios de cultivo para el crecimiento de células vegetales.2.6.- Mantenimiento y esterilización.
  82. 82. 2.6.-Mantenimiento y esterilización. 1.- MANTENIMIENTO DE LOS MEDIOS . • El medio de almacenamiento y subcultivo de cepas industriales clave debe ser diseñado para: • Conserve las características necesarias que permitan la capacidad de producción particular. • Minimicen la variación genética. • ¿ POR QUÉ UTILIZAR MEDIOS DE MANTENIMIENTO? METABOLITOS CEPAS TÓXICOS EFECTOS DESESTABILIZANTES
  83. 83. 2.6.-Mantenimiento y esterilización.2.- ESTERILIZACIÓN DE CULTIVOS. OBJETIVOS:  Evitar el desarrollo de microorganismos patógenos.  Evitar el desarrollo de microorganismos alterantes.  Incrementar la reproducibilidad del proceso (rendimiento, pureza y tiempo de producción). MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN:  Calor húmedo (autoclave o chorro de vapor).  Calor seco  Radiación ( Rayos X ,UV)  Esterilización química con líquidos o gases.  Filtración (filtros de superficie o de profundidad).  Nuevos métodos ( altas presiones, campos eléctricos)
  84. 84. 2.6.-Mantenimiento y esterilización. ¿DONDE SE CONTROLA LA ESTERILIDAD?  Mantener la pureza del inóculo.  Esterilizar el medio de cultivo y los aditivos.  Esterilizar el material en contacto con el medio ( recipiente, fermentador, válvulas y conductos)  Esterilizar los gases entrantes y salientes.  Manterner las condiciones asépticas durante la manipulación.  Contrucción apropiada del biorreactor para su esterilización y para la prevención durante la fermentación.
  85. 85. 2.6.-Mantenimiento y esterilización.
  86. 86. 2.6.-Mantenimiento y esterilización. TIPOS DE ESTERILIZACIÓN. ESTERILIZACIÓN DISCONTINUA ESTERILIZACIÓN CONTINUAT 121ºC 20-30 segundos a 90-120 ºC 30-120 segundos a 140ºCTiempos de esterilización mayores(2-3h) 20-30 segundos refrigeraciónCalentamiento por inyección de vapor Calentamiento por inyección de vaporo intercambiadores de calor o intercambiadores de calorAlto consumo de energía. Formación de sales insolublesAlteración y destrucción de nutrientes. Tamaño de la partícula restringida a 1-2 mm
  87. 87. Cinética del crecimiento• 3.1-¿Qué entendemos por crecimiento?• 3.2-Conceptos básicos• 3.3-Formas de medición del crecimiento• 3.4-Crecimiento en cultivo intermitente• Fases del crecimiento• 3.5-Factores que afectan al crecimiento
  88. 88. 3.1-CrecimientoEl crecimiento se puede considerar como el aumentoordenado de todos los constituyentes químicos de un organismo.En organismos unicelulares el crecimiento conduce a un aumento en el número de células más que un aumento en el tamaño celular
  89. 89. 3.- CINETICA DELCRECIMIENTO DE LOSMICROORGANISMOS
  90. 90. 3.2-Conceptos básicosGeneración (n)Es el número de divisiones celulares que ocurren enun determinado tiempo en un cultivo microbianoVelocidad de crecimiento: ∆n vc = ∆tEs el cambio en el número de generaciones porunidad de tiempoTiempo de generaciónEs el tiempo requerido para que a partir de una célulase formen dos, o sea el tiempo requerido paraduplicar el número de células de una población
  91. 91. El crecimiento puede ser :-A nivel de individuos dentro de población CICLO CELULAR-Crecimiento de poblaciones celulares CICLO DE CRECIMIENTO Sª Cerrados Sª abiertos viableCélula microbiana no viable
  92. 92. Ciclo celular: fisión binaria Gemación, ej. levaduras
  93. 93. Crecimiento de poblacionesCrecimiento exponencial: es el tipo de crecimientode una población donde el número de célulasse duplica cada cierto tiempo
  94. 94. 3.3- Formas de medición del crecimiento microbiano3.3.1- Peso seco celular3.3.2- Absorción3.3.3- Peso húmedo3.3.4- Volumen3.3.5- Número de células3.3.6- Mediciones físicas
  95. 95. 3.3.1- Peso seco celular Consiste en dejar secar volúmenesconocidos de cultivo celular lentamente hastaque alcancen peso cte. Se mide en g/l En ocasiones para concentrar las célulasse usa el centrifugado o filtrado según ladificultad. Es el mas usado Desventaja: pueden dar grandes erroresen caso de absorción de humedad por lascélulas secas.
