Cromatografía de líquidos2010

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Cromatografía de líquidos2010

  1. 1. CROMATOGRAFÍA DECROMATOGRAFÍA DELÍQUIDOSLÍQUIDOSPrimera Parte:Primera Parte:en columnaen columna
  2. 2. Cromatografía de líquidos en columnaCromatografía de líquidos en columnasegún los mecanismos de partición y/osegún los mecanismos de partición y/oabsorción, por baja o alta performance.absorción, por baja o alta performance.Aparatos:Aparatos:materialesmateriales: vidrio, cuarzo, plástico, celofán o metálicas.: vidrio, cuarzo, plástico, celofán o metálicas.formas;formas; cuadradas, circulares, cilíndricas y elípticas, la más apropiada es la decuadradas, circulares, cilíndricas y elípticas, la más apropiada es la desección circular.sección circular.dimensiones :dimensiones : El tamaño depende de la cantidad de soporte que se use, peroEl tamaño depende de la cantidad de soporte que se use, perodebe ser la relación longitud/ diámetro bastante mayor que uno.debe ser la relación longitud/ diámetro bastante mayor que uno.Le Rosen comprobó que la velocidad del flujo del solvente a través de la columnaLe Rosen comprobó que la velocidad del flujo del solvente a través de la columnaes independiente del diámetroes independiente del diámetrofuncionamientofuncionamiento ::AscendenteAscendenteVertical: con flujoVertical: con flujo DescendenteDescendenteEn formaEn forma HorizontalHorizontalInclinadaInclinadaLa aceleración de la gravedadLa aceleración de la gravedadPor acción de Presión aplicada en la parte de entradaPor acción de Presión aplicada en la parte de entradaSucción a la salidaSucción a la salida
  3. 3. Es importante la forma de rellenado:Es importante la forma de rellenado:Empaque HúmedoEmpaque HúmedoSecoSecoEl método “húmedo” asegura el equilibrio entre las fases estacionaria y móvil.El método “húmedo” asegura el equilibrio entre las fases estacionaria y móvil.se introduce como una papilla con el eluyente.se introduce como una papilla con el eluyente.Previamente se elimina el aire y se agrega un poco de disolvente puro.Previamente se elimina el aire y se agrega un poco de disolvente puro.se elimina el exceso de disolvente.se elimina el exceso de disolvente.El método en “seco” colocar un elemento de sustentación del relleno (por ejemplo lana, vidrio);El método en “seco” colocar un elemento de sustentación del relleno (por ejemplo lana, vidrio);tomar el tubo con una manotomar el tubo con una manointroduce una pequeña cantidad de materialintroduce una pequeña cantidad de materialempujar el material hasta el otro extremoempujar el material hasta el otro extremoproseguir el rellenado con pequeños incrementosproseguir el rellenado con pequeños incrementoscuidar que la presión ejercida sea solo la necesaria para dar firmezacuidar que la presión ejercida sea solo la necesaria para dar firmezaestabilizar el relleno con una cobertura con un disco de papel de filtro o deestabilizar el relleno con una cobertura con un disco de papel de filtro o delana de vidrio.lana de vidrio.““anillos de presión”. Este efecto se a que cuando se introduce una gran cantidad de material deanillos de presión”. Este efecto se a que cuando se introduce una gran cantidad de material deuna vez, la presión que se aplica en la parte superior no se transmite en forma efectiva a la porciónuna vez, la presión que se aplica en la parte superior no se transmite en forma efectiva a la porcióninferior.inferior.Concluimos pues que el avance regular de la fase móvil está garantido si se observa el procedimientoConcluimos pues que el avance regular de la fase móvil está garantido si se observa el procedimientodescrito en la forma más rigurosa posibldescrito en la forma más rigurosa posiblee
