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Genoma Humano Filiacion1
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Genoma Humano Filiacion1

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  • 1. Marcadores Genéticos y Pruebas de Filiación
  • 2.
    • Cuáles fueron los hallazgos en el proyecto genoma humano ?
    • 99.8% de identidad entre individuos
    • ~ 1% de diferencia con el genoma del chimpancé
    • 3% del DNA es codificante
    • ~ 30-35.000 genes
    • ~ 3 billones de pares de bases ( 3 X 10 9 bases )
    EL GENOMA HUMANO
  • 3. ADN PRESENTE EN EL GENOMA HUMANO DNA EXPRESIVO 30% DNA NO CODIFICANTE 70% Secuencias repetidas en tándem 10% SINEs: Alu LINEs: L1 Minisatélites Microsatélites Satélites: Clásicos Alfoides Secuencias dispersas 15 - 20% ADN REPETITIVO 20 – 30%
  • 4. CUÁL ES EL APORTE DEL PROYECTO GENOMA HUMANO (1990-2003) ?
    • Conocimiento total de la secuencia de las moléculas de DNA presentes en el genoma humano
    • Comprensión de la función de la gran mayoría de nuestros genes, cuya utilidad desconocemos
    • Posibilidad de pronosticar enfermedades
    • Diagnóstico temprano de las patologías y eventualmente su corrección y posibilidad de curar enfermedades
  • 5.
    • El ADN varía de individuo a individuo?
      • Individuos no emparentados: una vez cada 10 3 pb.
      • Principalmente en el ADN no codificante.
      • ADN no codificante es aprox. el 70% del genoma.
      • Presentes en el 1% de población: Polimorfismos.
      • De éstos polimorfismos surge lo que se conoce como marcadores genéticos .
  • 6.
    • ¿ Qué son marcadores genéticos?
    • Segmentos de ADN con una localización física identificable y reproducible que pueden ser fácilmente rastreados y usados para construir un mapa cromosómico.
    • Aplicación en mapeo genético , y en la elucidación de patrones humanos demográficos ancestrales.
    • Estudios en evolución: divergencia de especies, de poblaciones etc.
  • 7.
    • Los polimorfismos de regiones codificantes también son importantes y útiles
        • Por su relación con enfermedades y desordenes genéticos.
        • Causan alteraciones funcionales proteína
        • Consecuencia: cambios fenotípicos evidenciables y rastreables.
    • Cómo se generan los polimorfismos?
    • Mutación, Secuencias repetidas, Diferencias en un nucleótido (SNPs), Inserción, Deleción, Recombinación.
  • 8.
    • Evolucionan por mecanismos de larga escala como intercambio desigual.
    • Igual que los microsatélites, evolucionan por unidad de repetición.
    • También se conocen como VNTRs  v ariable n ucleotide t andem r epeat s.
    • Se encuentran dentro o entre genes .
    • Las unidades de repetición son pequeñas: 50 > 200 pb.
    MINISATÉLITES
  • 9.
    • EL número de copias en tandem de cada secuencia varia en cada individuo
    • Esta variación se genera durante la recombinación genética cuando las unidades de repetición no se alinean bien.
    • Altas tasa de intercambio genético  sitios frecuentes durante la recombinación.
    • Se utilizan como marcadores y son la base de la huella genética o fingerprinting.
    … MINISATÉLITES
  • 10. … MINISATELITES EJEMPLO Combinaciones de genotipos en seis individuos, para tres alelos VNTR, llamados A, B, C : AA, BB, CC, AB, AC, BC
  • 11. MICROSATELITES
  • 12. MICROSATELITES
    • STRs  S ingel T andem S equence R epeat s
    • Secuencias cortas y repetitivas de ADN (1 a 8 pb).
    • Regiones no codificantes del genoma.
    • La diferencia en la cantidad de repeticiones en determinados alelos para diferentes individuos, constituye la herramienta más importante de identificación forense y diagnóstico ofrecida por los micro-satélites
  • 13. MICROSATELITES
    • Los polimorfismos de LONGITUD son los
    • más comunes en el ADN repetitivo, y
    • pueden ser:
    • * Inserción : uno o más nucleótidos.
    • * Deleción : uno o más nucleótidos.
