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Apuntes cromatografia

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  • 1. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS(Primera Parte: en columna)Dentro de la clasificación general de los métodos cromatográficos, este tipo de procedimientotrata el caso en el que la dase móvil es un líquido. Por otra parte recordemos que según seala fase fija: liquida sobre un soporte sólido inerte, o un sólido activo, estaremos ante unacromatografía de partición o de absorción, respectivamente. De acuerdo a los elementosusados se consideran tres grupos: en columna; papel y capa fina.El presente capitulo concretará su enfoque en el caso de “Cromatografía de líquidos encolumna según los mecanismos de partición y/o absorción, por baja o alta performance”.A tal fin se consideran los siguientes tres aspectos:1) Aparatos; 2) Fase estacionaria y 3) Fase móvil para baja performance.1) Aparatos:Se usan columnas de diversos materiales: vidrio, cuarzo, plástico, celofán o metálicas. Enlo referente a formas y dimensiones; se representan de distintas secciones: cuadradas,circulares, cilíndricas y elípticas. Comprobándose que la más apropiada es la de seccióncircular. El tamaño depende de la cantidad de soporte que se use, pero debe ser la relaciónlongitud/ diámetro bastante mayor que uno.Le Rosen comprobó que la velocidad del flujo del solvente a través de la columna esindependiente del diámetro (columnas conteniendo hidróxido de calcio y con diámetros de17,43 y 70 mm e igual longitud, dieron la misma velocidad de flujo).En cuanto a funcionamiento presenta las siguientes alternativas:AscendenteVertical: con flujo descendenteEn forma horizontalInclinadaLa aceleración de la gravedadPor acción de presión aplicada en la parte de entradaSucción a la salidaEs importante la forma de rellenado:Las columnas pueden empacarse húmedas o secas. Elmétodo “húmedo” es mejor por el solo hecho de asegurar así el equilibrio entre las fasesestacionaria y móvil. A tal fin se introduce como una papilla con el eluyente. Previamente seelimina el aire y se agrega un poco de disolvente puro. Luego de instalada la pasta en lacolumna, se elimina el exceso de disolvente.El empaque en “seco” consiste en colocar, como en el caso anterior, un elemento desustentación del relleno(por ejemplo lana, vidrio); se toma el tubo con una mano y seintroduce una pequeña cantidad de material (soporte o absorbente según sea partición oabsorción el mecanismo, el material es empujado hasta el otro extremo hasta quedar apoyadoen el elemento de sustentación, así se prosigue el rellenado con pequeños incrementos en lasustancia en cuestión cuidando que la presión ejercida sea solo la necesaria para dar firmeza
  • 2. en la columna, por fin se estabiliza el relleno con una cobertura con un disco de papel de filtroo de lana de vidrio. Es conveniente que se invierta en cierto tiempo y cuidado en laempaquetadura ya que de lo contrario se producirán “anillos de presión” cuando pase la fasemóvil. Este efecto se debe a que cuando se introduce una gran cantidad de material de unavez, la presión que se aplica en la parte superior no se transmite en forma efectiva a laporción inferior. Este efecto está representado en la figura 1.Concluimos pues que el avance regular de la fase móvil está garantido si se observa elprocedimiento descrito en la forma más rigurosa posible.2) Fase estacionaria:Ella depende del mecanismo de separación:Partición o adsorción. En el primer caso, se inmoviliza el líquido en un soporte inerte. Lasfases caracterizan según dos clases: hidrofílicas y fase reversa. El soporte preferentementedebe ser inerte y es por ello que se han utilizado con más frecuencia: ácido silícico, tierrasdiatomeas, celulosa en polvo, vidrio en polvo y goma de celulosa.Como fase fija se usan líquidos de diversos tiempos cuyas polaridades varían desde lacorrespondiente al agua (muy elevada) hasta hidrocarburos parafínicos.En el caso de adsorción, el relleno debe ser activo y en generalcualquier solido poroso que no sea muy soluble en la fase móvil es apropiado. Entre ellosencontramos las alúminas preparadas por deshidratación del hidróxido, por hidrólisis oneutralización de sales. Las ventajas de este material son: gran capacidad, blanca, insoluble yquímicamente inerte, barata, fácilmente obtenible y muy versátil.Los rellenos a usar, previamente deben ser sometidos a diversostratamientos: activados, desactivados y estandarizados.Activación:Esta operación se lleva a cabo de las siguientes formas:a) Por remoción de sustancias que bloquean los lugares activos de la superficie.b) Por mejora del área superficial, la porosidad o grupos funcionales.En el primer caso se puede recurrir a a-1) activación por calentamiento; a-2) por lavado consolventes inertes y a-3) por uso de reactivos químicos. La segunda alternativa (b) se logra porcalentamiento.a-1) Activación por calentamiento: tienen por fin el de eliminar el agua presente en formaparcial. Se debe evitar el sobrecalentamiento ya que éste puede tener un efectocontraproducente.a-2) Activación por lavado con solventes inertes: se realiza por lavado con solvente calienteen la misma columna cromatográfica o por proceso “batch”.a-3) activación por reactivos químicos: para ello se produce el lavado con ácidos, bases uoxidantes, lográndose la remoción de las sustancias que bloquean los lugares activos delmaterial. Esta operación debe llevarse a cabo cuidadosamente ante el riesgo de provocarcambios indeseables en el comportamiento del adsorbente.Desactivación:
