• Share
  • Email
  • Embed
  • Like
  • Save
  • Private Content
Paper การแยกแบคทีเรียแลคติกที่สามารถผลิตแบคทีริโอซินจากผัก ผลไม้ และธัญพืชหมัก
 

Paper การแยกแบคทีเรียแลคติกที่สามารถผลิตแบคทีริโอซินจากผัก ผลไม้ และธัญพืชหมัก

on

  • 3,285 views

 

Statistics

Views

Total Views
3,285
Views on SlideShare
3,285
Embed Views
0

Actions

Likes
1
Downloads
26
Comments
0

0 Embeds 0

No embeds

Accessibility

Categories

Upload Details

Uploaded via as Microsoft Word

Usage Rights

© All Rights Reserved

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Processing…
Post Comment
Edit your comment

    Paper การแยกแบคทีเรียแลคติกที่สามารถผลิตแบคทีริโอซินจากผัก ผลไม้ และธัญพืชหมัก Paper การแยกแบคทีเรียแลคติกที่สามารถผลิตแบคทีริโอซินจากผัก ผลไม้ และธัญพืชหมัก Document Transcript

    • การแยกแบคทีเ รีย แลคติก ที่ส ามารถผลิต แบคทีร ิโ อ ซิน จากผัก ผลไม้ และธัญ พืช หมัก ขนิษ ฐา ปัญ ญา สุม ิต รา ฤาชา _____________________________ บทคัด ย่อ การแยกแบคทีเรียแลคติกเพื่อคัดเลือกสายพันธุ์ที่สามารถผลิตแบคทีริโอซินจากตัวอย่างผัก ผลไม้ และธัญพืชหมัก จำานวน30 ตั ว อย่ า ง โดยใช้ อ าหาร MRS agar ที่ เ ติ ม CaCO3 1% พบว่ า สามารถแยกแบคที เ รี ย แกรมบวก ไม่ ส ร้ า งสปอร์ ไม่ ส ร้ า งเอนไซม์คะตะเลส ทั้งหมด 21 ไอโซเลท โดยมี รู ป ร่ างกลม 12ไอโซเลท และรูปท่อน 9 ไอโซเลท เมือนำาแบคทีเรียแลคติกทีแยก ่ ่ได้ทงหมดไปตรวจหาแบคทีรโอซินทียบยังการเจริญของแบคทีเรีย ั้ ิ ่ ั ้ท ด ส อ บ 4 ช นิ ด คื อ Bacillus cereus, Escherichia coli,Staphylococcus aureus และ Salmonella sp. ด้วยวิธี agarwell diffusion assay พบว่าแบคทีเรียแลคติกไอโซเลท E1, E2และ I2 มีความสามารถในการผลิตแบคทีริโอซินยับยังการเจริญ ้ของ B. cereus ได้ เมือจัดจำาแนกสายพันธุแบคทีเรียแล ่ ์คติก ที่ผ ลิต แบคทีริโ อซิน โดยชุด ทดสอบสำา เร็ จ รู ป API 50 CHL(BioMerieux) พบว่าแบคทีเรียแลคติกไอโซเลท E1 และ E2 คือLactobacillus acidophilus แ ล ะ ไ อ โ ซ เ ล ท I2 คื อPediococcus sp. การศึ ก ษาคุ ณ สมบั ติ เ บื้ อ งต้ น ของแบคที ริ โ อซิ น ที่ ผ ลิ ตจากเชื้ อ Lb. acidophilus E1 สามารถทนความร้อนได้ดทสดที่ ี ี่ ุอุณหภูมิ 63 และ 80 องศาเซลเซียส มีความคงตัวในช่วง pH 5-7ใ น ข ณ ะ ที่ แ บ ค ที ริ โ อ ซิ น จ า ก Lb. acidophilus E2 แ ล ะPediococcus sp.ไอโซเลท I2 สู ญ เสี ย ความสามารถในการยับยัง B. cereus เมือผ่านความร้อนและการเปลี่ยนแปลงค่า pH ้ ่นิย ามศัพ ท์ : แบคทีริโอซิน, แบคทีเรียแลคติก
    • Isolation of lactic acid bacteria with produced bacteriocin from fermented of vegetable, fruit and cereal products Khanitha Panya, Sumitra Ruecha ________________________ Abstract Isolation of lactic acid bacteria (LAB) withproduced bacteriocin from 30 fermentedvegable,fruit and cereal product samples by usingMRS agar with 1% CaCO3. The results showed that,21 LAB isolates were gram positive, nonsporing,catalase negative, 12 isolates were cocci shaped and9 isolates were rod shaped. Furthermore, agar welldiffusion assay was used to detect the bacteriocinactivity by using indicator strains, Bacillus cereus,Escherichia coli, Staphylococcus aureus andSalmonella sp. LAB isolate E1, E2 and I2 could inhibitB. cereus. The results from identification using acommercial test kit API 50 CHL system (Biomerieux),isolate E1 and E2 were Lactobacillus acidophilus andI2 was Pediococcus sp. The primary characterization of bacteriocinactivity from Lb. acidophilus E1 showed that itsactivity was not affected when treated at 63 and 80๐ C and was stable at pH 5-7. Wherease Lb.acidophilus E2 and Pediococcus sp. I2 were lost