    • Usualmente la inserción y la deleción ocurren según el número de nucleótidos de la repetición, es decir por unidad de repetición .
  • 14. MICROSATELITES
    • SIMPLES ->
    • * Repeticiones contiguas e idénticas
    • * Unidad repetitiva dinucleótica, flanqueda por una secuencia de nucleótidos diferente a la repetición.
    • TCG ATATATATAT CAG
    • COMPUESTOS ->
    • * Repeticiones contiguas diferentes, de baja heterogocidad, flanquedas por secuencias distintas a la repetición.
    • TCG AAA ATA AAA ATA CAG
    • COMPLEJOS ->
    • Repeticiones de longitud y secuencia variable, con una alta tasa de mutación.
    • TCG AAA GTAG AAA GTAG TCTC
  • 15. MICROSATELITES
    • Los diferentes alelos se generan por el número de repeticiones ->
  • 16. SECUENCIAS DISPERSAS
    • ADN moderadamente repetitivo
    • Hay dos familias: LINES ( L ong i nterspersed n ucleotide e lement s) y SINES ( S hort i nterspersed n ucleotide e lement s)
    • Representados en humanos por los elementos L1 y Alu respectivamente.
    • Se considera que son elementos retrotransponibles : pueden replicarse vía una copia de ARN reinsertada como ADN mediante transcripción reversa.
    • Papel en función genómica y en evolución.
    • Posiblemente tiene un origen proviral , especialmente los LINES: retrovirus insertado en el genoma que quedó inactivo.
  • 17. Pruebas de Filiación
  • 18. Qué son las pruebas de filiación y para qué sirven ?
    • Serie de pruebas biológicas destinadas a realizar la identificación de uno de los progenitores, partiendo del estudio del otro y del hijo cuestionado, abuelos, presuntos tíos, identificación materna, presuntos hermanos paternos biológicos.
            • Establecer relaciones familiares y paternidad en casos de delitos como la violación, el aborto, el cambio de bebe en los Hospitales, el secuestro y la identificación de restos humanos entre otros.
  • 19. Tarjetas FTA
    • Matriz cargada positivamente
    • No hay cuantificación.
  • 20. Área de extracción Calidad y aseguramiento Cabina de flujo laminar Pipetas debidamente calibradas y uso de puntas anti-aerosol Trabajo en parejas Equipo de protección
  • 21. DNA cadena templado Forward primer Reverse primer Amplificación con sets de primers específicos en multiplex P C R Cómo se detectan las Short Tandem Repeats (STRs) – microsatélites ? 7 repeats 8 repeats AATG
  • 22. 170 bp 195 bp Diferentes sets de primers generan difentes productos de PCR TCAT repeat unit
  • 23. Cuáles son las características de la PCR multiplex para microsatélites ?
    • Amplifica hasta 16 marcadores a la vez
    • Niveles de sensibilidad > 1 ng of DNA
    • Diferentes Fluorescencias Usadas para distinguir STR with rangos de tamaños que se sobrelapen.
  • 24. ABI Prism 3100 Equipo analizador genético Electroforesis de capilar Set de 16 capilares
  • 25. Corrido electroforético capilar, en acrilamida, Determinación de perfiles Análisis de bandas por tamaños y fluorescencia Cómo lee los amplificados en el equipo 3100 ?
  • 26. Electroforogramas Con ladder
  • 27. Power Plex 16 Genotipificación (mujer)
  • 28. 3 sistemas genéticos, uno exclusión Genotipificación (trio)
  • 29. Presunto padre: 11, 12 Madre: 13, 14 Hijo: 12, 13 Cómo se determinan los AOPs ? AOP = 12 Comparando los alelos del hijo con los de la madre, se establece el alelo heredado de la madre y por descarte el paterno
  • 30. DIVERSIDAD POBLACIONAL Por qué se requiere de cálculos estadísticos ? Cada grupo tiene diferente frecuencia de sus alelos
  • 31. Población de Referencia Muestreo poblacional 13 Loci STR La frecuencia de los alelos de un sistema son típicas para cada población
  • 32. STRs Frecuencias alélicas HUM-TH01 * Proc. Int. Sym. Hum. ID (Promega) 1997, p. 34 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 6 7 8 9 9.3 10 Pob. Caucasica Pob. negra Pob. Hispanicas Alelos: # de repeticiones Frequencias
  • 33. ADN Que tan probable es que sea el padre una vez se ha demostrado que posee todos los AOPs. En qué consiste el Cotejo de paternidad ? Contrastar los resultados obtenidos con dos hipótesis
  • 34. CALCULOS PROBABILISTICOS SI HAY NO EXCLUSION SE REALIZAN
    • La primera hipótesis: X
    • Es que ese trio o ese caso sea verdadero.