  • 3. Es requerida en algunos casos la desactivación para lograr isotermas menoscurvada y para eliminar alguna propiedad no deseada del relleno o en el caso extremo,cuando se requiere que el mecanismo sea de partición, lograr la inercia total del material..Estandarización:A los fines de poder lograr cierta reproducibilidad en las medidas queconducen a la identificación y evaluación cuantitativa de los componentes de una muestra, esimprescindible que el adsorbente a usar sea estandarizado. Esto se lleva a cabo evaluando lacapacidad del mismo frente a un grupo de sustancias o bien en base a la selectividad depares de sustancias. (No tiene sentido los términos de capacidad o selectividad cuando no selos refiere a “algo”).La capacidad de un adsorbente se puede medir mediante adsorción en batch:una cantidad pesada de adsorbente se coloca como lecho y la solución test pasa al mismo. Lacantidad adsorbida se evalúa mediante el cambio en la concentración de la solución.Otro método de estandarización es el de Brokmann: la alúmina se activa(deshidrata) por calentamiento y posteriormente es desactivada con grados controlados deexposición en aire. Otra forma es mediante el pasaje de una solución de rojo sudan en éter depetróleo en una columna: el ancho de banda está en relación inversa al grado de actividad dela alúmina.Se establecen, para un adsorbente dado, cinco grados de actividad según el contenido deagua adsorbida: I. . . . . . 0% de H2oII. . . . . 3% “ “III. . . . 6% “ “IV. . . . 10% “ “V. . . . . 15% “ “Esta escala fue sugerida por Brokmann mediante la desactivación progresiva de la alúmina alagregar agua: para una actividad deseada se coloca una cantidad conocida de alúminaactivada a grado I en un frasco con una cantidad apropiada de agua, se cierra el frasco y seagita la mezcla por muchas horas. La actividad según el método se mide por la habilidad deseparar mezclas de seis colorantes:Metoxiazobenceno (A) Amarillo Sudán (B)Rojo Sudán (C) Aminoazobenceno (D)Hidroxiazobenceno (E) Azobenceno (F)Definió la actividad de la alúmina de tal forma que en condiciones estándar los dos másdébilmente adsorbidos sean recogidos y separados por la alúmina más activa (Gº I) mientrasque los más fuertemente adsorbidos se separaban por la última de menor actividad:Tamaño de las partículas de Relleno:Este aspecto ejerce una influencia importante en lacalidad de las separaciones. Tswett observó que adsorbentes de gran granulometría dan
  • 4. cromatogramas borrosos mientras que los adsorbentes pulverulentos dan mejores resultados.Sin embargo es difícil establecer una prescripción absoluta acerca de cual es el mejor tamañode partícula. Existe una interrelación entre el “diámetro” de partícula y el diámetro de lacolumna. Además se incluye como factor, la facilidad de manipulación y relleno, en general esmás fácil empacar columnas homogéneamente con partículas de regular tamaño que conpequeñas.Velocidad de adsorción:Se probó que en un comienzo se produce una adsorción rápida(almenos de veinte segundos se adsorben las 2/3 partes), disminuye luego la velocidad deadsorción requiriéndose unos cuantos minutos (20 aproximadamente) para completarse elproceso. Esto explica el porque de los escalones en el análisis frontal. Por otra parte, lavelocidad de desorcion es del mismo orden que la de adsorción.Velocidad de flujo:En lo referente a la velocidad de flujo de la fase móvil, al contrario a lo queocurre en cromatografía de gases (recuérdese que al graficar “altura efectiva de plato” vsvelocidad de flujo, se puede calcular la velocidad optima que hace mínima la “ATEP”), en todomomento a mayor velocidad de flujo mayor “altura de plato”.Cuando la velocidad de flujo decrece por un periodo y luego retorna a suvalor original (por cambio de la presión) se observa la ruptura en la curva de concentración delefluente, es decir que resulta perjudicial interrumpir una experiencia y continuarla después.Uniformidad de la empaquetadura:Se comprobó que las irregularidades a través de lacolumnason normalmente grandes comparadas con la difusión o la falta de agudeza de la banda. Seintroduce el % de distorsión (longitud del frente/ distancia media que se ha movido el frente) obien:Los mejores resultados fueron en el caso en el que tal porcentaje evalió aproximadamentecinco.3) Fase móvil:Se deben distinguir los siguientes términos:Solventes, desarrollantes, eluyente y desplazantes.Solventes: son en general más o menos inertes hacia el adsorbente o los adsortivos. Se usancomo portadores de la mezcla que se debe separar.Eluyente: remueve los adsortivos de los adsorbentes.Desalazantes: aquellos eluyentes con fuerza eluctante altaDesarrollantes: eluyentes con fuerza eluctante baja.
  • 5. Estas series se deben usar con cautela ya que pueden presentarse irregularidades quepueden ser explicadas teóricamente.Formas de elección de las fases:La figura brinda una interesante orientación para la elecciónde las faces conocida la naturaleza de la mezcla a separar: se señala con e vértice deltriangulo equilátero giratorio el grado de polaridad de la mezcla y los restantes vérticesindicaran el grado de actividad de la fase estacionaria y polaridad de la móvil.• 1 pentano 10 Cloroformo• 2 Éter de petróleo 11 Dietileter• 3 N- hexano 12 Acetato de etilo• 4 N- heptano 13 Piridina• 5 Ciclohexano 14 Acetona• 6 Tetracloruro de carbono 15 n-propanol• 7 Tricloroetileno 16 etanol• 8 Benceno 17 metanol• 9 Dicloroetano 18 agua
  • 6. Desarrollo cromatográficosAnteriormente, cuando se introdujeron generalidades de lacromatografía, se describieron los desarrollos frontal, por desplazamiento y por elución. Ahoraes oportuno agregar dos tipos más: Elución Fraccionada y elución gradual.Elución Fraccionada:En este desarrollo, se utilizan distintos disolventes, siendo cada unomás enérgico que el anterior. Este procedimiento permite abreviar la elución de las sustanciasfuertemente adsorbidas.Elución gradual:Si las isotermas no son lineales, dijimos que se presentan cromatogramasdistorsionados: frente difuso o colas. En el ultimo caso, se logra disminuir la magnitud de lascolas mezclando con el eluyente que se usa en la columna, otro más enérgico aconcentración gradualmente mayor. Así se establece un gradiente de concentración a lo largode la columna que hace que la parte posterior de cualquier banda o zona cromatográfica seencuentre siempre en contacto con una solución eluyente más enérgica que la parte frente.Cromatografía liquida de alta velocidadLa dificultad principal que la presenta la cromatografía liquida tradicional es la lentitud. Si losgránulos son lo suficientemente pequeños para dar una buena separación, la velocidaddecrece a unas gotas por minuto.La cromatografía de gases, presenta el inconveniente de las elevadas temperaturas de trabajoque pueden destruir la muestra, así también, limita la posibilidad de elección de las fases fija ymóvil.Es así que surge en forma muy reciente la cromatografía liquida de alta velocidad(performance) que compite muy ventajosamente en muchos casos con la cromatografía de