  96. 96. 3.3.2- AbsorciónConsiste en el uso de celdas espectrofotométricaspues las células desvían la luz q llega al detector yesa desviación está relacionada con el nº de célulaspresentes (o también puede relacionarse con ladensidad ) en la muestra según la Ley de Beer
  97. 97. 3.3.3- Peso húmedo Consiste en una centrifugacióno filtración seguida del pesado. Este proceso es extrarrápido, hay necesidadde estandarizar el proceso ya que se midetanto el agua intracelular como elextracelular ocasionando erroresconsiderables.
  98. 98. Recuento de viables - Filtración por membrana
  99. 99. 3.3.4- Volumen Consiste en la centrifugación entubos graduados de tal forma q mepermitan determinar el volumen decélulas empacadas. Es un método bastante inexactoespecialmente para pequeños cambios dela población celular
  100. 100. 3.3.5- Recuento de células por cámara de Petroff-HausserMuestra de cultivo diluído en cámara de volumen pequeño y conocido (2,5x10 -7 ml),recuento de células en numerosos cuadrados de la cámara. Promedio de célulascontenidas en dicho volumen se expresa por ml de muestra (alto error experimental).Desventaja: no se pueden distinguir células viable y no viables
  101. 101. 3.3.6- Mediciones físicas El crecimiento de células origina lageneración de calor la cual estárelacionada con la concentración debiomasa. Es un proceso rápido y nonecesita de muestreo. Se usa para el casode biorreactores , pues sino las variacionesde calor generado son pequeñas parapoder ser mediadas adecuadamente.
  102. 102. 3.4- Crecimiento en cultivo intermitente El cultivo intermitente representa elcrecimiento en un sistema cerrado. Cuando un medio se inocula concélulas, tiene lugar una secuencia deeventos llamado ciclo de crecimiento. Representaremos el peso seco celular(X) en g/l contra el período de incubación enhoras (h):
  103. 103. Crecimiento de unmicroorganismo en medio de cultivo líquido 1- Fase de latencia 2- Fase exponencial 3- Fase estacionaria 4- Fase de muerte
  104. 104. Fases de crecimiento•Fase lag - las células se adaptan al nuevo ambiente, aun nose dividen•Fase exponencial (log) velocidad máxima de crecimientobajo condiciones particulares, tiempo de generación mínimo•Fase estacionaria Ésta se caracteriza por ningúncrecimiento neto. De echo el crecimiento puede estarocurriendo, pero esta equilibrado por la rapidez de muerte olisis celular.•Fase de muerte - velocidad de muerte celular > velocidadde división celular
  105. 105. Cinética de crecimiento en cultivo intermitente El crecimiento microbiano unicelular esautocatalítico, es decir la vc es proporcional aX ya presente. De modo q durante el crecimexponencial, X aumenta como sigue: Xo 2Xo 4Xo 8Xo nXoEl intervalo de tiempo se llama tiempo deduplicación (td), de manera que n despuésdel tiempo t vale t/td y X vale Xo* 2 t/td
  106. 106. Representación aritmética yexponencial del crecimiento
  107. 107. 3.5- Factores que afectan a la rapidez de crecimientoLos factores que intervienen son: - concentración de substrato - temperatura - pH - actividad de agua - potencial redox,concentrac de oxigeno - radiación - presión hidrostática
  108. 108. Efecto de la temperatura Cada microorganismo tiene una temperatura decrecimiento adecuada Si consideramos la variación de la velocidad decrecimiento (µ) en función de la temperatura de cultivo,podemos observar una temperatura mínima por debajo de lacual no hay crecimiento (dX/dt = 0); a temperaturas mayoresse produce un incremento lineal de la velocidad decrecimiento con la temperatura de cultivo hasta que sealcanza la temperatura óptima a la que µ es máxima. Porencima de esta temperatura óptima, la velocidad decrecimiento decae bruscamente (µ → 0) y se produce lamuerte celular.
