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APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESCaracterísticas ideales de un biosensor• Alta sensibilidad (ppb / ng mL-1)    • Alta...
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APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES     Plegamiento de los Aptámeros(Estructuras terciarias; Señal: Fluoróf. / MTC)    ...
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES                  Transducción                                         II. III y IV....
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES   Transducción de masa (I)                                         • Efecto piezoel...
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES             Transducción de masa (II)Flexible micro-cantilevers (2004)Interferometr...
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Resonancia de Plasmón Superficial (SPR)                                            ...
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESAptasensores de fluorescencia (FP)                                               Fib...
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APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptasensores: sandwich / competitividadSandwich:                                   ...
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES     Espectroscopía de Impedancia e-             • No etiquetado (difus. externa)   ...
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES            Electrochemical aptabeacons                                             ...
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESAptasensor electroquímico de OTA (ejemplo)  Determination of OTA in wheat flour  DPV...
APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES                        Aptasensores: ejemplos• Factor Xa (p-Thbr=>Thbr)            ...
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J.C Vidal - Uso de aptámeros en biosensors

  1. 1. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESUso de aptámeros en biosensores Juan C. Vidal Aptámeros 8 -Marzo- 2.011
  2. 2. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESUso de aptámeros en biosensores ÍNDICE SELEX, Transd.+Rec., vs Ab,I. Aptámeros y Biosensores : Spielgelmers, PlegamientosII. Transducción de masa : ● QCM ● AFM ● SPR ● FluorescenciaIII. Aptasensores ópticos : ● Aptabeacons ● MicroarraysIV. Aptasensores electroquímicos : ● Voltametría ● EIS Índice
  3. 3. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESBIOSENSOR I. Aptámeros y Biosensores
  4. 4. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESCaracterísticas ideales de un biosensor• Alta sensibilidad (ppb / ng mL-1) • Alta selectividad• Alta fiabilidad • Tiempo vida largo• Bajo coste • Tiempo corto análisis• Pretratamiento muestra innecesario • Manejo sencillo• Tiempo real • Portátil• Automatizable • Miniaturizable• Pequeño requerimiento operativo • Capacidad de multi-análisis I. Aptámeros y Biosensores
  5. 5. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Biosensores analíticos • Ópticos BIOSENSORES • Electroquímicos• Catalíticos (enzimas) • T. Masa (QCM)• De afinidad (aptámeros, anticuerpos, DNA, Receptores, tejidos, MIPs…) Transductor Bioreactivo inmovilizado Biosensor: Transductor + Elemento de bio-reconocimiento selectivo I. Aptámeros y Biosensores
  6. 6. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESSelección de aptámeros: SELEX Aptámeros (DNA o RNA) o SELEX convencional (1990) o SELEX mejorado (ej. CE-SELEX) o SELEX automatizado (1998) (Librería combinatoria inicial 1013-1015 OLN; In-vitro transcription; modific. quím.; Selecc. negativa;Post-SELEX) Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment I. Aptámeros y Biosensores
  7. 7. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptámeros vs. Anticuerpos Aptámeros AnticuerposAfinidad μM - pM μM - pMEspecificidad Alta AltaSíntesis In-vitro In-vivo (inmunización)Dianas Moléc. tamaño grande-peq. Moléc. con inmunorespuestaRéplicas Misma molécula (síntesis) Variaciones (pAb)Modif. química Sencilla / Afinidad LimitadaDesnaturalización Reversible IrreversibleTiempo de vida Largo Limitado5-25 kDa Nucleasas, pleomorfismo, simplicidad vs150 kDa Tamaño 6X: accesibilidad L, difusionabilidad, cinética (superf. sólidas), nº L inmovilizados, FP / EIS / SPR, Arrays I. Aptámeros y Biosensores
  8. 8. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Spiegelmers / Aptámeros modificados Nucleósidos modificados (1994<) (no reconocidos por nucleasas). Post(Pre)-SELEX.• “Mirror-image aptamers” (1996<)• Síntesis de L-nucleósidos (en lugar de D-enantiómeros)• Mínima toxicidad e inmunogenicidad Noxxon Pharma AG I. Aptámeros y Biosensores