  • 7. gases. Para efectuar las separaciones con rapidez, el eluyente se hace pasar a través de lacolumna a velocidades lineales de flujo que pueden ser hasta 100 veces la de lacromatografía tradicional.Es de hacer notar que la eficiencia (expresada en “ATPE”) es mayor cuanto menor sea lavelocidad.Esto esta representado en la figura 4 Implica que al aumentar la velocidad, para compensaresta disminución de eficiencia, se deberán aumentar la longitud de la columna, disminuir eldiámetro y mejorar el empaque.Además, al trabajar en condiciones de alta presión, los materiales de construcción delas columnas serán más resistentes.Esquemáticamente, los componentes de un cromatógrafo de líquidos de alta velocidad eindican en el diagrama de la figura 5.-A veces se suelen sustituir el depósito y la bomba, por un depósito de presión. Lacromatografía de líquidos es especialmente aconsejable para separar proteínas y nucleósitos,que no pueden soportar temperaturas elevadas para volatilizarlos.La figura 6 ofrece un mayor detalle de los componentes de un “CLAP” o HPLCdepositoBomba InyectorColumnaDetectorRegistradorColector defraccionesMedidor deflujo
  • 8. Los depósitos Ay B están provistos de cámaras desgasificadoras que eliminan el aire disuelto.Los líquidos se mezclan (o se toman solo uno de ellos) al colocar adecuadamente la válvulamezcladora o manejar las presiones con las dos válvulas.Esta válvula puede programarse con un motor de velocidades de modo que las proporcionesde los dos disolventes puedan cambiarse durante el proceso de una separacióncromatográfica si así se desea. Luego el líquido mezclado se bombea a alta presión alcromatografo situado en una cámara a temperatura controlada. El liquido pasa primero através del tubo, que lo pone a la temperatura de trabajo y después por la pre columna cargadacon el mismo soporte sólido y la misma fase liquida estacionaria de la columna principal, paraasegurar que la fase móvil esta saturada de la fase fija, evitando así cualquier eliminación dela columna analítica. La muestra se introduce entre la precolumna y la columna principal, pormedio de una jeringa. El efluente de la columna pasa por un lado del detector diferencial haciaun colector de fracciones o bien se desecha. El material de referencia para el detector, constade una fracción del disolvente tomada de la corriente principal un poco antes de la inyecciónde la muestra por medio de una válvula divisoria de flujo.Bombas:La bomba que fuerza el líquido a pasar por la columna a una velocidad satisfactoria,más comúnmente es impulsada por un motor. Dado que los detectores usados por lo generalson sensibles al flujo, la bomba de liberar al líquido a una velocidad constante, sinpulsaciones. Una forma consiste en introducir dos cilindros y pistones programados de talmodo que uno se llene rápidamente mientras el otro se vacía en forma lenta; después, esteúltimo lleva a cabo la función de llenado mientras su compañero se vacía, y así cíclicamente.Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.Mantener el flujo libre de pulsacionesGenerar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)Control y reproducibilidad del flujo de solventeComponentes de la bomba resistentes a la corrosión Las bombas que se usan en HPLC sepueden clasificar según su funcionamiento y diseño en:Mecánicas
  • 9. RecíprocantesDesplazamiento contínuoNeumáticasColumnas:Tienen un diámetro interno de 1 a 6 mm, una longitud de 30 a 100 cm y son deacero inoxidable o de vidrio. Las columnas cortas son recetas y las mas largas enrolladas(long 600 cm). Las columnas frecuentemente operan a temperatura ambiente. La velocidad deuna difusión puede que aumentar de un poco al incrementar la temperatura, por lo que sesuele usar una camisa de calentamiento, sin embargo en “CLAP” el control de la temperaturano es tan significativo como en CGGradiente de elución:El equivalente de la programación de temperaturas usada en CG esgradiente de elución o programación del disolvente. Esto causa un cambio en los coeficientesde partición de los componentes y puede conducir a una mejor resolución. Se cambiagradualmente la composición durante el proceso de separación por medio de la válvulamezcladora programada.Existen dos métodos de programación de Solvente en HPLC:IsocráticoGradiente de Elución. Es un término que se utiliza para describir el proceso mediante el cualse cambia la composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras:A baja presiónA alta presiónPermite obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el menor tiempoposible.Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se debe tener presente dosobjetivos:Asegurar alta precisión y exactitud.Determinar la composición inicial y final del solventePara obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir 4 pasosfundamentales:a) Ajustar el tiempo del gradienteb) Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa)c) Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resoluciónd) Regresar a las condiciones iniciales la columna.Sistemas de Inyección de muestraEstos sistemas han variados durante la historia del sistema de HPLC, en un principio deutilizaba la inyección de la muestra con jeringas de alta presión cuales ya están de desuso.Hoy se utiliza el sistema de válvulas inyectorasDetectores:Se usan mas formas de detección en la de “CLAP” HPLC que en la CG ya quehay absorción de radiación ultravioleta o visible. Constan de celdas para la muestra y lareferencia en forma cilíndricas en un bloque de acero inoxidables o de teflón. Para ultravioleta,normalmente la longitud de onda de trabajo es de 254 nm ya que la mayoría de loscompuestos orgánicos absorben a esa longitud de onda. También se suelen hacer medidassimultáneas a 254 y 280 nm. Lógicamente, para una longitud más general se preferirá unespectrofotómetro que selecciones continuamente las longitudes de onda.La figura 7 da un esquema simplificado de los componentes de un detector fotométrico.