    • bacteriocin activity when heat treated and pHchanged.Keyword: Bacteriocin, Lactic acid bacteriaบทนำา แบคทีริโอซิน (Bacteriocin) เป็ นสารยั บ ยั้ ง การเจริ ญ ของจุลินทรีย์ที่มีโครงสร้างเป็นโปรตีน ที่สามารถซึมผ่านเยื่อของเซลล์จุลินทรีย์เป้าหมายได้ ทำา ให้เกิดรูรั่วของเยื่อเซลล์และเกิดการรั่วไหลขององค์ ป ระกอบเซลล์ ติ ด ตามมา (สาโรจน์ , 2543) กลไกการทำางานของแบคทีริโอซินเกิดจากการที่แบคทีริโอซินเข้าจับกับเซลล์เป้าหมายทำา ให้เยื่อหุ้มเซลล์ถูกรบกวน ทำา ให้เกิดรูหรือช่องว่างที่มีลักษณะคล้ายชิ้นไม้ที่นำามาประกอบกันเป็นถังมีรูตรงกลางส่งผลให้เกิดการรั่วขององค์ประกอบภายในเซลล์เป็นกรดอะมิโนสารประกอบอนินทรีย์ในกลุ่มฟอสเฟตซึ่งเป็นสารให้พลังงานของเซลล์และไอออนของสารที่จำาเป็นต่อการดำารงชีวิตของเซลล์ ในกรณีสปอร์พบว่าเยื่อหุ้มเซลล์จะถูกทำาลายอย่างรวดเร็วในระหว่างที่ ส ปอร์ ง อกขึ้ น มา และแบคที ริ โ อซิ น ที่ ค วามเข้ ม ข้ น สู ง สามารถยับยั้งการสร้างเพปติโดกลัยแคน (peptidoglycan) ซึ่งเป็นส่วนป ร ะ ก อ บ ที่ สำา คั ญ ข อ ง ผ นั ง เ ซ ล ล์ ข อ ง Bacillussterothermophillus แล ะ Escherichia coli ได้ (สุพ รรณิการ์, 2548) แบคทีริโ อซิน ที่ส ร้ า งจากแบคที เ รี ย แลคติ ก ส่ ว นใหญ่ จ ะยับยังการเจริญของแบคทีเรีย ้ สายพันธุทใกล้ชดกับแบคทีเรีย ์ ี่ ิแลคติกชนิดที่สร้างแบคทีริโอซินนั้น อย่างไรก็ตามมีรายงานว่าแบคทีรโอซินจากแบคทีเรียแลคติกบางชนิดสามารถยับยังแบคทีเรีย ิ ้แกรมบวกที่ทำา ให้เกิด โรคอาหารเป็น พิ ษ ได้ เ ช่ น Bacillus cereus,
    • Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes แ ล ะStaphylococcus aureus ดั ง นั้ น จึ ง ทำา ให้ มี ผู้ ส นใจศึ ก ษาเกี่ ย วกั บแบคที เ รี ย แลคติ ก ที่ ผ ลิ ต แบคที ริ โ อซิ น ได้ จ ากผลิ ต ภั ณ ฑ์ อ าหารชนิดต่างๆกันอย่างกว้างขวาง เพื่อหาแนวทางในการนำามาใช้เป็นส า ร กั น เ สี ย ต า ม ธ ร ร ม ช า ติ (ส ม ใ จ แ ล ะ ค ณ ะ , 2550) การค้นพบแบคทีริโอซินจากแบคทีเรียแลคติก มีรายงานครั้งแรกตั้งแต่ปี ค.ศ. 1928 โดยRogers พบว่า Lb. lactis สามารถสร้ า งสารยั บ ยั้ ง การเจริ ญ ของ Lb. bulgaricus ได้ ต่ อ มาในปีค.ศ. 1947 Mattick และ Hirsch ได้ ศึ ก ษาพบว่ า สารที่ ยั บ ยั้ งการเจริญ ของ Lb. bulgaricus ได้ นี้ มี โครงสร้ า งทางเคมีเป็นเปปไทด์และตั้งชื่อว่าไนซิน หลังจากนั้นมีการศึกษาพบว่าไนซิ นนอกจากจะยั บ ยั้ ง การเจริ ญ ของ lactobacilli ได้ แ ล้ ว ยั งสามารถยั บ ยั้ ง การเจริ ญ ของจุ ลิ น ทรี ย์ อื่ น ได้ อี ก หลายชนิ ด คื อstreptococci, staphylococci, Bacillus sp. แ ล ะClostridium และมีรายงานว่าแบคทีเรีย แลคติกสายพันธุ์ที่ส ร้ า ง ไ น ซิ น ไ ด้ ส า ม า ร ถ ยั บ ยั้ ง ก า ร ง อ ก ข อ ง ส ป อ ร์ ข อ ง Cl.botulinum และยั บ ยั้ ง การเจริ ญ ของ L. monocytogenes ในระหว่างการผลิต Camembert cheese ได้ ปัจจุบันไนซินได้รับการยอมรับในสหรัฐอเมริกาว่าปลอดภัย (GRAS) และมีการนำา ไปใช้เป็นสารเสริมเพื่อช่วยยับยั้ งการเจริญ ของจุ ลินทรี ย์ก่อ โรคในผลิ ต ภั ณ ฑ์ อ าหารหลายชนิ ด ทั่ ว โลก (สมใจ และคณะ, 2550) การศึกษาเกี่ยวกับการผลิตแบคทีริโอซินจากแบคทีเรียแลคติกที่แยกได้จากผลิตภัณฑ์อาหารชนิดต่างๆ กันอย่างกว้างขวางแ ล ะ มี ร า ย ง า น ว่ า แ บ ค ที เ รี ย แ ล ค ติ ก ห ล า ย ช นิ ด ใ น จี นั สCarnobacterium, Enterococcus, Lactococcus,Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus,Tetragenococcus, Weissella และ Vagococcus สามารถส ร้ า ง แ บ ค ที ริ โ อ ซิ น ไ ด้ ประเทศไทยมีผลิตภัณฑ์พืชหมักพื้นบ้านหลายชนิดที่ผลิตเช่ น กะหลำ่า ปลี ด อง มะม่ ว งดอง ผั ก กาดดอง ขนมจี น หมั กเป็ น ต้ น ซึ่ ง ส่ ว นใหญ่ มี ก ารผลิ ต ในระดั บ ครั ว เรื อ นโดยอาศั ยกิ จ กรรมของแบคที เ รี ย แลคติ ก ที่ ป นเปื้ อ นมาในวั ต ถุ ดิ บ ตามธรรมชาติ ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงสนใจที่จะคัดแยกแบคทีเรียแลคติก