  4. 4. Cromatografía de líquidos en columnaCromatografía de líquidos en columnasegún los mecanismos de partición y/osegún los mecanismos de partición y/oabsorción, por baja o alta performance.absorción, por baja o alta performance.Fase estacionariaFase estacionaria ::Ella depende del mecanismo de separación:Ella depende del mecanismo de separación:Partición. se inmoviliza el líquido en un soporte inerte.Partición. se inmoviliza el líquido en un soporte inerte.Las fases caracterizan según dos clases: hidrofílicas y fase reversa.Las fases caracterizan según dos clases: hidrofílicas y fase reversa.El soporte preferentemente debe ser inerte y se utilizan ácido silícico, tierrasEl soporte preferentemente debe ser inerte y se utilizan ácido silícico, tierrasdiatomeas, celulosa en polvo, vidrio en polvo y goma de celulosa.diatomeas, celulosa en polvo, vidrio en polvo y goma de celulosa.Como fase fija se usan líquidos de diversos tipos cuyas polaridades varían desdeComo fase fija se usan líquidos de diversos tipos cuyas polaridades varían desdelalacorrespondiente al agua (muy elevada) hasta hidrocarburos parafínicos muy bajascorrespondiente al agua (muy elevada) hasta hidrocarburos parafínicos muy bajasAdsorción, el relleno debe ser activo y en general cualquier sóido poroso que no sea muyAdsorción, el relleno debe ser activo y en general cualquier sóido poroso que no sea muysoluble en la fase móvil es apropiado. ( alúminas preparadas por deshidrataciónsoluble en la fase móvil es apropiado. ( alúminas preparadas por deshidratacióndel hidróxido, por hidrólisis o neutralización de sales. Las ventajas de estedel hidróxido, por hidrólisis o neutralización de sales. Las ventajas de estematerial son: granmaterial son: grancapacidad, blanca, insoluble y químicamente inerte, barata, fácilmente obtenible ycapacidad, blanca, insoluble y químicamente inerte, barata, fácilmente obtenible ymuy versátil.muy versátil.Los rellenos a usar, previamente deben ser sometidos a diversosLos rellenos a usar, previamente deben ser sometidos a diversostratamientos:tratamientos:activados,activados,desactivados ydesactivados yestandarizados.estandarizados.
  5. 5. Activación:Activación:A - Por remoción de sustancias que bloqueanA - Por remoción de sustancias que bloqueanlos lugares activos de la superficie.los lugares activos de la superficie.B - Por mejora del área superficial, la porosidadB - Por mejora del área superficial, la porosidado grupos funcionales.o grupos funcionales.En el primer casoEn el primer casoA-1) activación por calentamiento;A-1) activación por calentamiento;A-2) por lavado con solventes inertesA-2) por lavado con solventes inertesA-3) por uso de reactivos químicos.A-3) por uso de reactivos químicos.B se logra por calentamiento.B se logra por calentamiento.
  6. 6. a-1)a-1) Activación por calentamiento:Activación por calentamiento: tienen por fin el de eliminar eltienen por fin el de eliminar elagua presente en forma parcial. Se debe evitar elagua presente en forma parcial. Se debe evitar elsobrecalentamiento ya que éste puede tener un efectosobrecalentamiento ya que éste puede tener un efectocontraproducente.contraproducente.a-2)a-2) Activación por lavado con solventes inertes:Activación por lavado con solventes inertes: se realiza porse realiza porlavado con solvente caliente en la misma columna cromatográfica olavado con solvente caliente en la misma columna cromatográfica opor proceso “batch”.por proceso “batch”.a-3)a-3) activación por reactivos químicos:activación por reactivos químicos: se produce el lavado conse produce el lavado conácidos, bases u oxidantes, lográndose la remoción de lasácidos, bases u oxidantes, lográndose la remoción de lassustancias que bloquean los lugares activos del material. Estasustancias que bloquean los lugares activos del material. Estaoperación debe llevarse a cabo cuidadosamente ante el riesgo deoperación debe llevarse a cabo cuidadosamente ante el riesgo deprovocar cambios indeseables en el comportamiento delprovocar cambios indeseables en el comportamiento deladsorbente.adsorbente.Desactivación:Desactivación:Se usaSe usapara lograr isotermas menos curvadaspara lograr isotermas menos curvadaspara eliminar alguna propiedad no deseada del rellenopara eliminar alguna propiedad no deseada del rellenolograr la inercia total del material cuando se requiere que el mecanismolograr la inercia total del material cuando se requiere que el mecanismosea de partición.sea de partición.