  • 10. Detectores de índices de refracción:Basados en la medida de las diferencias de los índices de la refracción hasta de una parte en106, lo que corresponde a unas cuantas partes por millón de un soluto orgánico en agua. Estemétodo no es específico. La ventaja es que pueden remplazarse disolventes cuyaspropiedades físicas interfieren con otras formas de detección.La desventaja es que no puede usarse con gradientes de elución ya que el cambio de índicedebido a la programación, transforma cualquier señal producida por los componentes eluidos.La disposición de estos detectores consiste en el desplazamiento angular de un haz de luzque pasa a través de dos prismas llenos de líquido. Si los dos líquidos son idénticos, eldesplazamiento será nulo, pero a un cambio de una cuantas partes por millón, producirá unadiferencia detectable en el ángulo del rayo.Cromatografía por filtracion molecular
  • 11. La filtración molecular (permeacion sobre gel, exclusión molecular o tamizado molecular)fracciona y separa las moléculas según su tamaño. La técnica es simple y rápida y se aplicatanto en determinaciones analíticas como con fines preparativos, siendo especialmente útilpara la separación de sustancias de origen biológico.El mecanismo de la filtración molecular consiste en que las sustancias cuyo tamaño moleculares superior al de los mayores poros de “tamiz molecular” (limite de exclusión) no puedenpenetrar al mismo, por los que pasan en el liquido a través del lecho, emergiendo en el primerorden de la columna. Las moléculas de menor tamaño, por el contrario, penetran en elanterior de las partículas de este y por lo tanto son retenidas a mayor o menor tiempo, en lafunción de sus formas y tamaños. Las moléculas que emergen de la columna siguen por lotanto un origen decreciente respecto a los tamaños moleculares.Geles:Red tridimensional formada por ligaduras cruzadas en cadenas largas de polímeros.Los geles poseen grupos polares capaces de admitir agua, en consecuencia seproduce expansión de la estructura.El grado de ligaduras cruzadas dará el límite de exclusión. Es decir el tamaño critico departículas que no pueden penetrar al interior de los intersticios del gel. Las moléculas quesuperan en tamaño crítico pisaran por la columna sin retardación.Existen tres tipos fundamentales de sustratos usados para realizar la filtraciónmolecular y que abarcan todas las moléculas desde el peso molecular de 150.000.000 hastagases inorgánicos livianos.1. Geles; 2. Vidrio molido; 3. Materiales cristalinos en polvo.1. Geles: los geles más comunes son 1-a) Extracto de agar; 1-b) polímetros acrílicos.1.a) Geles de agar: están compuestos de dos partes: gel iónico; gel no iónico. El no ionicocumple mejor la función de filtro molecular y elimina los efectos masivos cuando se usa elagar entero donde el componente iónico produce efectos de intercambio ionico, adsorción yvarias reacciones e interacciones químicas.El gel de agar más corriente usado es la forma no iónica y puede realizar una separaciónmolecular desde 10.000 hasta 150.000.000 de peso molecular. Para calibración se utilizanvirus y proteínas.Este gel se presenta en por lo menos seis porosidades diferentes correspondiente a lossiguientes limites de exclusión: 5x106; 1,5x106; 5x106; 15x106; 50x106y 150x106. Estos gelesse expenden ya preparados según la selectividad deseada y en fracciones de volumen. Unavez secados estos geles, es prácticamente imposible la reconstrucción.Estos geles de agar son estables entre pH 4 y 10. Como precaución se debe evitar lacongelación que cambia de forma irreversible sus propiedades y temperaturas superiores alos 30ª C para evitar ablandamientos. Como en los demás tipos de cromatografías, el gradode división del sustrato incide en la nitidez de la separación. Para lograr máxima nitidez esconveniente, no solo usar partículas finas, sino además procurar uniformidad de tamaño.asimismo es importante el control de la velocidad del flujo (15ml/h.cm2) y las dimensiones de lacolumna ya que inciden de igual manera que en los otros mecanismos cromatográficos.1-b) Polímero acrílicos: se utilizan para la filtración molecular en una escala de PM que abarcadesde los 200 a los 400.000 y se producen por la copolimerizacion de la acrilamida con N,N-metileno-bis-acrilamida. Este polímetro es insoluble en agua y en solventes orgánicoscomunes y se lo puede utilizar en el rango de pH entre 2 y 11.La selectividad se hace variar en función de las proporciones de los dos componentes depolímetro en forma al estireno-divinil benceno (estudiados en intercambio iónico)Estos geles se los expenden en forma seca y ante de preparar la columna es necesariodejarlos en agua algunas horas para que los geles de poro fino y días para geles mas abiertosde porosidad.Para partículas aproximadamente esféricas, volumen de líquidos entre las mismas, en unacolumna, corresponde al 40% del volumen total de la resina con el líquido en la columna. Estevalor puede variar entre 35 y 45% según el grado de comprensión, el tamaño de las partículasy la uniformidad del empaquetado:Según la figura 8:
  • 12. Vol. de partículas: Vol. 8 esferas 8(π d3/6)Vol. total de partículas+ liq.= vol cubo 8 d3Vol de liq. Intersticial : 8 d3 -8(π d3/6) = 22.88 d3/6Vol Total 8 d3-----------------100%Vol. liq. 22.88 d3/6------------ 48%Cuidados: durante el uso y almacenaje de las resinas y geles de toda clase, es necesariotomar medidas para prevenir la descomposición de las mismas por microorganismos,especialmente durante las temporadas de calor.Debido que la mayoría de las resinas y geles no pueden ser desecadas, después depreparadas, debe recurrirse la refrigeración o al agregado de algunas sustancias para prevenirel crecimiento microbiológico, las que no deben interferir con el sustrato, los eluctantes o lasmuestras. Para el uso general se recomienda la azida (N3 Na) sçodica en una concentracióndel 0,02% para conservar las resinas y geles. A veces se nota una alta de nitidez en lasseparaciones cromatograficas, especialmente inexplicable para el caso de columna dediámetros menores de un centímetro. Esto puede ser causado por el escurrimiento desolvente por las paredes de la columna lo que significa que este no pasa por el sustrato y saletal cual con el eluctante. Para subsanar esta situación se puede cubrir la pared interior de lacolumna con una sustancia repelente al agua como el dimetil di cloro ailano.2.Vidrio molido:El uso de vidrio en polvo es muy útil debido a que se puede hacer con porosde tamaño muy controlado entre 20 mµ y 250 mµ. Se fabrica este vidrio silicatado, rígido, nocomprimible y con una red tridimensional de poros interconectados y de cinco tamañosdistintos:20;50;100;150 y 250 mµ. Las propiedades del vidrio confieren al mismo muchascaracterísticas útiles para su utilización en cromatografía. La estructura rígida permitevelocidades de flujo muy alto y las columnas pueden usarse prácticamente en cualquierposición.Otra ventaja es la de poder esterilizar este material de autoclave y destruir la contaminaciónorgánica con acido nítrico caliente.El vidrio poroso es muy útil para separar los virus entre si y de moléculas orgánicas, de menorpeso molecular.Se usa el vidrio para separar el tolueno del metiliciclohexano y benceno de ciclo hexano.Además se puede eliminar el agua de acido acético y propionico. Como otros materiales devidrio, estos funcionan como intercambiadores débiles de cationes, donde los iones hidrogenosirven de grupos activos.3. Materiales cristalinos en polvo:Son verdaderos coladores moleculares que permiten laseparación de moléculas chicas con alto grado de selectividad. Los más conocidos son laszeolitas.Descripción: figuras 9 y 10 son las representaciones de la denominada “jaula sodalita” que esel tipo más representativo de zeolita.