    • ที่ มี ค วามสามารถผลิ ต แบคที ริ โ อซิ น จากผลิ ต ภั ณ ฑ์ พื ช หมั ก และศึกษาคุณสมบัติบางประการของเชื้อที่แยกได้ เพื่อเป็นแนวทางใ น ก า ร นำา ส า ย พั น ธุ์ ข อ ง แ บ ค ที เ รี ย แ ล ค ติ ก ที่ ส า ม า ร ถ ส ร้ า งแบคทีริโอซินไปพัฒนากระบวนการหมักที่เหมาะสมของผลิตภัณฑ์พื ช ห มั ก ท้ อ ง ถิ่ น ต่ อ ไ ปอุ ป ก ร ณ์ แ ล ะ วิ ธี ก า ร ท ด ล อ งตัว อย่า งอาหารหมัก เก็บตัวอย่างอาหารหมักจากผัก ผลไม้ และธัญพืช ได้แก่ได้แก่ หน่อไม้ดอง กระเทียมดอง หัวไชโป๊ มะนาวดอง ผักกาดดอง กุ่มดอง มะดันดอง องุ่นดอง ขนมจีนหมัก ข้าวหมาก ลูกแป้งสาโท เต้าเจี้ยว เต้าหู้ยี้ นำ้าหมักลูกยอ มะยมดอง และมะม่วงดองจากร้านค้าในตลาดจังหวัดลพบุรี สิงห์บุรีและสระบุรีจำานวน 30ตัวอย่างจุ ลิ น ท รี ย์ ที่ ใ ช้ เ ป็ น เ ชื้ อ ท ด ส อ บ Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcusaureus และ Salmonella sp.ก า ร แ ย ก แ บ ค ที เ รี ย แ ล ค ติ ก ชั่ ง ตั ว อย่ า งอาหาร 10 กรั ม ใส่ ล งในอาหาร MRS brothปริ ม าตร 90 มิ ล ลิ ลิ ต ร นำา ไปบ่ ม ที่ อุ ณ หภู มิ 37 องศาเซลเซี ย สเป็นเวลา 48 ชั่วโมง นำามาเจือจางด้วย โซเดียมคลอไรด์ 0.85เปอร์เซ็นต์ ให้ได้ระดับการเจือจางที่เหมาะสม จากนั้นปิเปตมา 1มิ ล ลิ ลิ ต ร ลงในจานเพาะเชื้ อ แล้ ว เทอาหาร MRS agar ที่ เ ติ มCaCO3 1 % เททั บ ด้ ว ยอาหาร MRS agar บ่ ม ที่ อุ ณ หภู มิ 37องศาเซลเซี ย ส เป็ น เวลา 48 ชั่ ว โมง ในสภาวะไร้ อ อกซิ เ จนก า ร แ ย ก เ ชื้ อ บ ริ สุ ท ธิ์ แยกแบคทีเรียแลคติกซึ่งมีบริเวณใสรอบโคโลนี โดยทำาการขีดเชื้อ (cross streak) บนอาหารแข็ง MRS agar ที่เติ ม CaCO3 1 % บ่มทีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 ่
    • ชัวโมง ่ ในสภาวะไร้ออกซิเจน ทำา การเพาะเลี้ ย ง 2 ครั้ ง และตรวจสอบเชื้อ บริ สุท ธิ์ด้ ว ยการส่ อ ง กล้ อ งจุ ล ทรรศน์ เก็บรักษาเชื้อโดยการเขี่ยเชื้อบริสุทธิ์โคโลนีเดี่ยวมาแทงในหลอดอาหาร MRS agar บ่ ม ที่ อุ ณ หภู มิ 37 องศาเซลเซี ย ส ในสภาวะไร้ออกซิเจน เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เก็บที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส และทำาการต่อเชื้อทุก 1 เดือนการศึก ษาอนุก รมวิธ านของแบคทีเ รีย แลคติก ที่แ ยกได้ เลี้ย งเชื้อ บริ สุ ท ธิ์บ นอาหาร MRS agar บ่ ม ที่ อุ ณ หภู มิ 37องศาเซลเซี ย ส เป็ น เวลา 24 ชั่ ว โมง แล้ ว นำา มาทดสอบ ดั ง นี้ 1.ก า ร ติ ด สี แ ก ร ม รู ป ร่ า ง แ ล ะ ก า ร จั ด เ รี ย ง ตั ว 2.ก า ร ท ด ส อ บ ก า ร ส ร้ า ง เ อ น ไ ซ ม์ ค ะ ต ะ เ ล ส 3.ก า ร ท ด ส อ บ ก า ร ส ร้ า ง ก๊ า ซ 4.การทดสอบการเจริ ญ ที่ อุ ณ หภู มิ 10 และ 45 องศา เ ซ ล เ ซี ย ส 5.การทดสอบการทนเกลื อ ที่ ร ะดั บ โซเดี ย มคลอไรด์ 6.5 แ ล ะ 18 เ ป อ ร์ เ ซ็ น ต์ 6.การทดสอบความสามารถในการเจริ ญ ที่ pH 4.5 และ 9.6 7.ก า ร ศึ ก ษ า คุ ณ ส ม บั ติ ก า ร ห มั ก ย่ อ ย ค า ร์ โ บ ไ ฮ เ ด ร ตก า ร ท ด ส อ บ โ ด ย วิ ธี agar well diffusion assay ก า ร เ ต รี ย ม เ ชื้ อ ท ด ส อ บ นำาแบคทีเรียก่อโรคในระบบทางเดินอาหารมาทดสอบ 4ช นิ ด ไ ด้ แ ก่ Bacillus cereus, Escherichia coli,Staphylococcus aureus และ Salmonella sp. มาทำา การเพาะเลี้ยงบนอาหาร TSA (ภาคผนวก ก) บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซี ย ส เป็น เวลา 24-48 ชั่ ว โมง เขี่ ย เชื้ อ ลงในโซเดี ย มคลอไรด์ 0.85 เปอร์เซ็นต์ ปรับความขุ่นของเชื้อให้มีความขุ่นเท่ากับความขุ่นของสารละลายมาตรฐาน Mc Farland No.0.5 จากนั้นใช้ไม้พันปลายสำา ลีจุ่มนำ้า เลี้ยงเชื้อ ทำา ให้หมาด โดยการกดที่ผิว