  109. 109. Tipos de microorganismos según la temperatura Tipode microorg T mínima T óptima T máxima Psicrófilo -5 +5 12 – 15 15 - 20 Psicrótrofo -5 +5 25 – 30 30 - 35 Mesófilo 5 – 15 30 – 45 35 - 47 Termófilo 40 – 45 55 – 75 60 - 90
  110. 110. Veloc de Gráfica Psicrófiloscrecimiento Mesófilos Termófilos 20 40 60 80 Temperatura (ºC)
  111. 111. Efecto del pH Es un parámetro crítico en el cultivo demicroorganismos ya que estos sólo puedencrecer en un rango estrecho de pH fuera delcual mueren rápidamente. El pH intracelulares ligeramente superior al del medio querodea las células ya que, en muchos casos, laobtención de energía metabólica depende dela existencia de una diferencia en laconcentración de protones a ambos lados dela membrana citoplásmica.
  112. 112. Aspectos sobre el pH•Cada tipo de microorganismo tiene unrango de pH en el que puede viviradecuadamente, fuera de este rangomuere.•Los rangos de pH tolerables pordiferentes tipos de microorganismos son,también, distintos.•El pH interno en la mayoria de losmicroorganismos está en el rango de 6.0a 7.0.
  113. 113. Actividad del aguaSe denomina actividad de agua a larelación entre la presión de vapor de aguadel substrato de cultivo (P) y la presión devapor de agua del agua pura (P0): P aw= P0
  114. 114. Efecto de la radiación Las radiaciones ultravioleta (uv), Rayos X yradiación γ producen efectos esterilizantes (destrucciónde microorganismos) al alterar las proteínas,membranas, ácidos nucleicos y al generar radicaleslibres del tipo OH• y H•. El procedimiento es similar aldescrito para el uso de altas temperaturas. Hay queconsiderar, sin embargo, los poderes de penetración delos diferentes tipos de radiación. Así, por ejemplo, laradiación uv tiene un poder de penetración muy bajo y,por consiguiente, se utiliza para esterilizar superficies,mientras que la radiación X o la γ tiene poderes depenetración mucho mayores.
  115. 115. Presión hidrostática Las altas presiones inhiben el crecimiento de losmicroorganismos La razón por la que las altas presiones inhiben elcrecimiento no está clara, aunque se ha visto que sedetiene la síntesis de proteínas y los procesoscatabólicos. El efecto de la presión sobre el crecimiento de losmicroorganismos tiene importancia en el desarrollo desistemas de eliminación de microorganismos enalimentos y en la consideración de los microorganismosque participan en procesos en los que aumenta lapresión.
  116. 116. Potencial redox: Concentración de oxígeno Este es otro factor determinante delcrecimiento y del metabolismo del cultivo. Elpotencial redox del medio de cultivo nos indica sucapacidad para aceptar o donar electrones, esto es:sus características oxidantes o reductoras. Uno delos factores que intervienen en el potencial redox,aunque no el único, es la concentración de oxígeno[O2].Hay microorganismos que requieren ambientesoxidantes para crecer, mientras que otros necesitanambientes reductores.
  117. 117. Continuación En general, cuando un microorganismo requiereun ambiente oxidante se dice que desarrolla unmetabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que losmicroorganismos que requieren ambientes reductores (omenos oxidantes) realizan un metabolismo fermentativo. Un microorganismo es aerobio cuando necesitaoxígeno para vivir y es anaerobio cuando o bien no lonecesita o bien cuando muere en presencia de oxígeno(anaerobios estrictos como los clostridios). Por otra parte, hay microorganismos que puedendesarrollar ambos tipos de metabolismo
  118. 118. 4. Sistemas de Fermentación
  119. 119. Sistemas de Fermentación• Son formas diferentes de cultivo de microorganismos con el fin de obtener un rendimiento deseado• La velocidad o la calidad del producto son los objetivos del estudio de la cinética del crecimiento
  120. 120. Factores que Influyen en el Crecimiento• Son comunes para todos los sistemas: – Concentración de substrato – Temperatura – pH – Concentración alta de substrato o de producto
  121. 121. Consumo de Nutrientes y Formación de Producto• Relacionamos el consumo de substrato y la formación de producto con el crecimiento de material para cada uno• Las concentraciones iniciales de substrato o producto, pueden condicionan la rapidez del crecimiento
  122. 122. Consumo de Nutrientes y Formación de Producto• Para el Crecimiento – Acumulación total = crecimiento – desaparición• Para el consumo de Substrato – Acumulación de substrato = alimentación de substrato – crecimiento – formación de producto – requerimientos para el mantenimiento• Para la formación de producto – Acumulación de producto = formación - destrucción