  • 13. Fig 9Los tamices moleculares (en sentido original) son aluminosilicatos metálicos cristalinicos conuna estructura tridimensional de una red interconectada de tetraedros de sílice y alúmina. Lostetraedro están formados por cuatro átomos de oxigeno rodeando simétricamente a un átomode silicio o de aluminio. Cada átomo de silicio tiene cuatro cargas positivas mientras que elaluminio tiene tres. Esto significa una descomposición eléctrica que hace esta estructura ávidade cationes para separar tal equilibrio. Es por ello que en estas estructuras existen cationessodio, potasio, calcio, esto e hacen de balanceadora de cargas: estas circunstancias leconfieren a las zeolitas propiedades de intercambio iónico y además posibilitan la construcciónde una cantidad de tamices moleculares muy selectivos.La selectividad esta basada en la relación Si/Al y del tamaño de los cationes compensadoresexistentes. En particular, la jaula sodalita esta constituida por octaedros con centros de Al ytetraedros con centros de Si o Al. Estas estructuras están orientadas en forma cúbica con unared de variedades de diámetros aproximadamente de 11,5 Å y accesibles por aberturas enlas seis caras , Estas aberturas están rodeadas por ocho de oxígenos. Uno mas cationesintercambiables bloquean la entrada a los intersticios. En la forma sódica, este anillo de ionesOxígeno, provee una abertura de 4,2 Å de diámetro.La formula bruta de la jaula sodalita es: Na12 ((Al02)12)(SiO2)12) xH2O donde X representa elnumero de moléculas de agua que participa en el cristal. El agua de hidratación que llena lacavidades durante la formación del cristal, esta ligeramente ligada y puede ser quitada con unmoderadocalentamiento que afecte la estructura del cristal. La forma sódica del tamiz molecular tieneaberturas de aproximadamente entre 4 Å de diámetro; la potásica, 3 Å ;la cálcica 5 Å.según el tratamiento de quitar el agua, con o sin reemplazo con gas u otro liquido,intercambiando el sodio por otros cationes y/o modificando la estructura cristalina, se puedelograr una variación de porosidad entre 3 y 11,5 Å .A ciertas temperaturas se nota la adsorción de moléculas con diámetros críticosmás grandes que las aberturas efectivas de las zeolitas. Este comportamiento sedebe a una combinación de la elasticidad de la molécula absorbida y a lavibración de la estructura del cristal como a la movilidad del catión bloqueador(fig.11).
  • 14. Sin embargo las dimensiones de los poros y de las moléculas son una buena guía orientadoracuando uno quiere elegir un tamiz para una separación específica.-Las zeolitas constituyen un sistema de adsorción en donde la cantidad del material adsorbidoaumenta rápidamente a medida que aumente su concentración en la fase fluida, llegando alequilibrio, un aumento de concentración no produce ningún cambio en la cantidad de materialde adsorbido por el tamiz molecular.Las técnicas cromatográfica son similares a las ya vistas anteriormente.Aplicaciones:1- se las usa para la eliminación de sales de soluciones donde haymacromoléculas.2- Para la concentración de soluciones diluidas de macromoléculas utilizando lanaturaleza higroscópica de los geles secos: se puede adsorber 20 veces su peso de agua.3- Para fraccionar moléculas de diferentes pesos moleculares (proteínas,péptidos, ácidos nucleicos, polisacáridos, enzimas y hormonas)4- Para eliminar la humedad del aire5- Se la usa para la determinación de pesos moleculares, ya que el volumen deelución es proporcional al logaritmo del peso molecular. De tal manera, si podemos dibujaruna curva de calibración de proteínas de peso molecular conocido, podrá conocerse el pesomolecular de proteínas de una muestra problema (esto es de gran valor en enzimología).En cromatografía de filtración molecular, son validos los desarrollos teóricos ya vistos, desdeque se puede definir una constante de distribución Kd entre 2 fases: Disolvente interior-Disolvente exterior de poro. Kd es función del p.M. de la sustancia y del tipo de gel que seuse. Para moléculas de gran tamaño que no pueden penetrar en los poros Kd=0 y paramoléculas e iones de pequeño tamaño con acceso totalmente libre a los mismos, Kd=1. Entreesos limites Kd varia en proporción al peso molecular.Molécula Diam Crit Molécula Diam. Crit.He 2,0 Etanol 4,4H2 2,4 Metanol 4,4O2 2,8 Propano 4,9CO2 2,8 1-3Butadieno 5,2N2 3,0 Butano 5,6H2O 3,2 ciclohexano 6,1NH3 3,6 Benceno 6,7CH4 4 Tolueno 6,7C2H6 4,4 CCl4 6,9
  • 15. El volumen de elución Ve de una sustancia depende del volumen exterior Vo y del productoKd. Vi, donde Vi es el volumen de disolvente en el interior de los gránulos del gel:Ve=Vo+Vi.KdSi dos sustancias poseen coeficiente de distribución Kd´y Kd´´ en un determinado tipo de gel,su volumen de elución difieren en el llamado volumen de separación Vs que viene dado por laecuaciónVs= (Kd´-Kd´´).ViPara conseguir la separación completa de dichas dos sustancias, el volumen de la muestradebe ser inferior al Vs.La concentración de la solución problema no desempeña ningún papel de importancia en lafiltración por geles, excepto en el caso que haga aumentar la viscosidad de la solución. Aviscosidades elevadas, ladifusión se reduce de tal modo que queda impedido el intercambio entre las fases móvil yestacionaria. Dado que el proceso de distribución se realiza con una velocidad finita, los picosde elución resultan más agudos y definidos si se trabaja con geles de partículas pequeñas y avelocidades de flujo también pequeñas.
  • 16. CROMATOGRAFIA EN UNA Y DOS DIMENSIONESOriginalmente usada por los antiguos romanos para probar colorantes y pigmentos. Cuandose coloca una solución con varios pigmentos sobre un trozo de papel o tela, se puedenproducir anillos concéntricos con los distintos colorantes. Sin embargo esta técnica no fuedesarrollada mas allá de una simple prueba.En 1944, Martin desarrollo la técnica de la cromatografía en papel de filtro, en donde lahumedad en el papel hace de fase estacionaria.Esta técnica en pocos años se difundió extraordinariamente debido a todas las ventajas queella presenta. Llegando a un punto donde se ha logrado separar una parte de la componentede una célula sobre una sola fibra. Posteriormente, Stahl introdujo mejoras a esta técnica conla cromatografía de capa delgada (TLC). Esta última es mas versátil ya que permite utilizarliteralmente cualquier sustrato fijado sobre una placa de vidrio en una película o capa delgada.La colocación de muestras, desarrollo y revelación, es prácticamente el mismo tipo deoperación que el de cromatografía en papel. Ambas técnicas, además de su simplicidad,presentan dos ventajas sobresalientes sobre las técnicas de columna:1º_ Se pueden analizar muestras de una gama (ug) o aun menos, según lasposibilidades practicas de la detección.2º_ Es más fácil y en muchos casos ventajoso utilizar las propiedades eluctivas dedos o mas solventes para separar los componentes de una muestra y además se puedenprocesar en forma simultánea varias muestras.Fundamentos de la Cromatografía Plana .Las bases teóricas de la cromatografía a columnason validas para la cromatografía plana. La diferencia es principalmente geométrica y nofuncional en el sentido de la separación.Los mecanismos de partición y de plato teórico son mas fáciles de visualizar en una columnaque en una hoja de papel.Lo esencial es que tanto en cromatografía plana como en la de columna, el proceso esdebido a equilibrios continuos y sucesivos a medida que pasa la muestra con el eluctantesobre el sustrato.En cromatografía de columna, vimos que la nitidez de la separación es función del volumen otiempo de retención de las distintas fracciones separadas.