    • La segunda Hipótesis: Y
    • Asumimos que el padre puede haber sido otro individuo dentro de la población que tenga el mismo alelo obligado paterno, del individuo que estamos analizando.
  • 35. Cómo encontramos el X ?
    • Asumimos un cruce mendeliano:
    • PP MADRE HIJO
    • D8 10,11 13,13 11,13
    • Posibles Hijos de esta pareja: 10, 13 11, 13
    • 10, 13 11, 13
    1 3 10 13 11 10,13 11,13
  • 36. Cómo la encontramos Y ?
    • PP MADRE HIJO AOP
    • D8 10,11 13,13 11,13 11
    • Y = 1(frecuencia del AOP, dentro de la población).
  • 37. INDICE DE PATERNIDAD
    • Indice de paternidad IP = X / Y
    • Probabilidad de paternidad W = X/(X+Y)
    • X: probabilidad de que el presunto padre sea el padre del menor en cuestión
    • Y: Probabilidad de que el presunto padre sea cualquier individuo tomado al azar en la población
  • 38. Cómo se informan los resultados ?
    • NO EXCLUSION
    • Se observa que PP posee todos los alelos obligados paternos (AOP) que debería tener el padre biológico de la menor H. Se calculó entonces la probabilidad que tiene de ser el padre biológico comparado con otro individuo tomado al azar en la población de la región Andina de Colombia.
    • CONCLUSIÓN : PP no se excluye como el padre biológico de la menor YYYYYYY. Probabilidad de Paternidad: 99.99999%. Es 26658202,74 veces más probable que XXXXX sea el padre biológico de la menor H a que no lo sea.
    • EXCLUSION
    • Se observa que PP no posee todos los alelos obligados paternos (AOP) que debería tener el padre biológico de la menor H en DOCE (12) de los sistemas genéticos analizados: D21S11, HUMCSF1P0, D3S1358, HUMTH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, HUMVWA31, D18S51, D5S818 y HUMFGA .
    •   CONCLUSIÓN: PP queda excluido de la paternidad de la menor H.
  • 39. Casos simples: PP, M, H ó Presunto Padre fallecido - ADN extraído de sus restos óseos . Cuáles son los casos que normalmente se procesan para pruebas de filiación ?
  • 40. Determinar todo los posibles genotipo de un hijo de esta pareja de presuntos abuelos paternos Posibles hijos Caso complejo : PP no disponible. Presuntos Abuelos Paternos, Madre, Hijo
  • 41. Deducir el perfil genético del presunto padre con los AOPs de los hijos reconocidos. Perfil genético del PP Caso complejo : PP no disponible. Disponibles los hijos reconocidos del PP, Madre, Hijo
  • 42. Cálculo de un índice de paternidad comparando únicamente la frecuencia de los alelos compartidos padre-hijo. Resultados PRUEBA DE Paternidad DNA TEST Caso complejo : Ausencia de uno de los progenitores. Índice de paternidad o maternidad
  • 43. Caracteristicas deseables de los STRS en la identificación Forense
  • 44. CASO Planteamiento del Problema: Establecer la filiación entre una hija demandante con un presunto padre, se cuenta con madre biológica.
  • 45. RESULTADOS STR’s AUTOSÓMICOS H AOP
  • 46. PROBABILIDAD DE PATERNIDAD
  • 47. CONCLUSIÓN Con los resultados obtenidos del análisis de los STR’s autosómicos no es posible excluir al presunto padre ( PP ) de ser el padre biológico de la hija H. IP acumulado es de : 127. 545,0257 W(Po:0.5) = 99.9992 % IP: Indice de Paternidad W: Probabilidad de Paternidad
  • 48. Probabilidad de Paternidad - PW
    • SI HAY NO EXCLUSIÓN: la PW debe llegar a 99.99%, (considerando el valor de creencia a priori de paternidad 0.5)
    • SI HAY EXCLUSIÓN: Mínimo tres exclusiones, siempre se repiten el proceso desde la extracción de ADN. No hay necesidad de hacer cálculos de IP y/o PW.
