Diagnóstico Molecular das Viroses Respiratórias

Diagnóstico molecular das viroses respiratórias Vlademir V. Cantarelli, PhD Weinmann Laboratório LTDA Centro Universitário Feevale 16/06/2009 - 17:30 - 18:30 sala Brochier

Infecções do TR

Principais causas de morbidade e mortalidade no mundo

Segunda causa principal de morte entre crianças menores de 5 anos (OMS)

problema importante em saúde pública

Diagnóstico viral É uma virose!

Genoma viral: DNA ou RNA

Doenças com gravidades variadas;

Quadros brandos, sem importância clínica;

Quadros graves, com desfecho fatal;

Vírus diferentes:

Diferentes sintomas clínicos:

idade, imunidade...

Mesmo sintoma clínico:

causado por vírus diferentes

Infecções Virais do TR

Vírus Respiratórios

Influenza A e B

Parainfluenza 1,2,3

Vírus Respiratório Sincicial

Adenovírus

Coronavírus

Rinovírus

Metapneumovírus

Bocavírus...

Diagnóstico viral Rapidez Facilidade Precisão Sensibilidade Testes Rápidos Imunofluorescência Testes Moleculares $ $ $

Detecção de Vírus Respiratórios

Cultura:

Padrão ouro

Resultados: 7 – 14 dias

Requer experiência para reconhecer o efeito citopático de cada vírus

Manter vários tipos de células em cultivo

Custo

RSV

Testes Rápidos

Sensibilidade (FluA):

< 5 anos: 84%

6 – 20 anos: 56%

21 – 50 anos: 43%

> 50 anos: 33%

Baixa sensibilidade, dependente da idade do paciente. Resultados negativos devem ser confirmados por outro método!

Efeito do tipo de amostra na detecção rápida de vírus respiratórios

Amostra:

NF - aspirado a ....... 100 % vs IFD

NF - lavado b .......... 100 % vs IFD/cultura

NF - swab a ............. 63% vs IFD

a JCM 38:429-30; 2000 b JCM 29:479-82; 1989 Sensibilidade (Directigen Flu A)

Imunofluorescência Anticorpo marcado Antígeno viral Lâmina com a amostra Y Y Y Excitação Emissão

Imunofluorescência hMPV IFV Resultados rápidos (horas) Não disponível para alguns vírus respiratórios Para hMPV: Não recomendado (sensibilidade ~ 68%*) *Comparado com método molecular

Imunofluorescência para vírus respiratórios

Adenovirus 58 50 – 53

Influenza A 83 80 – 89

Influenza B 83 83 – 90

Parainfluenza 1-3 95 72 – 76

RSV 99 90 – 93

IFD/Chemicon IFI/Bartels a V írus: Sensibilidade (%) a vs cultura – IF e Cultura

Cultura para detecção de VR *Especialmente importante para adenovirus N/D 49 – 58 Adenovirus* N/D 80 – 95 Parainfluenza 74 – 95 90 – 99 VRS 53 – 94 80 – 98 Influenza Testes rápidos Imunofluorescência Sensibilidade comparada com cultura celular (%)

Detecção de Vírus Respiratórios: Adenovírus hMPV Limitações dos testes: 1 2 3 1. Urina 2. LCR 3. Sangue

Diagnóstico Molecular - PCR

PCR Convencional Amplificação (PCR) 2 - 4 h Eletroforese 30 – 40 min Detecção (Brometo de etídio) Fotodocumentação Coleta Extração DNA/RNA (1 h)

RT-PCR

Usando o RNA viral:

Necessário fazer transcrição reversa

30 min; 45C

Transcriptase reversa: RNA  cDNA

PCR

PCR em Tempo Real Amplificação (PCR) 2 - 4 h Eletroforese 30 – 40 min Coleta Extração DNA/RNA (1 h) Amplificação e Detecção de amostras (40 min) PCR em Tempo Real

Infecção Respiratória: Detecção de Agentes Virais Clássicos PI1 PI3 PCR Tempo Real Multiplex RSV IA IB

Detecção de Rinovirus Genótipos distintos (>100)

Importância Clínica dos RNV

43 crianças internadas em UTI com doença respiratória viral:

21 (49%) positivas para RNV (PCR)

Associado com:

Baixa idade (média 1,4 anos)

Pneumonia

Requerimento de ventilação mecânica

hospitalização prolongada

Infecção por RNV pode ser mais severa e importante que se pensava...

Pediatr Infec Dis J. 4:337-9, 2009

Freqüência dos VR detectados por PCR-TR Pilger 2009 – Tese de Doutorado 455 amostras respiratórias Crianças < 2 anos Hospital Santo Antonio Sinais clínicos de ITR inferior (maio 2007 – junho 2008) 2 (0,4) PIV 2 7 (1,6) PIV 1 9 (2,0) ADV 26 (5,8) PIV 3 30 (6,7) Flu B 94 (20,9) Flu A 222 (49,3) RSV Número (%) Vírus

PCR Tempo Real X IF Pilger 2009 – Tese de Doutorado (VRS, FluA & B, PIV 1,2,3, ADV) (+ hBov, hMPV, RNV) 455 (100) - - 37 (8,1) 321 (70,6) 97 (21,3) PCR-TR p/ 7 VR (%): 455 (100) 8 (1,8) 47 (10,3) 144 (31,6) 210 (46,2) 46 (10,1) PCR-TR p/ 10 VR (%): 455 (100) Total - 4 - 3 5 (1,1) 2 242 (53,2) 1 208 (45,7) 0 IF p/ 7 VR (%): Número de Vírus

n = 267 IRA PCR: 43% IFD: 19% Cultura: 14% =

Novos vírus respiratórios

- Metapneumovirus humano

- Bocavirus humano

Coronavirus

H1N1 (gripe suína)...