    • ข้ า งในหลอดทดลองเกลี่ ย ให้ ทั่ ว บนผิ ว หน้ า อาหาร TSA ทิ้ ง ไว้ป ร ะ ม า ณ 10 น า ที ก า ร เ ต รี ย ม ส า ร ท ด ส อ บ ถ่ายเชือแบคทีเรียแลคติกลงในอาหาร MRS broth ้ปริม าตร 10 มิล ลิลิต ร ในหลอดทดลอง บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 ชัวโมง ปรับ pH ด้วยสารละลายโซเดียมไฮ ่ดรอกไซด์ 1 นอร์มัล ทีปราศจากเชือ ให้ได้ค่า pH ให้เป็นกลาง ่ ้จากนั้น นำา ไปปั่น แยกเซลล์ ด้ ว ยเครื่อ งปั่น เหวี่ย งที่ค วามเร็ ว รอบ6000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 15 นาที ทีอณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ่ ุกรองให้ปราศจากเชือโดยกระดาษกรอง 0.45 ไมโครเมตร จะได้ ้เ ป็ น crude filtrate supernatant fluid (CFSF)ก า ร ท ด ส อ บ ส า ร ยั บ ยั้ ง แ บ ค ที เ รี ย ท ด ส อ บ นำา CFSF ปริม าตร 50 ไมโครลิ ต ร ใส่ ล งในจานเพาะเชื้ ออาหารแข็ง TSA ที่ swab แบคที เรี ย ทดสอบซึ่ งเจาะหลุ ม ไว้ แล้ วบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง สังเกตการเ กิ ด บ ริ เ ว ณ ใ ส ร อ บ ๆ ห ลุ มการทด สอ บคุณ สมบัต ิเ บื้อ งต้น ขอ งแบคทีร ิโ อ ซิน ที่ผ ลิต ได้ ถ่ า ยเชื้ อ แบคที เ รี ย แลคติ ก ลงในอาหาร MRS brothปริมาตร 10 มิลลิลิตร บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา48 ชั่ว โมง ปรับ pH ให้ เป็ น กลาง จากนั้ น นำา ไปปั่ น แยกเซลล์ ที่ความเร็วรอบ 6,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 15 นาที ที่อุณหภูมิ4 องศาเซลเซียส กรองด้วยกระดาษกรอง 0.45 ไมโครเมตร จากนั้ น นำา ไ ป ท ด ส อ บ ดั ง นี้ ก า ร ท ด ส อ บ ค ว า ม ส า ม า ร ถ ใ น ก า ร ท น ค ว า ม ร้ อ น ข อ ง แ บ ค ที ริ โ อ ซิ น นำา CFSF ไปให้ความร้อนทีอณหภูมิ 63, 80 และ 100 ่ ุองศาเซลเซียส เป็นเวลา 10, 20 และ 30 นาที จากนั้นทดสอบโดยวิธี agar well diffusion assay เปรียบเทียบกับ CFSF ทีไม่ ่ไ ด้ ผ่ า น ค ว า ม ร้ อ น การทดสอบความคงตัว ของแบคทีร ิโ อซิน ที่ pH ต่า งๆ
    • นำา CFSF มาปรับ pH ทีระดับ 3, 5, 7 และ 9 โดยใช้ ่1 โมลาร์ ไฮโดรคลอลิก หรือ 1 นอร์มล โซเดียมไฮดรอกไซด์ บ่มที่ ัอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 4 ชัวโมง จากนันนำามาปรับ ่ ้pH ใ ห้ เ ป็ น ก ล า ง แ ล้ ว จึ ง นำา ไ ป ท ด ส อ บ โ ด ย วิ ธี agar welldiffusion assayผ ล ก า ร ท ด ล อ ง จากการแยกแบคที เ รี ย จากตั ว อย่ า งอาหารพื ช หมั ก 30ตัวอย่าง โดยใช้อาหาร MRS agar ที่เติม CaCO3 1% พบว่าได้แบคทีเรียแกรมบวก จำา นวน 21 ไอโซเลท แบ่งออกเป็น รูปร่างกลม 12 ไอโซเลท รูปร่างท่อนสั้น 3 ไอโซเลท และรูปร่างท่อน 6ไอโซเลท คุ ณ สมบั ติ สำา คั ญ ของแบคที เ รี ย กลุ่ ม นี้ มี ค่ า pH ของอาหารอยู่ในช่วง 3.23-4.83 จากนั้นนำา แบคทีเรี ยที่ แยกได้ ม าทดสอบคุณ สมบั ติ ท างเคมี ได้ แ ก่ เอนไซม์ ค ะตะเลส การสร้ า งก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ การเจริญที่อุณหภูมิ 10 และ 45 องศาเซลเซียส การเจริญในอาหารที่มีโซเดียมคลอไรด์ 6.5 และ 18เปอร์เซ็นต์ และการเจริญที่ pH 4.5 และ 9.6 พบว่า แบคทีเรียแลคติกทั้ง 21 ไอโซเลท ให้ปฏิกิริยาคะตะเลสเป็นลบ ไม่สร้างก๊ า ซคาร์ บ อนไดออกไซด์ จ ากการหมั ก กลู โ คสจึ ง จั ด อยู่ ใ นกลุ่ มhomofermentative ซึ่ ง แบคที เ รี ย กลุ่ ม นี้ เ มื่ อ เกิ ด กระบวนการหมั ก ผลผลิ ต ที่ ไ ด้ คื อ กรดแลคติ ก เป็ น ผลิ ต ภั ณ ฑ์ ส่ ว นใหญ่สามารถเจริ ญ ได้ ที่ ช่ ว งอุ ณ หภู มิ สู ง แต่ ไ ม่ เ จริ ญ ช่ ว งอุ ณ หภู มิ ตำ่าเจริญเติบโตในอาหารเหลวที่เติมเกลือโซเดียมคลอไรด์ 6.5 แต่ไม่เจริญที่ 18 เปอร์เซ็นต์ และเจริญเติบโตในอาหารเหลวที่มีค่าpH 4.5 แ ต่ ไ ม่ เ จ ริ ญ ที่ pH 9.6ก า ร ท ด ส อ บ ก า ร ส ร้ า ง แ บ ค ที ร ิ โ อ ซิ น โ ด ย วิ ธ ี agar welldiffusion assay จากการศึกษาความสามารถการยั บยั้ งแบคที เรี ย ทดสอบ 4ชนิด โดยวิธี agar well diffusion assay พบว่าแบคทีเรียแลคติ ก 3 ไอโซเลท คื อ E1, E2 และ I2 สามารถยั บ ยั้ ง การเจริ ญ
    • ของ B. cereus ได้มากที่ สุ ด โดยทำา ให้ เกิ ดบริเวณใสมี เส้ นผ่ า นศูนย์กลาง 15, 11 และ 11 มิลลิเมตรตามลำา ดับ ซึ่งเปรียบเทียบกับชุดควบคุม คือ อาหาร MRS broth ที่ไม่มีการยับยั้งแบคทีเรียท ด ส อ บ ส่ ว น แ บ ค ที เ รี ย ท ด ส อ บ E. coli, S. aureus แ ล ะSalmonella sp. แบคทีเรียแลคติกที่แยกได้ไม่สามารถยับยั้งการเจริ ญ ได้ ซึ่ ง การทดสอบวิ ธี นี้ เ ป็ น การนำา สารทดสอบที่ ผ ลิ ต จากแบคทีเรียแลคติกที่อยู่ในอาหาร MRS broth และทำาการปรับ pHของสารทดสอบให้เป็นกลาง จึงมีแนวโน้ม ว่ าเป็ นแบคที ริ โอซิ นการทดสอ บความสามารถในการท นความร้อ นขอ งแบคทีริ โ อ ซิ น เมื่อ นำา แบคทีริโอซินที่ผ ลิต จากไอโซเลท E1 มาผ่านความร้อนทีอณหภูมิ 63 และ 80 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10, 20 และ ่ ุ30 นาที พบว่า กิจกรรมของการยับยังไม่เปลียนแปลง ้ ่ ดังแสดงในภาพที่ 5 แสดงถึง ความสามารถในการสร้ า งแบคทีริ โ อซิ น ที่สามารถทนความร้อนได้ในระดับ นี้ ในขณะที่ให้ความร้อ น 100องศาเซลเซี ย ส พบว่ า กิ จ กรรมการยั บ ยั้ ง B. cereus ลดลง แบคทีริโอซินที่ผ ลิ ต จากไอโซเลท I2 เมื่อ ผ่ านความร้ อ นที่อุณหภูมิ 63 องศาเซลเซียส กิจกรรมการยับยั้งลดลง เมื่อเปรียบเที ย บกับที่ ไม่ ผ่า นความร้ อ นและจะสู ญ เสี ย ความสามารถในการยับยั้งเมื่อผ่านความร้อนที่อุณหภูมิ 80 และ 100 องศาเซลเซียสในขณะที่ แ บคที ริ โ อซิ น ที่ ผ ลิ ต จาก ไอโซเลท E2 สู ญ เสี ย ความสามารถในการยั บ ยั้ ง เมื่ อ ผ่ า นความร้ อ นที่ อุ ณ หภู มิ 63 องศาเ ซ ล เ ซี ย ส ดั ง แ ส ด ง ใ น ต า ร า ง ที่ 1ตารางที่ 1 ผลการทดสอบความสามารถทนความร้อนของแบคที ริ โ อ ซิ น ที่ ผ ลิ ต จ า ก แ บ ค ที เ รี ย แ ล ค ติ ก จ า ก ไ อ โ ซ เ ล ท E1, E2 แ ล ะ I2
    • อุณ หภูม ิ/เวลา บริเ วณใสของการยับ ยัง แบคทีเ รีย ้ ทดสอบ (มิล ลิเ มตร) E1 E2 I2 ไม่ผ่านความร้อน 16 8 8 63 °C 10 นาที 16 - 8 63 °C 20 นาที 16 - 8 63 °C 30 นาที 16 - 8 80 °C 10 นาที 16 - - 80 °C 20 นาที 16 - - 80 °C 30 นาที 16 - - 100 °C 10 นาที 11 - - 100 °C 20 นาที 11 - - 100 °C 30 นาที 10 - -หมายเหตุ - หมายถึง ไ ม่ มี บ ริ เ ว ณ ใ สก า ร ท ด ส อ บ ค ว า ม ค ง ตั ว ข อ ง แ บ ค ที ร ิ โ อ ซิ น ที่ pH ต่ า ง ๆ จากการทดสอบแบคทีรโอซินทีผลิตจากไอโซเลท E1 มีความ ิ ่สามารถในการยับ ยั้ง B. cereus ที่ pH 5 และ 7 โดยไม่มีก ารเปลียนแปลงเมือเปรียบเทียบกับชุดควบคุมทีไม่ผานการปรับค่า pH ่ ่ ่ ่ในขณะทีการยับยังไม่เกิดขึนที่ pH 3 และ pH 9 แสดงว่าแบคทีรโอ ่ ้ ้ ิซินทีผลิตจากไอโซเลท E1 มีความคงตัวดีที่ pH 5 และ 7 แบคทีริ ่โอซินทีผลิตจากไอโซเลท E2 มีความสามารถในการยับยังที่ pH 9 ่ ้โดยมีบริเวณยับยังมากกว่าชุดควบคุมทีไม่ผานการปรับค่า pH และ ้ ่ ่แบคทีรโอซินทีผลิตจากไอโซเลท I2 มีความสามารถยับยังได้ดใน ิ ่ ้ ีช่ ว ง pH ที่ เ ป็ น ก ร ด ดั ง แ ส ด ง ใ น ต า ร า ง ที่ 2