  • 49. RELACIÓN DE IP Y W
    • Un IP de 1000, implica una probabilidad de 99,9%, un IP de 10000, implica un W de 99,99%.
  • 50. EN GENERAL EL GRAN RETO DE LA PRUEBA EN GENÉTICA FORENSE ES LA CORRECTA VALORACIÓN DE LA PRUEBA, SU CORRECTA COMUNICACIÓN A LOS TRIBUNALES Y EL CORRRECTO ENTENDIMIENTO POR ESTOS DEL SIGNIFICADO DE LA PROBABILIDAD Angel Carracedo
  • 51. Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs )
  • 52. Single Nucleotide Polymorphisms (SNP )
    • Definición : Los SNP o polimorfismos de un solo nucleótido.
    • Este cambio puntual en una base del ADN puede presentarse por: Sustitución, inserción o deleción.
    International HapMap Project
    • Una de estas variaciones debe darse al menos en un 1% de la población para ser considerada como un SNP.
    • Se estima que existen 5 millones de SNPs reportados y 4 millones validados a lo largo del genoma (Sobrino et al ., 2005).
  • 53.
    • Los SNP son muy abundantes en el genoma humano y son la base de la individualidad genética.
    • Presentan un mayor potencial que los STRs para el desarrollo de sistemas múltiplex.
    • Su análisis permite aumentar el poder de discriminación.
    • Son muy convenientes para el análisis en equipos y plataformas de alta tecnología.
    • No presentan el fenómeno de bandas “ stutters ”, por lo que permite discriminar mas fácilmente si una muestra es de origen único o proviene de una mezcla.
    Cuáles son las Características de los SNPs?
  • 54. Dónde se localizan los SNP?
    • SNP cromosoma Y
    • SNP autosómicos
    • SNP ADN mitocondrial región codificante y región control
    Genoma Humano
  • 55. Para qué sirven de los SNPs?
    • Genética Medica: Diagnóstico de enfermedades y respuesta farmacológica para tratamiento con medicamentos - cáncer, la artritis, Alzheimer , diabetes, las enfermedades autoinmunes o las cardiovasculares.
    • Alzheimer : gen para la apolipoproteína E (ApoE).
    • Contiene dos SNPs que resultan en tres posibles alelos que son: E2, E3, y E4.
    • Cada alelo difiere por una base y el producto de cada alelo difiere por un aminoácido.
    • Cada individuo hereda un alelo de ApoE de la madre y otro del padre.
    • Individuos que heredan al menos un alelo E4 tienen una alta probabilidad de padecer la enfermedad.
  • 56. Aplicaciones de los SNPs
    • Genética Forense: Análisis de SNPs de cromosoma Y (Ej. mezclas en casos de delitos sexuales), SNPs de ADN Mt (útil en muestras degradadas como restos óseos antiguos, pelo sin bulbo, muestras con escaso DNA, alto numero de copias de ADNmt por célula). SNPs Autosómicos pruebas de paternidad o identificación humana.
    • Genética de Poblaciones: Las mutaciones son grabadas en la molécula y transferidas de generación en generación como una huella genética en la historia de la evolución.
    • Haplotipo de ADNmt: Secuencia de marcadores o alelos en un mismo cromosoma.
    • Haplogrupo de ADNmt: Grupo de haplotipos que tienen un mismo motivo ( motif) y comparten un ancestro común.
  • 57. Por qué es importante el ADN Mitocondrial en identificación humana? HV I HV II Es una molécula circular Posee 16.569pb. Se localiza dentro de la matriz de la doble membrana de la mitocondria. Región Control (No codificante) Región Codificante 16024-16365 73-340
  • 58.
    • La Región Control es responsable de la regulación de la replicación y transcripción.
    • La región codificante es donde se encuentran todos sus genes y mide 15.447pb.
    Por qué es importante el ADN Mitocondrial en identificación humana? No recombinación Usualmente varían entre el 1-2% de las secuencias de ADN mitocondrial de individuos no relacionados en esa región hipervariable Transmite línea materna Alto número de copias por célula: 250-1000 Alta tasa de mutación:5-10 veces mayor que el ADN nuclear
  • 59. Por qué es importante el ADN Mitocondrial en identificación humana?