  123. 123. Rendimientos de Biomasa y Producto• Muestran en cada caso la cantidad de biomasa o producto producido dependiendo de la cantidad de substrato• Se definen como la cantidad de biomasa o producto formado por unidad de substrato
  124. 124. Sistemas Discontinuos• Se considera un sistema cerrado, para todo menos para la aireación• Tiene una cantidad limitada de medio• Se añade todo el substrato al principio de la fermentación
  125. 125. Cinética de un Sistema Discontinuo• La concentración de biomasa por unidad de tiempo es: x – XR = γ (SR – s) x = concentración celular en un tiempo t XR = inóculo o concentración celular inicial γ = rendimiento para el substrato limitante (g de biomasa por g de substrato consumido) s = concentración de substrato en el tiempo t SR = concentración inicial de medio
  126. 126. Sistema Discontinuo• Ciclo de Fermentación discontinuo
  127. 127. Sistemas Discontinuos Alimentados a Intervalos• El substrato se va añadiendo a intervalos durante el proceso• Es una variación del sistema discontinuo• Tiene ventajas con respecto al sistema discontinuo convencional. Evita procesos de represión y reduce la viscosidad del medio• Inconvenientes: el crecimiento eficiente tiene lugar durante una pequeña fase del proceso
  128. 128. Sistemas Continuos• Sistemas abiertos, en los que el medio se va añadiendo de un modo continuo a reactor• Se va eliminando medio fermentado del “centro” de la fermentación• Podemos distinguir dos modalidades: – Quimiostato – Turbidostato
  129. 129. Sistemas Continuos• Es básico controlar que el volumen de biorreactor sea constante• Existen diferentes formas de conseguir esto, puede ser mediante un tubo de sobreflujo, o mediante el mantenimiento de la velocidad de bombeo igual a la rapidez de flujo de entrada de medio
  130. 130. Sistemas Continuos• La concentración de biomasa viene dada por: Ks·D x’ = γ SR - μmax - D X’ = concentración de biomasa en un estado estacionario γ = rendimiento para el substrato limitante (g de biomasa por g de substrato consumido) Ks = constante inicial SR = concentración inicial de medio D = velocidad específica de crecimiento μmax = velocidad máxima de crecimiento
  131. 131. Quimiostato• Suministramos nutriente esencial limitante a medida que va siendo necesario.• Se va eliminando biomasa para formarse biomasa nueva.• La densidad y rapidez de crecimiento se mantiene constante, debido a que la cantidad de substrato y de producto también se mantienen constantes.
  132. 132. Quimiostato• Esquema del fermentador
  133. 133. Quimiostato• La rapidez de crecimiento depende del tipo de nutriente limitante – Carbono – Nitrógeno – Fósforo – Vitamina• Los demás nutrientes esenciales están presentes en exceso.
  134. 134. Turbidostato• El producto no se saca del reactor• Tenemos un circuito de reflujo, que acoge el producto cuando hay exceso, de ese modo se mantiene constante la velocidad• La cantidad de producto que hay en el reflujo, determina la cantidad de medio que se añade al biorreactor
  135. 135. Turbidostato• Esquema del turbidostato
  136. 136. Síntesis de Metabolitos Secundarios• Existen productos cuya síntesis no está relacionada con el crecimiento, estos se denominan METABOLITOS SECUNDARIOS• No se puede relacionar su formación con el crecimiento porque no existe relación.• Los mas famosos son los Antibioticos
  137. 137. En cuanto al biorreactor:Para cada proceso biotecnológico, elsistema de contención más apropiado debediseñarse para brindar el mejor medioambiente, optimizado para el crecimientocelular y actividad metabólica.
  138. 138. Equipos accesorios. •Manómetros •Válvulas de control •Tuberías •Control de temperatura •Control de pH •Control de espumas •Válvulas de seguridad •Puntos de muestreo
  139. 139. El medio ambiente puede considerarse entres aspectos: •BIOLOGICO •QUIMICO •FISICO
  140. 140. AIREACION Y AGITACION.La agitación es necesaria para:1- incrementar la velocidad detransferencia de oxígeno desde lasburbujas de aire al medio líquido; losmicroorganismos no pueden utilizaroxígeno gaseoso, sino solamente el que seencuentra en disolución.
  141. 141. 2- aumentar la velocidad detransferencia de oxígeno y nutrientesdesde el medio a las células. Debido almovimiento se evita que las célulascreen áreas estancadas con bajos nivelesde oxígeno y nutrientes.3- impedir la formación de agregadoscelulares.4- aumentar la velocidad detransferencia de productos metabólicosde las células al medio.