Infecção Respiratória: Novos vírus Metapneumovirus 2001

Bocavirus humano - hBoV

Primeira descrição do virus:

2005

Instituto Karolinska, Estocolmo, Suécia

Projeto de triagem para novos vírus respiratórios

Parvovírus

“ Bo vine” - “ Ca nine”

Detecção de Bocavirus humano (hBoV) em diversos países

Austrália

Japão

Canadá

França

USA

Alemanha

Coréia do Sul

Jordânia

África do Sul

Suíça

China

Tailândia

Itália

Relatos escassos sobre a detecção de hBoV no Brasil ou América latina

Detecção de Bocavirus humano

Vírus não-cultivável:

Necessidade de desenvolver método de diagnóstico rápido e confiável

Métodos Moleculares:

PCR

PCR “Real-Time”

TaqMan

Detecção de Bocavirus humano PCR convencional:

Infecção Respiratória: Novos vírus Bocavirus 2005

321 amostras respiratórias 36 (14,5%) positivas para hBoV Clinical Virology Symposium Daytona Beach – FL - 2008

Freqüência de outros VR em amostras respiratórias Pilger 2009 – Tese de Doutorado 455 amostras respiratórias Crianças < 2 anos Hospital Santo Antonio Sinais clínicos de ITR inferior (maio 2007 – junho 2008) 60 (13,2) hBOV 66 (14,5) hMPV 112 (24,9) RNV Número (%) Vírus

Distribuição dos VR em amostras respiratórias Pilger 2009 – Tese de Doutorado 59,3 270 Total RSV+hBoV+RNV RSV+Pertussis hMPV FluA+RNV RSV+hMPV RSV+hBoV RNV RSV+RNV FluA RSV Vírus 4,0 18 4 1,3 6 10 1,5 7 9 2,2 10 8 2,9 13 7 3,1 14 6 3,3 15 5 5,5 25 3 8,8 40 2 26,8 122 1 % Freqüência

Coinfecção em viral amostras respiratórias

455 amostras:

409 positivas para 1 ou + VR (89,9%)

199 positivas para >1 VR

Coinfecção em 43,7% das amostras

Infecção dupla em 144 (31,6%)

triplas em 47 (10,3%)

quatro VR em 8 amostras (1,8%)

Qual o significado clínico das coinfecções? Pilger 2009 – Tese de Doutorado

Infecções múltiplas - Hipótese Virus 1 Virus 3 Virus 2 Tempo PCR (a) [ ] viral Liberação de citocinas Ativação de Linf. Th1/Th2 Modulação da imunidade Modificação de receptores infecções secundárias? PCR (c) PCR (b)

Coinfecção em viral amostras respiratórias Pilger 2009 – Tese de Doutorado 59,3 270 Total RSV+hBoV+RNV RSV+Pertussis hMPV FluA+RNV RSV+hMPV RSV+hBoV RNV RSV+RNV FluA RSV Vírus 4,0 18 4 1,3 6 10 1,5 7 9 2,2 10 8 2,9 13 7 3,1 14 6 3,3 15 5 5,5 25 3 8,8 40 2 26,8 122 1 % Freqüência

Patógenos Respiratórios Bacterianos B.pertussis B.parapertussis B.bronchiseptica Mycoplasma pneumoniae Bordetella spp

Presença de Bordetella pertussis em amostras respiratórias de crianças n = 78 Cantarelli, et al., 2002 IFD ( sem clínica conhecida )

Bordetella pertussis (BP) e VRS

Estudo em hospital da França

PCR-TR para VRS e BP em todas as crianças com bronquiolite ou ITRI

90 RSV positivas

14 (16%) coinfectadas com B. pertussis

73% das crianças não vacinadas para BP

Coinfecção VRS-BP é comum em crianças não-vacinadas para pertussis Pediatr Infect Dis J. 26:316-8, 2007 Eur J Pediatr. 167:1017-9, 2008

Influenza A Neuraminidase (N) Hemaglutinina (H) Interação com a célula hospedeira:

Influenza A Neuraminidase Ácido siálico Galactose Pneumococo Haemophilus S. aureus

Infecção bacteriana após infecção por vírus respiratórios

Aderência aumentada (2-10X) de todos os sorotipos de pneumococos testados após infecção por VRS (Pediatr Res. 55:972-8, 2004)

Vírus respiratórios aumentam a adesão de patógenos bacterianos às células do epitélio respiratório:

dependente do tipo de vírus e tipo de célula

(J Virol. 80:1629-36, 2006)

Interação VRS-Pneumococo VRS Aderência aumentada em células epiteliais Aumento das taxas de bacteremias em modelo murino Aderência direta entre VRS e pneumococo

Influenza A: Novos desafios

Virus Influenza A Recombinantes

Biologia Molecular