  7. 7. EstandarizaciónEstandarizaciónPara lograr reproducibilidad en las medidas que conducen a la identificación y evaluación cuantitativa de los componentes de unaPara lograr reproducibilidad en las medidas que conducen a la identificación y evaluación cuantitativa de los componentes de unamuestra, el adsorbente a usar sera estandarizado.muestra, el adsorbente a usar sera estandarizado.Se realiza evaluando suSe realiza evaluando su capacidadcapacidad frente a un grupo de sustancias o bien en base a lafrente a un grupo de sustancias o bien en base a la selectividadselectividad de pares de sustanciasde pares de sustanciasLa capacidad de un adsorbente se puede medirLa capacidad de un adsorbente se puede medirmediante adsorción en batch: una cantidad pesada de adsorbente se coloca como lecho y la solución test pasa al mismo. La cantidadmediante adsorción en batch: una cantidad pesada de adsorbente se coloca como lecho y la solución test pasa al mismo. La cantidadadsorbida se evalúa mediante el cambio en la concentración de la solución.adsorbida se evalúa mediante el cambio en la concentración de la solución.Brokmann: la alúmina se activa (deshidrata) por calentamiento y posteriormente es desactivada con grados controlados de exposición en aire.Brokmann: la alúmina se activa (deshidrata) por calentamiento y posteriormente es desactivada con grados controlados de exposición en aire.mediante el pasaje de una solución de rojo sudan en éter de petróleo en una columna: el ancho de banda está en relación inversa al grado demediante el pasaje de una solución de rojo sudan en éter de petróleo en una columna: el ancho de banda está en relación inversa al grado deactividad de la alúmina.actividad de la alúmina.para un adsorbente dado, cinco grados de actividad según el contenido de agua adsorbida:para un adsorbente dado, cinco grados de actividad según el contenido de agua adsorbida:I. . . . . . 0% de H2I. . . . . . 0% de H2II. . . . . 3% “ “II. . . . . 3% “ “III. . . . 6% “ “III. . . . 6% “ “IV. . . . 10% “ “IV. . . . 10% “ “V. . . . . 15% “ “V. . . . . 15% “ “Esta escala fue sugerida por Brokmann mediante la desactivación progresiva de la alúmina al agregar agua: para una actividad deseadaEsta escala fue sugerida por Brokmann mediante la desactivación progresiva de la alúmina al agregar agua: para una actividad deseadase coloca una cantidad conocida de alúmina activada a grado I en un frasco con una cantidad apropiada de agua, se cierra el frasco y sese coloca una cantidad conocida de alúmina activada a grado I en un frasco con una cantidad apropiada de agua, se cierra el frasco y seagita la mezcla por muchas horas. La actividad según el método se mide por la habilidad de separar mezclas de seis colorantes:agita la mezcla por muchas horas. La actividad según el método se mide por la habilidad de separar mezclas de seis colorantes:Metoxiazobenceno (A)Metoxiazobenceno (A) Amarillo Sudán (B)Amarillo Sudán (B)Rojo Sudán (C)Rojo Sudán (C) Aminoazobenceno (D)Aminoazobenceno (D)Hidroxiazobenceno (E)Hidroxiazobenceno (E) Azobenceno (F)Azobenceno (F)Definió la actividad de la alúmina de tal forma que en condiciones estándar los dos más débilmente adsorbidos sean recogidos yDefinió la actividad de la alúmina de tal forma que en condiciones estándar los dos más débilmente adsorbidos sean recogidos yseparados por la alúmina más activa (Gº I) mientras que los más fuertemente adsorbidos se separaban por la última de menor actividad:separados por la alúmina más activa (Gº I) mientras que los más fuertemente adsorbidos se separaban por la última de menor actividad:
  8. 8. Tamaño de las partículas de Relleno:Tamaño de las partículas de Relleno:influencia importante en la calidad de las separacionesinfluencia importante en la calidad de las separaciones..adsorbentes de gran granulometría dan cromatogramas borrosos mientras que los adsorbentesadsorbentes de gran granulometría dan cromatogramas borrosos mientras que los adsorbentespulverulentos dan mejores resultados. Sin embargo es difícil establecer una prescripción absoluta acercapulverulentos dan mejores resultados. Sin embargo es difícil establecer una prescripción absoluta acercade cual es el mejor tamaño de partícula.de cual es el mejor tamaño de partícula. Existe una interrelación entre el “diámetro” de partícula y el diámetro de la columna. Además se incluyeExiste una interrelación entre el “diámetro” de partícula y el diámetro de la columna. Además se incluyecomo factor, la facilidad de manipulación y relleno, en general es más fácil empacar columnascomo factor, la facilidad de manipulación y relleno, en general es más fácil empacar columnashomogéneamente con partículas de regular tamaño que con pequeñas.homogéneamente con partículas de regular tamaño que con pequeñas.Velocidad de adsorción:Velocidad de adsorción:Al comienzo se produce una adsorción rápida (al menos de veinte segundos se adsorben las 2/3Al comienzo se produce una adsorción rápida (al menos de veinte segundos se adsorben las 2/3partes),partes),Disminuye luego la velocidad de adsorción requiriéndose unos cuantos minutos (20Disminuye luego la velocidad de adsorción requiriéndose unos cuantos minutos (20aproximadamente) para completarse el proceso.aproximadamente) para completarse el proceso.La velocidad de desorcion es del mismo orden que la de adsorción.La velocidad de desorcion es del mismo orden que la de adsorción.Velocidad de flujo:Velocidad de flujo:En lo referente a la velocidad de flujo de la fase móvil, al contrario a lo que ocurre enEn lo referente a la velocidad de flujo de la fase móvil, al contrario a lo que ocurre encromatografía de gasescromatografía de gases a mayor velocidad de flujo mayor “altura de platoa mayor velocidad de flujo mayor “altura de plato”.”.Cuando la velocidad de flujo decrece por un periodo y luego retorna a su valor original (porCuando la velocidad de flujo decrece por un periodo y luego retorna a su valor original (porcambio de la presión) se observa la ruptura en la curva de concentración del efluente, es decircambio de la presión) se observa la ruptura en la curva de concentración del efluente, es decirque resulta perjudicial interrumpir una experiencia y continuarla después.que resulta perjudicial interrumpir una experiencia y continuarla después.Uniformidad de la empaquetadura:Uniformidad de la empaquetadura:Las irregularidades a través de la columna son normalmente grandes comparadas con laLas irregularidades a través de la columna son normalmente grandes comparadas con ladifusión o la falta de agudeza de la banda. Se introduce el % de distorsión (longitud del frente/difusión o la falta de agudeza de la banda. Se introduce el % de distorsión (longitud del frente/distancia media que se ha movido el frente) o bien:distancia media que se ha movido el frente) o bien:D% = (D% = (ΔΔL/ LL/ Lii) *100 D% = () *100 D% = (ΔΔV/ Vret)*100V/ Vret)*100Los mejores resultados fueron en el caso en el que tal porcentaje fue de aproximadamenteLos mejores resultados fueron en el caso en el que tal porcentaje fue de aproximadamentecinco.cinco.
  9. 9. Cromatografía de líquidos en columnaCromatografía de líquidos en columnasegún los mecanismos de partición y/osegún los mecanismos de partición y/oabsorción, por baja o alta performanceabsorción, por baja o alta performanceFase móvil:Fase móvil:Solventes:Solventes: son en general más o menosson en general más o menosinertes hacia el adsorbente o los adsortivos.inertes hacia el adsorbente o los adsortivos.Se usan como portadores de la mezcla que seSe usan como portadores de la mezcla que sedebe separar.debe separar.Eluyente:Eluyente: remueve los adsortivos de losremueve los adsortivos de losadsorbentes.adsorbentes.Desalazantes:Desalazantes: aquellos eluyentes con fuerzaaquellos eluyentes con fuerzaeluctante altaeluctante altaDesarrollantes:Desarrollantes: eluyentes con fuerza eluctanteeluyentes con fuerza eluctantebaja.baja.