    • ตารางที่ 2 ผลการทดสอบความคงตั ว ของแบคที ริ โ อซิ น ที่ pH ต่างๆ ของแบคทีเรียแลคติก ไอโซเลท E1, E2 แ ล ะ I2 ระดับ pH บริเ วณใสของการยับ ยั้ง แบคทีเ รีย ทดสอบ (มิล ลิเ มตร) E1 E2 I2 ไม่ปรับ pH 15 8 10 pH 3 - - 8 pH 5 15 7 10 pH 7 15 - - pH 9 - 15 -หมายเหตุ - หมายถึง ไ ม่ มี บ ริ เ ว ณ ใ สการจัด จำา แนกชนิด แบคทีเ รีย แลคติก ทีส ามารถผลิต แบคทีร ิ ่โ อ ซิ น จากการจัดจำาแนกชนิด แบคทีเรียแลคติกไอโซเลท E1 และE2 มีความสามารถในการหมักย่อยคาร์โบไฮเดรตได้ใกล้เคียงกันคื อ สามารถหมั ก ย่ อ ยนำ้า ตาล glucose, fructose, salicin,cellubiose, sucrose, trehalose และ gentiobiose ส่ ว นแบคที เ รี ย แลคติ ก ไอโซเลท I2 สามารถหมั ก ย่ อ ย ribose,galactose, glucose, fructose, mannose, N-Acetyl-Glucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin,cellubiose, maltose, sucrose, trehalose, gentiobioseแ ล ะ d-tagalose จากการนำาข้อมูล การผลิตกรดจากแหล่งคาร์โบไฮเดรตชนิดต่ า งๆ มาวิ เ คราะห์ ด้ ว ยโปรแกรม apiwebTM identificationsoftware และพิจารณาจากรูปร่างเซลล์ พบว่า ไอโซเลท E1 และE2 คือ Lactobacillus acidophilus ทีระดับความถูกต้องของการ ่จัดจำาแนก 98.5 % และ 99.5 % ตามลำาดับ และไอโซเลท I2 คือ
    • Pediococcus pentosaceus ที่ ร ะดั บ ความถู ก ต้ อ งของการจั ดจำา แ น ก 8.3 % ดั ง แ ส ด ง ใ น ต า ร า ง ที่ 3ต า ร า ง ที่ 3 ผลการทดสอบการหมั ก คาร์ โ บไฮเดรต 49 ชนิ ด โดยชุดทดสอบสำาเร็จรูป API 50 CHL ของแบคทีเรียแล ค ติ ก จ า ก ไ อ โ ซ เ ล ท E1, E2 แ ล ะ I2 คาร์โ บไฮเดรต E1 E2 I21. Glycerol - - -2. Erythritol - - -3. D-Arabinose - - -4. L-Arabinose ? ? -5. Ribose - - +6. D-Xylose - - -7. L-Xylose - - -8. Adonitol - - -9. β-methyl-D-xyloside - - -10. Galactose ? ? +11. Glucose + + +12. Fructose + + +13. Mannose + + +14. Sorbose - - -15. Rhamnose - - -16. Dulcitol - - -17. Inositol - - -18. Mannitol ? ? -19. Sorbitol - ? -20. α-Methyl-D- - - -Mannosideต า ร า ง ที่ 3 (ต่ อ ) คาร์โ บไฮเดรต E1 E2 I221. α-Methyl-D- - - -Glucoside22. N-Acetyl- ? ? +Glucosamine23. Amygdalin + + +24. Arbutin - - +
    • 25. Esculin + + +26. Salicin + + +27. Cellubiose + + +28. Maltose - - +29. Lactose ? - -30. Melibiose - - -31. Sucrose + + +32. Trehalose + + +33. Inulin - - -34. Melezitose - - -35. Raffinose ? + -36. Starch - - -37. Glycogen - - -38. Xylitol - - -39. Gentiobiose + + +40. D-Turanose - - -41. D-Lyxose - - -42. D-Tagalose - - +43. D-Fucose - - -44. L-Fucose - - -45. D-Arabitol - - -46. L-Arabitol - - -47. Gluconate - - -48. 2-keto-gluconate - - -49. 5-keto-gluconate - - -หมายเหตุ + ใช้เป็นแหล่งคาร์บอนได้ - ใช้เป็นแหล่งคาร์บอน ไ ม่ ไ ด้ ? ผ ล ก า ร ท ด ส อ บ ไ ม่ ชั ด เ จ นส รุ ป แ ล ะ วิ จ า ร ณ์ ผ ล ก า ร ท ด ล อ ง การแยกแบคที เ รี ย แลคติ ก จากผั ก ผลไม้ และธั ญ พื ช หมั กและนำามาทดสอบความสามารถในการผลิตแบคทีริโอซินในเบื้องต้ น โดยวิ ธี ก ารแยกเชื้ อ ในอาหาร MRS agar ที่ เ ติ ม CaCO31%พบว่ า จากตั ว อย่ า งผั ก ผลไม้ และธั ญ พื ช หมั ก จำา นวน 30ตัวอย่าง สามารถแยกแบคทีเรียแลคติกได้จำา นวน 21 ไอโซเลทโดยทั้งหมดเป็นแบคทีเรียแกรมบวก รูปร่างกลม12 ไอโซเลท และรูปร่างท่อน 9 ไอโซเลท ไม่สร้างสปอร์ ไม่สร้างเอนไซม์คะตะเลสไม่สร้างก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์จากการหมักกลูโคสจึงจัดอยู่ในก ลุ่ ม homofermentative ส า ม า ร ถ เ จ ริ ญ ไ ด้ ที่ อุ ณ ห ภู มิ 45องศาเซลเซีย ส เจริญ ได้ ในที่ มี เกลื อ 6.5% สามารถผลิ ต กรดในอาหารเหลวได้ เมื่อนำาแบคทีเรียแลคติกไปทดสอบความสามารถ