  • 17. En cromatografía plana el grado de separación seexpresa en función del movimiento de cadacomponente desde el lugar de siembra, relativo almovimiento del frente del solvente a partir del mismopunto de siembra.Surge así el concepto de Rf (relate to front)Rfa=a/ r ; rfb =b/ r ; etc.La medida de los Rf representa dificultades ya que acausa de la difusión, los componentes semanifiestan como muchas no puntuales.Es así que cuando se informan lo distintos Rf, se debeaclarar la forma de mediad. Si la mancha essimétrica; se considera el centro de la misma.Otra forma es, considerar el punto de la marcha de másconcentración (mas intensa coloración). Si losproblemas difusionales son notables, se desdobla el Rfen un Rf de cabeza que considera el borde superior (si escromatografía ascendente)Y un Rf de cola que considera el borde inferior de lamancha (si es ascendente).Al igual que en cromatografía de la columna, en donde los volúmenes o tiempo de retención sibien pueden orientar a los fines de identificación dependen de las características de las fasesen contacto y otras condiciones que resultan difíciles de reproducir, por lo que se introducenlos volúmenes o tiempos de retención relativos a una referencia, que si se mantienenconstantes a una temperatura y en una fase estacionaria dad, cuales quiera que sean lasdemás condiciones operatorias; en cromatografía plana los Rf no dan seguridad a los fines dela determinación cualitativa, por lo que se introduce el Rx, que es la relación entre los Rf de lasustancia a determinar y de una referencia: Rx= RFa/RFx= a/ x (lo que avanza “a” con respectoa lo que avanza la referencia “x”).Cromatografía de papel:Se usa un papel de celulosa purificado y de característicasuniformes, de calidad semejante a la del papel de filtro.La celulosa es un polímetro con varios miles de glucosas unidos a través de puentesde oxigeno. Teóricamente deberían existir tres grupos OH por glucosa, pero una buena partede estos han sido oxidados durante la elaboración del producto a grupos aldehído, cetona oCOOH. Además el papel contiene trazas de impurezas incluyendo cationes inorgánicos quefuncionan como cationes intercambiables, sales absorbibles o materia mineral que queda enel papel durante el proceso de fabricación.La celulosa tiene gran afinidad por el agua y otros solventes polares y los retiene congran tenacidad. Estos solventes penetran en las fibras y producen hinchamiento en el papelcambiando sus dimensiones. El papel puede adsorber mas del 20 % de su peso en agua, sinparecer húmedo. De la cantidad de agua adsorbida sobre las fibras dependen los distintos Rfy otros efectos diversos sobre la misma partida de papel.Así el papel con poco o nada de agua separa cromatograficamente por adsorcióndiferencial los distintos componentes, pero con un máximo de agua adsorbida, la separaciónes por partición.Se puede mejorar la selectividad y calidad de la separación cromatografía e en elpapel, impregnando las fibras del mismo con diversas sustancias como azúcar impalpable,alúmina, MgO, silica gel, etc.
  • 18. Procedimientos experimentales:La diferencia mas grande entre la cromatografía en columnay la plana que esta ultima debe transcurrir en un recipiente cerrado casi herméticamente, conuna atmosfera saturada con los vapores en equilibrio con el solvente usado con eluctante.Esta consideración es necesaria para que el eluctante no se seque sobre el papel o placadurante el desarrollo de cromatogramas.Las dimensiones del recipiente pueden variar desde las de un tubo de ensayo hastauna vitrina. La temperatura no es un factor muy crítico dentro de los valores normales. Enalgunos casos es conveniente trabajar a bajas temperaturas, en otras, a temperaturarelativamente alta para favorecer la separación o prevenir la descomposición de algúncomponente de la muestra.Los pasos a seguir son los siguientes:Se coloca una gotita carca del borde del papel que se sumerge en el solvente eluctante (0,5cm por arriba del nivel del solvente eluctante). El volumen del liquido con la muestra debe sermínimo para que sea mas nítida la separación y neutralizar la tendencia de difusión de lamuestra durante el desarrollo, la que tiende a aumentar la superficie de las manchas que seforman durante la separación.Los elementos que se requieren son: un soporte para papelUn recipiente para solventeUna cámara cerrada.Con respecto al sentido de la circulación podemos distinguir una cromatografía ascendente ycon una descendente.En la primera la siembra de la muestra es enla parte inferior. En la segunda en la parte superior.El eluctante sube o baja por capilaridad y lleva losdistintos componentes con velocidades variablesque dependen de la naturaleza de componenteespecifico y del eluctante. Si es necesariodeterminar los Rf de las distintas fracciones aisladasen el cromatogramas, se coloca una marca con unlápiz en la orilla del papel a la altura de la manchamuestra antes de empezar el desarrollo delcartograma. Cuando el frente llega casi hasta elborde superior del papel, se saca del recipiente ocámara y se seca rápidamente con calor suave a laestufa, indicando antes con lápiz la altura alcanzadapor el liquido. Al secar el papel se ubican lasmanchas formadas y se coloca una marca con lápizen el mismo borde del papel a la altura de las distintas manchas.Es conveniente colocar junto a la mancha de muestra, otra mancha patrón quecontenga los componentes que podrían estar presentes en la muestra.De esta manera la identificación se puede realizar independiente de posibles variaciones deRf porque se trabaja en idénticas condiciones.Para realizar un cromatogramas en dos dimensiones, se coloca la muestra cerca de unaesquina de un papel cuadrado y se desarrolla con el primer solvente, se seca y se realiza elsegundo cromatogramas dando vuelta el papel 90º y usando otro solvente.