  10. 10. Se pueden evaluar los solventesSe pueden evaluar los solventespor su poder de elucionpor su poder de elucionSerie eluotrópicaSerie eluotrópica1 N pentano 10 Cloroformo2 Éter de petróleo 11 Dietileter3 N- hexano 12 Acetato de etilo4 N- heptano 13 Piridina5 Ciclohexano 14 Acetona6 Tetracloruro de carbono 15 n-propanol7 Tricloroetileno 16 etanol8 Benceno 17 metanol9 Dicloroetano 18 aguaAumentodelpodereluotrópicoAumentodelpodereluotrópico
  11. 11. Formas de elección de las fases:Formas de elección de las fases:La figura brinda una interesante orientación para la elección de lasLa figura brinda una interesante orientación para la elección de lasfases conocida la naturaleza de la mezcla a separar: se señala con elfases conocida la naturaleza de la mezcla a separar: se señala con elvértice del triangulo equilátero giratorio el grado de polaridad de lavértice del triangulo equilátero giratorio el grado de polaridad de lamezcla y los restantes vértices indicaran el grado de actividad de lamezcla y los restantes vértices indicaran el grado de actividad de lafase estacionaria y polaridad de la móvil.fase estacionaria y polaridad de la móvil.Fase móvilMuestraFaseestacionariaHidrofílica polarLipofílica no polarHidrofílica polarHidrofílica polarLipofílica no polarLipofílica no polar
  12. 12. Desarrollo cromatográficosDesarrollo cromatográficosAnteriormente, se describieron los desarrollos frontal, por desplazamiento y porAnteriormente, se describieron los desarrollos frontal, por desplazamiento y porelución.elución.Elución Fraccionada:Elución Fraccionada:Se utilizan distintos disolventes, siendo cada uno más enérgico que el anterior. EsteSe utilizan distintos disolventes, siendo cada uno más enérgico que el anterior. Esteprocedimiento permite abreviar la elución de las sustancias fuertemente adsorbidas.procedimiento permite abreviar la elución de las sustancias fuertemente adsorbidas.Elución gradual:Elución gradual:Si las isotermas no son lineales, se presentan cromatogramas distorsionados: frenteSi las isotermas no son lineales, se presentan cromatogramas distorsionados: frentedifuso o colas. En el ultimo caso, se logra disminuir la magnitud de las colasdifuso o colas. En el ultimo caso, se logra disminuir la magnitud de las colasmezclando con el eluyente que se usa en la columna, otro más enérgico amezclando con el eluyente que se usa en la columna, otro más enérgico aconcentración gradualmente mayor. Así se establece un gradiente de concentraciónconcentración gradualmente mayor. Así se establece un gradiente de concentracióna lo largo de la columna que hace que la parte posterior de cualquier banda o zonaa lo largo de la columna que hace que la parte posterior de cualquier banda o zonacromatográfica se encuentre siempre en contacto con una solución eluyente máscromatográfica se encuentre siempre en contacto con una solución eluyente másenérgica que la parte frontalenérgica que la parte frontal
  13. 13. Cromatografía liquida de altaCromatografía liquida de altavelocidad (CLAP o HPLC)velocidad (CLAP o HPLC)La dificultad principal que presenta la cromatografía liquidaLa dificultad principal que presenta la cromatografía liquidatradicional es la lentitud.tradicional es la lentitud.La cromatografía de gases, presenta el inconveniente de lasLa cromatografía de gases, presenta el inconveniente de laselevadas temperaturas de trabajo que pueden destruir la muestra, yelevadas temperaturas de trabajo que pueden destruir la muestra, ylimita la posibilidad de elección de las fases fija y móvil.limita la posibilidad de elección de las fases fija y móvil.Es así que surge la cromatografía liquida de alta velocidadEs así que surge la cromatografía liquida de alta velocidad(performance) que compite muy ventajosamente en muchos casos(performance) que compite muy ventajosamente en muchos casoscon la cromatografía de gases. Para efectuar las separaciones concon la cromatografía de gases. Para efectuar las separaciones conrapidez, el eluyente se hace pasar a través de la columna arapidez, el eluyente se hace pasar a través de la columna avelocidades lineales de flujo que puedenvelocidades lineales de flujo que puedenser hasta 100 veces la de la cromatografíaser hasta 100 veces la de la cromatografíatradicional.tradicional.Es de hacer notar que la eficienciaEs de hacer notar que la eficiencia(expresada en “ATPE”) es mayor(expresada en “ATPE”) es mayorcuanto menor sea la velocidadcuanto menor sea la velocidad
  14. 14. Los componentes de unLos componentes de uncromatógrafo de líquidos de altacromatógrafo de líquidos de altavelocidadvelocidaddepositoBombaInyectorColumnaDetectorRegistradorColector defraccionesMedidor deflujo
  15. 15. cromatógrafo de líquidoscromatógrafo de líquidosde alta velocidadde alta velocidad