    • ในการยั บ ยั้ ง แบคที เ รี ย ทดสอบ 4 ชนิ ด ได้ แ ก่ B. cereus, E.coli, S. aureus แ ล ะ Salmonella sp. โ ด ย วิ ธี Agar welldiffusion assay พบว่ า มี 3 ไอโซเลท คื อ E1, E2 และ I2 ที่สามารถยับยั้ง B. cereus ได้โดยบริ เวณใสมี เส้ นผ่านศูนย์กลาง15, 11 และ 11 มิลลิเมตร ตามลำาดับ ซึ่งแบคทีเรียแลคติก 3 ไอโซเลทแยกได้จากนำ้าหมักลูกยอและเต้าหู้ยี้ เมือทำาการจัดจำาแนก ่แบคทีเรียแลคติกทีสามารถผลิตแบคทีรโอซินในระดับสปีชสโดยใช้ ่ ิ ี ์ชุดทดสอบสำา เร็จ รูป API 50 CHL พบว่าแบคทีเรียแลคติกไอโซเ ล ท E1, E2 แ ล ะ I2 คื อ Lactobacillus acidophilus แ ล ะPediococcus sp. จากการศึกษาคุณสมบัตเบืองต้นของแบคทีรโอ ิ ้ ิซิ น ได้ ผ ล ดั ง นี้ แบคที ริ โ อซิ น ที่ ผ ลิ ต จากเชื้ อ Lactobacillusacidophilus E1 สามารถทนความร้ อ นที่อุ ณ หภู มิ 63 และ 80องศาเซลเซียสได้ มีความ คงตัวดีในช่วง pH 5-7 ส่วนแบคทีรโอ ิซินที่ผ ลิต จากเชื้อ Lactobacillus acidophilus E2 ไม่ส ามารถทนความร้นได้ มีความคงตัวในช่วง pH 9 และแบคทีรโอซินทีผลิต ิ ่จากเชือ Pediococcus sp. I2 สามารถทนความร้อนทีอณหภูมิ ้ ่ ุ63 อ ง ศ า เ ซ ล เ ซี ย ส มี ค ว า ม ค ง ตั ว ดี ใ น ช่ ว ง pH 3-5 จากงานวิ จั ย นี้ จ ะเห็ น ได้ ว่ า Lb. acidophilus E1, Lb.acidophilus E2 และ Pediococcus sp.I2 สามารถยั บ ยั้ ง การเจริญ ของแบคทีเรีย ก่อ โรคอาหารเป็ นพิ ษ ได้ คื อ B. cereus ดังนั้นจึงอาจนำาไปใช้เป็นกล้าเชื้อในการผลิตอาหารหมักที่ปลอดภัยและได้ ม าตรฐาน หรื อ นำา ไปใช้ ใ นการผลิ ต สารยั บ ยั้ ง เชื้ อ โรคอ า ห า ร เ ป็ น พิ ษ ใ น อ า ห า ร ไ ด้เ อ ก ส า ร อ้ า ง อิ ง1. จ า รุ ว ร ร ณ ม ณี ศ รี . 2551. เ ท ค โ น โ ล ยี อ า ห า ร ห มั ก . ก รุ ง เ ท พ ฯ : สำา นั ก พิ ม พ์ โ ฟ ร เ พ ซ
    • 2. ชิดชม ฮิรางะ มาลัย บุญรัตนกรกิจ มณฑาทิพย์ ยุ่นฉลาด และ กรุณ า วงษ์กระจ่ า ง. 2550. การเปลี่ ย นแปลงชนิ ด และ ปริ ม าณจุ ลิ น ทรี ย์ ร ะหว่ า งการหมั ก ยอ ในกระบวนการผลิ ต เครื่ อ งดื่ ม นำ้า ลู ก ยอไทย. ว . ว ช . (วิ ท ย์ ). 39 (1): 95-104.3. ชุตินันท์ รัตนไพบูลย์สวัสดิ์ . 2547. กา ร ศึก ษ า คุณ ลัก ษ ณ ะ ข อ ง แ บ ค ที เ รี ย ก ร ด แ ล ค ติ ก ที่ ผ ลิ ต ส า ร ยั บ ยั้ ง ก า ร เ จ ริ ญ ข อ ง Staphylococcus aureus. วิทยานิ พนธ์วิ ทยาศาสตร มหาบั ณ ฑิ ต ,สาขาเทคโนโลยี ชี ว ภาพ ภาควิ ช าเทคโนโลยี ชี ว ภ า พ ม ห า วิ ท ย า ลั ย เ ก ษ ต ร ศ า ส ต ร์ .4. ณัฐพร ภัทรสินไพบูลย์ อรอนงค์ พริ้งศุลกะ อัจฉริยา รังษิรุจิ และ ณัฏฐิกา สุวรรณาศรัย. 2552. การแย กแลบเฟจจาก ตั ว อ ย่ า ง แ ห น ม ใ น ป ร ะ เ ท ศ ไ ท ย ว า ร ส า ร วิ ท ย า ศ า ส ต ร์ ม ศ ว . 25(1): 101-113.5. ดวงพร คั น ธโชติ . 2537. อ นุ ก ร ม วิ ธ า น ข อ ง แ บ ค ที เ รี ย และ ปฏิบ ัต ิก า ร . กรุงเทพฯ: สำา นักพิมพ์ โอเดียนสโตร์6. นิ ด า อาบสุว รรณ์ . 2550. ก า ร ผ ลิ ต แ บ ค ที ร ิ โ อ ซิ น จ า ก แ ล ค ติก แ อ ซิด แ บ ค ทีเ รี ย ที่ท น อุณ ห ภูม ิส ู ง . วิทยานิพนธ์วิทยา ศาสตรมหาบัณฑิต ,สาขาเทคโนโลยีชีวภาพ บัณฑิตวิทยาลัย ม ห า วิ ท ย า ลั ย ข อ น แ ก่ น .7. ปิ่ น ม ณี ข วั ญ เ มื อ ง . 2547. แ บ ค ที เ รี ย ก ร ด แ ล ค ติ ก ใ น ผ ลิ ต ภั ณ ฑ์ อ า ห า ร ห มั ก ด อ ง . ว า ร ส า ร ค รุ ศ า ส ต ร์ อุ ต ส า ห ก ร ร ม . 3(1): 65.8. มาตรฐานผลิตภัณฑ์ ชุม ชนนำ้า ลู กยอ. (2553, มิถุนายน 23). มาตรฐานผลิต ภัณ ฑ์ช ุม ชนนำ้า ลูก ยอ . [ออนไลน์] เข้าถึงได้ จ า ก : http://www.tisi.go.th.9. มี ชั ย ลั ด ดี . 2552. บ ท ป ฏิ บั ติ ก า ร ที่ 2 ก า ร คั ด แ ย ก แ บ ค ที เ รี ย ก ร ด แ ล ค ติ ก . [อ อ น ไ ล น์ ]. เ ข้ า ถึ ง ไ ด้ จ า ก : http://www.agro.kmutnb.ac.th. (วั น ที่ ค้ น ข้ อ มู ล :10 ธันวาคม 2553)