  9. 9. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Plegamiento de los Aptámeros(Estructuras terciarias; Señal: Fluoróf. / MTC) • Especificidad • Espaciadores • Disoluc. reguladoras • Iones • Regeneración Estabilización: puentes de H, hidrofobicidad, atracciones iónicas, interacciones dipolares (Van der Waals)
  10. 10. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Transducción II. III y IV. Transducción
  11. 11. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Transducción de masa (I) • Efecto piezoeléctricoQCM • NO ETIQUETADO (t. real) • f0 ~ 5 MHz, 10 MHz S ~ 0,5 nM (3 ng cm-2), IgG, Regenerac. (2002) II. Transducción de masa
  12. 12. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Transducción de masa (II)Flexible micro-cantilevers (2004)Interferometría (“surface-stress” Apts >> Abs)3-32 nm differential bending (Gold)2x (referencia – ads. inespecífica)Ej.: hepatitis HVC virus helicase (100 pg mL-1) 50 x 150 μm AFM S ~ 1-100 nM Thbr II. Transducción de masa
  13. 13. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) Sistemas de flujo (Biacore) SPR ~ 10 pg/mm2 QCM ~ 1 ng/mm2 Kd (afinidad) Afinidad (y cinética) aptámero-diana en tiempo real, sin etiquetado (2001) III. Aptasensores ópticos
  14. 14. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESAptasensores de fluorescencia (FP) Fibra óptica-avidina+bi-RNA-Apt, L-adenosina (μM) (1998) • Anisotropía fluorescente: F. luz Polarizada • Tamaños Ab-Apt => cambio difusión rotacional, onda evanescente • Etiquetado fluorescente del aptámero • Gran sensibilidad (LOD 0,7 amol ThBr, 3 órdenes magnitud; 10 min.) • También cinética y Ka´s (en disolución, no immovilizados) III. Aptasensores ópticos
  15. 15. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptamer microarrays Lisozima + HIV + Ricina (glass-slides) (LODs 320 ng mL-1) (Ellington, 2004) • Spotting” • Multianalito (1998, FP) • Somalogic (LOD 10 fM) • FP (fibras ópticas) • Bi-Apt + av-agarosa III. Aptasensores ópticos
  16. 16. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptamer molecular beacons - FP F*-Q* Aptabeacon: F*-Apt-F*(Q*) (hairpin) (1996) • Versatilidad frente Ab’s • Composición disoluciones • En disolución (no inmovilizac. Apt) F*-F* • No regeneración FRETMayor sensibilidad(ej. thrombin pM) (TBA, 2002) Cocaine (dye displac.) III. Aptasensores ópticos
  17. 17. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptasensores electroquímicos Desplazamiento ELAA (<1 nM) (2005) TBA (CNTs) (*): enz., MB, NPs •S~20-200 mM (LOD ≤ 1 nM)•DPV, CRA, SWV, LSV, …•EIS IV. Aptasensores electroquímicos
  18. 18. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptasensores: sandwich / competitividadSandwich: Competitividad o desplazamiento:=> necesidad de 2º Apt*/Ab* y epitopo => Necesidad de Ag* • Conjugaciones previas ELONAs (~ ELISAs) • No influye el cambio conformacional (3D) • Ensayo directo o indirecto (o sobre MBs) LODs ~ 0,5 pM IV. Aptasensores electroquímicos
  19. 19. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Espectroscopía de Impedancia e- • No etiquetado (difus. externa) • Sensibilidad (Ab’s) • Modulac. carga Apt.(-) • IgG (Ferric.), hairpin, (2-100 nM, LOD 0,1 nM) EIS (2005) • Medida rápida (10-90 min.) IV. Aptasensores electroquímicos
  20. 20. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Electrochemical aptabeacons •Etiqueta electroquímica (mediador) •Regeneración (immovilizac.) •“Reagentless” (as SPR, QCM) •No “contaminación óptica” •Cuádruple / helix-junction •Grandes cambios conformac. (Prot.)Ejemplos:TBA, 15 mesh, MB, DPV, nM-μM, G-quad. (2002)Cocaína, MB, 3-stem, DPV, LOD 10 μM (2006) Señal ON / Señal OFF IV. Aptasensores electroquímicos
  21. 21. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORESAptasensor electroquímico de OTA (ejemplo) Determination of OTA in wheat flour DPV LODs: 0,10 ng mL-1 OTA UE < 3-5 ppb´s IV. Aptasensores electroquímicos
  22. 22. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptasensores: ejemplos• Factor Xa (p-Thbr=>Thbr) Cocaína (500 μM)• 2 Apt* (FM - híbrido) Platelet PDGF• LOD 50 pM (3-way-juntion) Aplicaciones Aptasensores: Drogas, proteínas, peq. molec., Thrombina, fact. coagulac., Vit. B12, Aminoácds., Citoquinas, fact. crecim., IgG, toxinas, HIV, Bi/Av, Dip-stick assays (ej. embarazo, micotoxinas) NPs (CNTs, QDs) IV. Aptasensores electroquímicos
  23. 23. APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES Aptasensores (inmunosensores) electroquímicos: Prof. Juan R. Castillo (GEAS – Chairman) Prof. Juan C. Vidal (GEAS) Lcda. Alba Ezquerra (GEAS) Dra. Laura Bonel (Capher IDI SL) Lcda. Susana Hernández (Capher IDI SL) Gracias por su atención !!

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