  16. 16. Bombas:Bombas:La bomba que fuerza el líquido a pasar por la columna a una velocidadLa bomba que fuerza el líquido a pasar por la columna a una velocidadsatisfactoria, es impulsada por un motor. Dado que los detectores usadossatisfactoria, es impulsada por un motor. Dado que los detectores usadospor lo general son sensibles al flujo, la bomba de liberar el líquido a unapor lo general son sensibles al flujo, la bomba de liberar el líquido a unavelocidad constante, sin pulsaciones. Una forma consiste en introducir dosvelocidad constante, sin pulsaciones. Una forma consiste en introducir doscilindros y pistones programados de tal modo que uno se llene rápidamentecilindros y pistones programados de tal modo que uno se llene rápidamentemientras el otro se vacía en forma lenta; después, este último lleva a cabomientras el otro se vacía en forma lenta; después, este último lleva a cabola función de llenado mientras su compañero se vacía, y así cíclicamente.la función de llenado mientras su compañero se vacía, y así cíclicamente.Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.Mantener el flujo libre de pulsacionesMantener el flujo libre de pulsacionesGenerar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)Control y reproducibilidad del flujo de solventeControl y reproducibilidad del flujo de solventeComponentes de la bomba resistentes a la corrosiónComponentes de la bomba resistentes a la corrosiónLas bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según suLas bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según sufuncionamiento y diseño en:funcionamiento y diseño en:MecánicasMecánicasRecíprocantesRecíprocantesDe desplazamiento contínuoDe desplazamiento contínuoNeumáticasNeumáticas
  17. 17. ColumnasColumnasdiámetro interno de 1 a 6 mmdiámetro interno de 1 a 6 mmlongitud de 30 a 100 cm cortas sonlongitud de 30 a 100 cm cortas sonrectas y las mas largas enrolladasrectas y las mas largas enrolladas(long 600 cm).(long 600 cm).son de acero inoxidable o deson de acero inoxidable o devidrio.vidrio.operan a temperatura ambiente.operan a temperatura ambiente.La velocidad de difusión puedeLa velocidad de difusión puedeaumentar de un poco alaumentar de un poco alincrementar la temperatura, por loincrementar la temperatura, por loque se suele usar una camisa deque se suele usar una camisa decalentamiento, en “CLAP” elcalentamiento, en “CLAP” elcontrol de la temperatura no es tancontrol de la temperatura no es tansignificativo como en CGsignificativo como en CG
  18. 18. Gradiente de elución:Gradiente de elución:El equivalente de la programación de temperaturas usada en CG es gradiente de elución oEl equivalente de la programación de temperaturas usada en CG es gradiente de elución oprogramación del disolvente.programación del disolvente.Produce un cambio en los coeficientes de partición de los componentes y puede conducir a unaProduce un cambio en los coeficientes de partición de los componentes y puede conducir a unamejor resolución.mejor resolución.Se cambia gradualmente la composición durante el proceso de separación por medio de laSe cambia gradualmente la composición durante el proceso de separación por medio de laválvula mezcladora programada.válvula mezcladora programada.Existen dos métodos de programación de Solvente en HPLC:Existen dos métodos de programación de Solvente en HPLC:IsocráticoIsocráticoGradiente de Elución. Es un término que se utiliza para describir el proceso mendiante el cual seGradiente de Elución. Es un término que se utiliza para describir el proceso mendiante el cual secambia la composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras:cambia la composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras:A baja presiónA baja presiónA alta presiónA alta presiónPermite obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el menor tiempoPermite obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el menor tiempoposible.posible.Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se debe tener presente dosCuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se debe tener presente dosobjetivos:objetivos:Asegurar alta precisión y exactitud.Asegurar alta precisión y exactitud.Determinar la composición inicial y final del solventeDeterminar la composición inicial y final del solventePara obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir 5 pasosPara obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir 5 pasosfundamentales:fundamentales:a) Ajustar el tiempo del gradientea) Ajustar el tiempo del gradienteb) Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa)b) Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa)c) Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resoluciónc) Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resoluciónd) Regresar a las condiciones iniciales la columna.d) Regresar a las condiciones iniciales la columna.
  19. 19. Sistemas de Inyección de muestraSistemas de Inyección de muestraEstos sistemas han variados durante laEstos sistemas han variados durante lahistoria del sistema de HPLC, en unhistoria del sistema de HPLC, en unprincipio de utilizaba la inyección de laprincipio de utilizaba la inyección de lamuestra con jeringas de alta presiónmuestra con jeringas de alta presióncuales ya están de desuso. Hoy se utilizacuales ya están de desuso. Hoy se utilizael sistema de válvulas inyectorasel sistema de válvulas inyectoras
  20. 20. DetectoresDeben de tener un volumen interno pequeño parareducir el ensanchamiento de picoBasados en una propiedad de la fase móvil (refracción,densidad etc.)Basados en una propiedad del soluto (absorbancia enUV, fluorescencia etc.)Tipos de detectoresDetector de absorbanciaDetector de fluorescenciaDetector de índice de refracciónDetector de dispersión de luzDetector electroquímicoDetector por espectroscopia de masas

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