  • 19. Cromatografía radial:Puede ser circular o elíptica. En el primer caso, se siembra en el centrode un pepe circular apropiado (Wathman Nº1). Se agrega el eluctante con una mechaalimentada por capilaridad. Los distintos componentes de la muestra se desarrollan encírculos concéntricos.La cámara hermética es eliminada, colocando el papel entre dos hojas de vidrio. Elvidrio superior debe tener un agujero en el centro para proveer el eluctante con una mecha.Para los mejores resultados con esta técnica es necesario tener en cuenta la afinidad entre eleluctante y el vidrio. Si hay mucha atracción entre el vidrio y un liquido, este escurre sobre lasuperficie del vidrio y arrastra la muestra no cromatografía. Este efecto se acentúa con lossolventes polares y se puede eliminar cubriendo con una película de “agua repelente” comoser la parafina.Las ventajas de la cromatografía circular son:1º) Rapidez (no mas de 2 horas)2º)Separaciones nítidas. Esta técnica tiene mayor resolutivo porque al distribuirse en anilloshay una disminución del ancho del anillo a medida que aumenta el radio.3º) Revelador simultáneos. El papel puede cortarse en sectores y revelar cada uno de elloscon un revelado diferente.4ª) Por esta técnica se pueden procesar distintas muestras, sembrando en un circuloconcéntrico próximo al centro. O sembrar la muestra y una serie de sustancias de rederencia.Cromatografía elíptica:
  • 20. Caso particular de la cromatografía circular. El solvente asciende haciael disco de papel por un trozo del mismo papel que ha sidocortado ex profeso en forma radial.El frente del solvente avanza en forma elíptica.Desventaja los radios varia en las distintas direcciones.Cromatografía acelerada:Consiste en aumentar la velocidad de recorrida del solvente sobre elpapel por efectos de aplicación de una fuerza centrifuga.Se cortan tiras de papel y se colocan en formaradial en un plato de centrifuga con los puntos desiembra hacia el centro. Estas tiras son prensadasdébilmente con un disco de vidrio que se fija al plato de lacentrifuga.Por desbordamiento:Caso particular de la cromatografía descendente. Se la aplica para elcaso en que los componentes a separar tengan Rf muy próximos. La diferencia es que elsolvente cuando llega al extremo de la tira de papel se lo deja fluir libremente.Es por ello que es imposible el calculo de Rf y entonces de define el RxDeteccion de las manchas desarrolladas en el cromatogramas:Si las manchas separadas no tienen un calor inherente, se pueden tratar con reactivosque producen un contraste entre la mancha y el resto del papel (coloreando selectivamente elpapel) o que producen visibilidad de la mancha por calor del producto de la reacción.Técnicas mas comunes para la detección:1º) – exposición de las manchas a los vapores de iodo elemental. Revelado poco selectivo,visto que casi todos los componentes orgánicos reaccionan con iodo para formar uncompuesto con un color que puede variar desde amarillo claro hasta un color violeta o azul.2º) – colores producidos por la oxidación o reducción de la mancha por los correspondientesreactivos: HNO3,K2MnO4, AgNO3, quinhidrona, hidracina, amoniaco, glucosa, agua oxigenada,bromo, etc. En distintas condiciones de temperatura, pH, solventes, etc.4º) –absorción de la luz ultravioleta o infrarroja
  • 21. 5º) –Reacción del componente aislado con reactivos específicos que producen una sustanciacoloreada. Por ejemplo la ninhidrina reacciona con los aminoácidos produciendo varios tonose intensidades de azul y violeta:6º) –acompañar la muestra con algunos de sus componentes sintetizados con átomosradioactivos en la molécula en lugar de los correspondientes átomos normales.7º) –autobiografía: colocar al cromatogramas en medio solido sembrado con microorganismoscuyo aumento o descenso en la velocidad de crecimiento indique la identidad y concentraciónde sustancias tales como antibióticos, vitaminas, hormonas, etc.En cromatografía de capa fina, un reactivo de aplicación general (incluido en el caso3º) es el permanganato potásico acido sulfúrico que oxida hasta la vaselina y la reacciónpuede servir para la comprobación de toda clase de hidrocarburo.Valoración cualitativa:Anteriormente dijimos que una forma de identificación es mediante lamedida de los Rf o mejor aun de los RxEl hecho de que dos manchas den iguales valores de Rf, no da seguridad sobre siambas corresponden al mismo soluto. Por ello se recurre a la “espectogramatografía” queconsiste en la media de los Rf de un soluto dado unos distintos solventes (por lo general 10 o15 solventes). Posteriormente se grafica Rf vs Nº de solvente.Esta grafia si es característica del soluto incógnita.Cuando se trabaja en técnica bidimensional,no es posible determinar un valor de Rf. En este casose hace un uso de plantillas de referencia, es deciruna mezcla de los solutos que presumiblementeestán presentes en la muestra. Se efectúa unacromatografía bidimensional, se revelan las manchasy se coloca el cromatogramas sobre un papeltransparente y luego la solución problema se corresobre un papel del mismo tipo y en igualescondiciones de trabajo, se revela y se coloca laplantilla sobre el cromatogramas. La coincidencia de manchas corresponderá a un solutodado.Cuando se sospecha cuales son los componentes de la muestra problema, se puedensembrar junto a la mancha correspondiente, los posibles componentes. Al final del desarrollo yrevelado, igual coloración y posición implica la existencia de ese soluto en la muestraproblema.Valoracion cuantitativa:
  • 22. Un método consiste en hacer correr en forma simultanea con el solutoa valorar una serie de soluciones que contengan cantidades crecientes y conocidas del mismosoluto, seleccionada de tal forma que la concentración incógnita se encuentra comprendidadentro de los valores extremos de la escala. Una semejanza en el tamaño de la manchacorresponderá a cantidades equivalentes del soluto.La apreciación puede ser visual, como un alto grado de erros (15%) o bienapoyándose en la relación que existe entre lasuperficie de la mancha y el logaritmo de laconcentración. Sedemustra que la relacios eslineal por lo que si se grafica superficie vs log C,se obtiene unas series de rectas tal que paralas mismas operativas cada una de ellascorresponde a un soluto distinto, o bien para unmismo soluto, cada recta representa unacondición operativa diferente.Otra técnica cuantitativa es la elución de lasustancia. Se corta la zona del papel dondeesta retirada la sustancia y mediante el uso de un