  142. 142. 5- aumentar la tasa o la eficiencia de latransferencia de calor entre el medio ylas superficies de refrigeración delfermentador.
  143. 143. Tipos de fermentador:•Crecimiento en suspensión. •Crecimiento con soporte.
  144. 144. En el crecimiento en suspensión, los organismosestán sumergidos y dispersados en el medionutritivo y su movimiento sigue al del medio.En los sistemas con soporte,los organismoscrecen como una monocapa o película sobre unasuperficie en contacto con un medio nutritivo. En la práctica, sin embargo, los sistemas en suspensión poseen una película de organismos en la superficie del contenedor y en sistemas con soporte, encontramos organismos dispersos en el medio nutritivo.
  145. 145. TECNOLOGIA DE BIOPROCESOS - FERMENTACION
  146. 146. Las etapas en la manufactura de productosen la tecnología de bioprocesos son,esencialmente, similaresindependientemente del organismoutilizado, del medio elegido y del productobuscado.
  147. 147. En todos los ejemplos, se cultiva gran númerode células en condiciones controladas.Los organismos deben cultivarse y“motivarse” para formar el producto deseado,mediante un sistema de contención técnica yfísica (el biorreactor) y un medio correcto ensu composición y parámetros reguladores delcrecimiento, tales como temperatura yaireación.
  148. 148. PRINCIPIOS DE CRECIMIENTO MICROBIANO
  149. 149. El crecimiento de microorganismospuede verse como el incremento en elmaterial celular, expresado en términosde masa o número de células.El incremento en biomasa puededeterminarse gravimétricamente onuméricamente para sistemasunicelulares.
  150. 150. Tiempo de duplicación:Se refiere al tiempo requerido paraduplicar el peso de la biomasa. Tiempo de generación: Se refiere al tiempo necesario para duplicar el número de células.
  151. 151. En un proceso biotecnológico, existen tres formasde hacer crecer a los microorganismos en unbiorreactor:-Por lotes (batch)-Semi-continuo-Continuo
  152. 152. Modos de operación de losfermentadores: •Operación por lotes: El reactor se carga con la especie reactiva y, a medida que procede la reacción, cambian las condiciones en el reactor al consumirse los reactivos y formarse los productos. Cuando se ha alcanzado el nivel deseado de reacción, se vacía el reactor, se limpia y el proceso se repite. Son procesos que no se encuentran en estado estacionario.
  153. 153. El ambiente nutricional dentro delbiorreactor cambia en forma continua y,por lo tanto, fuerza cambios en elmetabolismo celular.Eventualmente, la multiplicación celularcesa por desaparición o limitación denutrientes y acumulación de productostóxicos de excreción.
  154. 154. La naturaleza compleja del crecimientode microorganismos por lotes, se muestratal como sigue:
  155. 155. La fase 1 o “log”, es un tiempo de aparente nocrecimiento, pero estudios bioquímicosdemuestran actividad metabólica, indicandoque las células están en proceso de adaptacióna las condiciones ambientales y que un nuevocrecimiento comenzará, eventualmente.
  156. 156. Existe, luego, una fase de aceleracióntransitoria cuando el inóculo comienza acrecer que es seguida, rápidamente, poruna fase de crecimiento exponencial.En la fase exponencial, el crecimientomicrobiano ocurre a la máxima velocidadposible para ese microorganismo, connutrientes en exceso, parámetros decrecimiento ideales y ausencia deinhibidores.
  157. 157. Sin embargo, en cultivos por lote, elcrecimiento exponencial es de duraciónlimitada y, a medida que las condicionesnutricionales cambian, la velocidad decrecimiento disminuye y se entra en la fasede deceleración, seguida de la faseestacionaria, donde el crecimiento globalno se obtiene, por falta de nutrientes.
  158. 158. La fase final del ciclo es la fase de muerte,cuando la velocidad de crecimiento hacesado.La mayoría de los procesos biotecnológicospor lotes se detiene antes de esta fase,debido a la disminución en el metabolismo ya la lisis celular.
  159. 159. Algunos medios para prolongar la vida de uncultivo por lotes:-Adición gradual de componentes nutritivosconcentrados (carbohidratos), aumentando elvolumen del cultivo (utilizado para producciónindustrial de levadura).-Adición de medio al cultivo (perfusión) yextracción de un volumen igual de medio usado,libre de células (utilizado para cultivos decélulas animales).