    • Investigación biológica de la maternidad
    • Criminalística: el rendimiento del estudio de ADN mitocondrial frente al nuclear en el caso de muestras difíciles es manifiestamente superior debido a su mayor cantidad y a la más elevada posibilidad de que alguna copia esté conservada.
    • Identificación de restos humanos y razas
    • Los SNPs son detectados comparando la secuencia de la Región Control que interesa con la Secuencia de Referencia de Anderson (1981)
  • 60. SNPs de ADN Mitocondrial Amplificación y Secuenciación directa de los fragmentos de interés
  • 61. ADN mitocondrial: Interpretación y valoración de resultados
  • 62. ADN mitocondrial: Interpretación y valoración de resultados - Heteroplasmia: El ADNmt se hereda exclusivamente por vía materna, en un individuo cabe esperar un único tipo de ADNmt, sin embargo esto no es así siempre y por el contrario a lo que cabría esperar podemos encontrar individuos en los que coexisten más de un tipo de ADNmt. A este fenómeno lo denominamos heteroplasmia La teoría de bottleneck o cuello de botella
  • 63. La teoría de bottleneck o cuello de botella Un número de genomas de ADNmt se reduce a un número relativamente pequeño durante un paso de la oogénesis. Este subgrupo de la población de moléculas de ADNmt es trasmitida por el proceso de bottleneck, y esta población fundadora se replicará hasta producir aproximadamente 100.000 copias de ADNmt en el óvulo maduro. Este subgrupo, podría por tanto, contener una población homogénea de moléculas de ADNmt o una población heterogénea de genomas mitocondriales. La mezcla transmitida puede manifestarse presentando diferentes proporciones entre las distintas poblaciones de genomas mitocondriales para distintos descendientes y/o a lo largo de diferentes genes
  • 64. La secuencia de una muestra problema es inequívocamente diferente de una muestra de referencia, es decir, al menos se presentan dos puntos de discrepancia diferentes, en este caso podemos excluir que el cabello proceda del sospechoso. Ambas muestras presentan numerosas discrepancias con respecto a la secuencia de Anderson, concretamente 6 para MD y otras 6 discrepancias para MR, a su vez entre las muestras MD y MR existen 8 puntos discrepantes entre ambas muestras.
  • 65. La muestra dubitada, pelo (MD), como nuestra muestra de referencia, sangre del sospechoso (MR), presentan los mismo puntos de discrepancia con respecto la secuencia de Anderson y por tanto coinciden entre si nucleótido a nucleótido. En este caso no podemos excluir que dicho pelo pueda proceder del sospechoso. Será obligatorio en este caso de coincidencia evaluar el peso de dicha coincidencia.
  • 66. Métodos para el Análisis de SNPs
    • Pirosecuenciación
    • Plataforma LightCycler (Roche).
    • Sistema Microarray DNA microarrays
    • D-HPLC , Espectrofotometría MALDI-TOF.
    • Genotipificación TaqMan (Applied Biosystems)
    • Análisis de Curvas Melting usando DASH.
    • Detección de Productos de extensión de Primer basada en Electroforesis tales como: SNaPshot.
  • 67. Primer Extension Analysis: SNaPshot kit
    • 1. Se basa en el uso de primers específicos (sin marcar) adyancentes a la base a determinar.
    Análisis de SNPs SNP Molde Primer Figura 1. Diseño de Primer para SNaPshot .
  • 68. Primer Extension Analysis: SNaPshot kit
    • 2. Se realiza una reacción de PCR sólo con los 4 dideoxinucleótidos (ddNTP) marcados cada uno con un fluorocromo diferente sobre el molde de DNA previamente amplificado y purificado (pueden ser uno o varios los moldes a analizar en una sola reacción de SNaPshot)
    DNA MOLDE PURIFICADO Figura 2 . Reacción de Primer Extensión (Kit SNaPshot ).
  • 69.  
  • 70. Primer Extension Analysis: SNaPshot kit
    • 3. La detección de la base incorporada revela la presencia/ausencia de polimorfismo y el genotipo.
    Color=Genotipo Azul: G Rojo: T Verde: A Negro: C
  • 71.