reactivo apropiado (disolvente) o calcinandoel papel, se extrae el componente, llevándolo a solución y haciendo uso de un reactivo seprovoca una reacción de calor y así se puede averiguar la cantidad de soluto original midiendola absorbencia de la solución.Densitometria:Para ello se hace uso de un densitómetro que es un equipo que tiene unafuente de radiación, un sistema de filtros coloreados (para aislar una banda del espectro). Unaranura generalmente fija, un sistema fotosensible que se usa como un detector y un sistemade engranajes que permite el arrastre de la tira de papel haciéndola pasar a una velocidadconstante sobre la ranura, la tira es transparentada y las manchas son reveladoras. Eldensitómetro esta acoplado a un sistema de registro automático que grafica distanciarecorrida por la tira de papel vs una cierta señal de desbalance del detector. La curva esaproximadamente a una gausiana y el área esta relacionada con la cantidad de soluto en lamarcha.Cromatografía en capa delgada (T.L.C)Los fundamentos teóricos de la TLC son los vistos para papel y columna.La diferencia son operativas. La TLC presenta ventajas frente a la cromatografía de papelcomo se mencionan el la tabla adjunta. Consiste en impregnar una placa de vidrio, plástico oaluminio con un con un adsorbente apropiado espesor adecuado (250 micrones por logeneral). Luego de un tratamiento a la capa así formada, de secado y activación, se siembrala muestra con una micro pipeta, micro capilar o jeringa a 1,5 cm del borde inferior de la placa.Se evapora el disolvente portador de los solutos a separar y se ubica la placa en una cámaracerrada la cual se llevara a cabo la cromatografía correspondiente gracias a un solvente(eluyente) presente en el fondo de la cámara, hasta una altura de 0,5 cm aproximadamente, yque satura la atmosfera de la misma. El eluyente asciende por la capa superando la manchade origen.asi los diversos solutos se desplazas a velocidades características. Gracias amecanismos de adsorción, partición, filtración molecular e intercambio iónico. Una vez que elfrente del solvente alcanza un nivel apropiado, se saca la placa de la cámara, se seca, se
  • 23. revelan los componentes de la/s muestras por procedimientos ya descriptos en cromatografíade papel. Determinados sus RFy/o Rx, luego se evalúa cuantitativamente por procedimientosya vistos en cromatografía de papel u otros que luego se indicaran. Si es necesario se“documenta” el cromatogramas.Sustratos usados:Se usan los correspondientes al tema a tratar de acuerdo al diagrama“circulo-triangulo”. Los mas apropiados figuran el la tabla adjunta (“adsorbentes para TLC”):silicagel, alúmina, poliamida, celulosa microcristalina, florisil, cleulosa nativa. Se observa quejunto al adsorbente figura la letra G, o bien H, F y en algunos casos el numero 254 (estacodificación corresponde a los productos Merck). G indica la presencia de yeso enaproximadamente un 10% que tiene como misión la de aglutinar. H indica la no existencia deyeso ni aglutinantes orgánicos. De esta manera, al exponer la placa a la acción de la luz UVaparecen como manchas opacas en un fondo fluorescentes el aquellos solutos que adsorbenla luz U.V. por supuesto habrá que especificar la longitud de onda: 254 y/o 366. En caso deusar luz U.V se aconseja proteger la vista de tales radiaciones nocivas. De tal manera que siel adsorbente aconsejado es sílicagel GF 254 + 366 significa que se usa sílicagel con yeso yreactivo de fluorescencia en las longitudes de onda 254 y 366 nm.El aglutinante también funciona como sustrato cromatográficos y es importante esto cuandose lo usa con sustancias de poica polaridad como celulosa en polvo o tierras diatomeas. Si oefecto del aglutinante resultare nocivo se puede recurrir a uno menos polar o bien reducir laconcentración del mismo.Preparación de las placas:Existen diversos caminos que se clasifican en: Inmersión,asperjado, extensión y vertido.Inmersión: se agita enérgicamente durante 3 minutos una mezcla de 35 g de silicagel G y 100ml de cloroformo en un matraz de erlenmeyer cerrado. Se sumergen dos placasdesengrasadas y superpuestas en la suspensión, luego se sacan lentamente. Después deescurrir, se separan y se evapora el disolvente.Luego se pasa vapor por agua sobre las capas para que fragüe el yeso.Asperjado: se puede llevar a cabo recubrimiento con el uso de spray comerciales pero launiformidas de la placa depende de la habilidad del operadorVertido: requiere más tiempo, trabajo y es menos económico que el procedimiento porextensión. Se vierte rápidamente la suspensión en su totalidad y se reparte lo mas uniformeposible, inclinando ligueramente la mono. Luego se seca en posición horizontal.Extensión: es el medio más conveniente y enconsecuencia más explotado. El equipo básicodiseñado por Stahl es el más usado. Mediante elmismo se pueden lograr películas de 0,25 mm deespesor. Las placas miden aproximadamente 5 x20 cm, 10 x 20 cm, 20 x 20 cm; en algunos casoses importante controlar perfectamente el espesorde la placa de vidrio.
  • 24. El equipo posee tres partes.Un cilindro metálico rotable, un bloque metálico dentro del cual se coloca el cilindro una tapaque abre o cierra el cilindro. El aplicador vacio se mueve a lo ancho de la placa de izquierda aderecha para asegurar que esta bien alineada la placa. El cilindro presenta una aberturalongitudinal que inicialmente esta la parte superior y a través de la cual se lo llena con elsustrato en suspensión. Mediante un brazo, se rota un cilindro 180º de tal forma que laabertura quede hacia abajo. El bloque metálico previamente ha sido regulado para fijar elespesor de la copa, mediante una perilla y una escala. Se mueve lentamente el aplicador y avelocidad constante. También existen aplicaciones que varían constantemente el espesor.(Dando un gradiente de espesor).El equipo Shandon, es semejante al ya descripto. Posee una plataforma que permite lograruna superficie totalmente plana de las placas de vidrio, aun cuando estas no posean el mismoespesor. Esta plataforma en la parte superior tiene una chapa metálica que es presionada poruna bolsa de goma mediante cilindros indispensables. El implicador es simplemente una“caja” metálica abierta en las caras superior e inferior. Una de las caras laterales mayores esmóvil y regulable mediante tornillos, de tal manera que insertando una planchuela de espesorconocido en la parte inferior de la caja la cara lateral móvil apoye sobre la misma.

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