  160. 160. •Operación continua: Existe un flujocontinuo de reactivos frescos hacia elreactor y el producto fluye continuamentehacia fuera. En algunos sistemascontinuos el medio nutriente es inoculadocon el cultivo microbiano al entrar alreactor y los organismos llevan a cabo suactividad a medida que el líquido fluye através del sistema y salen del sistemajunto con el medio.
  161. 161. Los organismos pueden separarse de lacorriente que lleva al producto y reciclarsepara inocular el líquido de alimentación.En un sistema continuo con mezclacompleta, las condiciones son uniformes entodo el reactor, en un equilibrio de mezclade nutrientes, organismos y productos.La alimentación del sistema es medionutriente libre de organismos y, en algunoscasos, un inóculo de organismos reciclados.
  162. 162. Esta práctica de cultivo continuo, proveeun crecimiento casi balanceado, conpequeña fluctuación de nutrientes,metabolitos, número celular o biomasa.Esto consiste en medio fresco entrando unsistema por lotes, en fase de crecimientoexponencial, con una remocióncorrespondiente de medio más células.
  163. 163. Este método de cultivo continuo, permite alos organismos crecer en condiciones deestado estacionario, en las que elcrecimiento ocurre a una velocidadconstante y en un medio ambienteconstante.
  164. 164. En un sistema de cultivo perfectamentemezclado, se pasa medio estéril albiorreactor, a un flujo constante y unamezcla de cultivo (medio, productos dedesecho y organismos) emergen delmismo a la misma velocidad,manteniendo el volumen total del cultivo,dentro del biorreactor, constante.
  165. 165. Ventajas de un proceso por lotes:Las principales son: menor riesgo decontaminación, flexibilidad operacionalcuando los fermentadores se utilizan paradistintos productos, un control máscercano de la estabilidad genética delorganismo, una mejor coordinación conestadios del proceso entre lotes previos yposteriores.
  166. 166. Desventajas del proceso por lotes:La principal es la alta proporción de tiempoimproductivo en la operación del fermentador,dificultad de diseño y la operación de procesosque no están en estado estacionario y lavariabilidad entre lotes.
  167. 167. Los fermentadores deben ser vaciados,limpiados, esterilizados y recargadosantes de cada fermentación, operacionestodas esenciales pero no productivas.En procesos por lotes, estas operacionespueden tomar tanto tiempo como lafermentación misma.En un proceso continuo, por el contrario,una corrida puede durar semanas omeses, es decir que el tiempo noproductivo es, en proporción, pequeño.
  168. 168. Esterilización:•Esterilización de fermentadores. •En el laboratorio, el método estándar de esterilización es el calor: 120ºC de calor húmedo durante 15 min o 160ºC de calor seco durante, al menos, 1 hora. A escala industrial, el calor seco es prohibitivamente caro, salvo en casos muy especiales y se utiliza, habitualmente, la esterilización por calor húmedo.
  169. 169. •Esterilización del fermentador y el medioconjuntamente. •El calentamiento se consigue mediante: •Inyección de vapor en el medio, por lo que el medio se prepara ligeramente más concentrado para compensar la dilución por el vapor condensado. •El medio se calienta por conducción, haciendo pasar vapor por la camisa de termostatización.
  170. 170. •Esterilización por separado del fermentadory el medio. •Este sistema ofrece ventajas ya que reduce el tiempo en el que el recipiente de fermentación es improductivo: un fermentador vacío se esteriliza con relativa rapidez.
  171. 171. Pasos a tener en cuenta:-Cambio de escala-Diseño de medios para procesos defermentación-Fermentación en sustratos sólidos-Tecnología de cultivos de células deplantas y animales-Procesamiento posterior de la muestra
  172. 172. Procesamiento posterior de la muestra. Purificación.
  173. 173. El diseño y la operación eficiente de losprocesos de purificación, son elementosvitales para obtener los productosdeseados para uso comercial.Deberían reflejar la necesidad de no perdermás que lo absolutamente necesario delproducto final.
  174. 174. Este procesamiento final involucrará,principalmente, la separación inicial de lamezcla de cultivo hacia una fase líquida yuna sólida, con la subsecuenteconcentración y purificación del productodeseado.
  175. 175. El procesamiento involucrará más de una etapa:-Destilación-Centrifugación-Filtración-Ultrafiltración-Extracción con solventes-Adsorción-Tamices moleculares-Electroforesis-Cromatografía de afinidad-Liofilización
  176. 176. GRACIAS
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