    • 10. วรายุทธ สุระนรากุล สัมภาษณ์ คุณสุข ปาริชาติ พุ่มขจร พงศ์ศักดิ์ รัตนชัยกุลโสภณ. 2550. คุณสมบัติของแบคทีริโอซิ นที่ ส ร้ า งโดยแลคติ ก แอซิ ด แบคที เ รี ย ที่ แ ยกได้ จ ากอาหาร หมั ก .ว า ร ส า ร วิ จ ั ย ม ห า วิ ท ย า ลั ย ข อ น แ ก่ น 7(1): 17-26.11. วิเชียร ลีลาวัชรมาศ. 2534. อาหารจากแล คติค แอ ซิด แบคทีเ รีย ในอุต สาหกรรมไทย . โปรซีดดิ้งส์ แลคติคแอซิด แ บ ค ที เ รี ย ใ น อุ ต ส า ห ก ร ร ม ไ ท ย ค รั้ ง ที่ 1.ม ห า วิ ท ย า ลั ย เ ก ษ ต ร ศ า ส ต ร์ ก รุ ง เ ท พ ม ห า น ค ร .12. สมใจ ศิริโภค ประวัติ อังประภาพรชัย ขจีนาฏ โพธิเวชกุล และอรอนงค์ พริ้ ง ศุ ล กะ. 2550. การคั ด เลื อ กและการจั ด จำา แนกชนิ ด แบคที ริ โ อซิ น ได้ จ ากอาหารหมั ก และการศึ ก ษา คุณสมบัติเบื้องต้นของแบคทีริโอซินที่ผลิตได้ . บทคว าม วิจ ัย วา ร ส า ร วิท ย าศ า ส ต ร์ ปีท ี่ 23 (ฉบับ ที่ 2 ) มห า วิท ย า ลัย ศ รี น ค ริ น ท ร วิ โ ร ฒ .13. สาโรจน์ ศิ ริ ศั น สนี ย กุ ล . 2543. แ บ ค ที ร ิ โ อ ซิ น : ส า ร ยั บ ยั้ ง จุ ล ิ น ท รี ย ์ ใ น อ า ห า ร . ภาควิ ช าเทคโนโลยี ชี ว ภาพ คณะอุ ต สาหกรรมเกษตร มหาวิ ท ยาลั ย เกษตรศ าส ตร์ .14. สุพรรณิการ์ ศรีบัว ทอง. 2548. ก า ร คัด เ ลื อ ก แ บ ค ที เ รี ย ก ร ด แ ล ค ติ ก จ า ก ข้ า ว ห มั ก เ พื่ อ ใ ช้ เ ป็ น ก ล้ า เ ชื้ อ ข น ม จี น แ ป้ ง ห มั ก .วิ ท ยานิ พ นธ์ วิ ท ย าศ าส ตรมห าบั ณ ฑิ ต , สาข า วิทยาศาสตร์การอาหาร ภาควิชาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี ก า ร อ า ห า ร .15. สุม ณฑา วัฒนสินธุ์ . 2545. จุ ล ชี ว วิ ท ย า ท า ง อ า ห า ร . ก รุ ง เ ท พ ฯ : โ ร ง พิ ม พ์ ม ห า วิ ท ย า ลั ย ธ ร ร ม ศ า ส ต ร์ .16. ศรั ณ ย์ พรหมสาย. 2549. ก า ร แ ย ก แ ล ะ ก า ร คั ด ก ร อ ง แบคทีเ รีย กรดแลคติก ที่ส ามารถผลิต แบคทีร ิ โ อ ซิน .วิท ยานิพนธ์วิท ยาศาสตรมหาบั ณ ฑิ ต , สาขาชีว วิท ยา ค ณ ะ วิ ท ย า ศ า ส ต ร์ ม ห า วิ ท ย า ลั ย เ ชี ย ง ใ ห ม่ .17. อรอนงค์ พริ้ ง ศุ ล กะ. 2550. แบคที ริ โ อซิ น ที่ ส ร้ า งจาก แบคทีเรียแลคติก. บทความวิช าการ วารสารวิท ยาศาสตร์ ปี ท ี่ 23 (ฉ บั บ ที่ 2) ม ห า วิ ท ย า ลั ย ศ รี น ค ริ น ท ร วิ โ ร ฒ .
    • 18. อั จ ฉรา เพิ่ ม . 2549. แ บ ค ที เ รี ย แ ล ค ติ ก . กรุ ง เทพฯ: ห จ ก . ภ า พ พิ ม พ์19. Axelsson, L. 2004. Lactic acid bacteria : classification and physiology. In Salminen, S. and A. Wright. Lactic acid bacteria: microbiology and functional espects : third edition, revised and expanded. Marcel Dekker, Inc., New York.20. Jones, R.J., Hussein, H.M., Zagorec, M., Brightwell, G. and Tagg, J.R.2008. Isolation of lactic acid bacteria with inhibitory activity against pathogens and spoilage organisms associated with fresh meat. Food Microbiology. 25: 228-234.21. Tamang, J.P., Tamang, B., Schillinger, U., Guigas, C., Holzapfel , W.H. 2009. Funtional properties of lactic acid bacteria isolated from ethnic fermented vegetables of the Himalayas. International Journal of Food Microbiology 135, 28-33.22. Thongsanit, J., Tanikawa , M., Yano, S., Tachiki, T., and Wakayama, M. 2009. Identification of glutaminase-producing lactic acid bacteria isolated from Nham, a traditional Thai fermented food and characterisation of glutaminase activity of isolated Weissella cibaria. Annals of Microbiology. 59 (4): 715-720.