Mecanismos celulares de la NeuroinflamaciónGuadalupe MengodDepartamento de Neuroquímica y NeurofarmacologíaInstituto de Investigaciones Biomédicas de Barcelona (IIBB)CSIC XXIV Reunión Anual del Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente Mexico DF Octubre 2009

¿Qué es la neuroinflamación?La inflamación es la compleja respuesta biológica de los tejidos vascularizados a heridas o infecciones. Del latín inflammare (prender fuego) se definió históricamente por los síntomas clínicos de dolor, enrojecimiento, calor, hinchazón y pérdida de funciónLa reacción inflamatoria que caracteriza a muchas enfermedades neurodegenerativas se denomina “NEUROINFLAMACIÓN” e intervienen componentes del sistema immunológico.

NeuroinflamaciónElementos celulares importantes que intervienen en la neuroinflamación: La barrera hematoencefálica Células T Microglía/macrófago Astroglía

La barrera hematoencefálica

Células T

Microglía/macrófago

Astroglía

BHE: definiciónLa BHE es el mediador clave entre la circulación periférica y el cerebroLa BHE es una barrera endotelial activa y selectiva presente en los capilares en el cerebroCapilares cerebrales humanos representan la mayor superficie entre la interfase sangre-SNC650 Km de longitud10-20 m2 de superficieCeccheli et al, 2007

650 Km de longitud

10-20 m2 de superficie

BHE: definiciónAhora se acepta que existen varias barreras hematoencefálicas. Epitelio AracnoideRansohof et al, 2003Abbot 2005

BHE: composición celularLa BHE está formada por :Células endoteliales alrededor de los capilares que tienen tight junctions, rodeadas por una membrana basal continuaElementos perivasculares:Astrocitos (modulan el fenotipo de la BHE)Neuronas perivascularesPericitosUnidad neurovascularLa entrada de moléculas en el cerebro está estrechamente regulada e influenciada por los componentes celulares de la Unidad Neurovascular.Ceccheli et al, 2007

Células endoteliales alrededor de los capilares que tienen tight junctions, rodeadas por una membrana basal continua

Elementos perivasculares:

Astrocitos (modulan el fenotipo de la BHE)

Neuronas perivasculares

Pericitos

BHE : Tight JunctionsTight Junctions en células endotelialesLas “tight junctions” son estructuras dinámicas. Hacen inaccesible el cerebro a moléculas polares que la han de atravesar por mecanismos de transporte.Las proteínas de las TJ cambian de expresión, localización subcelular, modificaciones postraduccionales e interacciones proteína-proteína en condiciones fisiológicas y patológicas.Hawkins and Davis 2005

Las “tight junctions” son estructuras dinámicas.

Hacen inaccesible el cerebro a moléculas polares que la han de atravesar por mecanismos de transporte.

Las proteínas de las TJ cambian de expresión, localización subcelular, modificaciones postraduccionales e interacciones proteína-proteína en condiciones fisiológicas y patológicas.

BHE : ¿cómo funciona?Creación de un microambiente estable que asegura el disparo de las neuronas y propagación del potencial de acción. La BHE tiene relevancia clínica excepcional ya que su ruptura produce patologías graves.Impide la entrada de algunos fármacos en el cerebroLa presencia de enzimas intra y extracelulares (MAO, fosfatasa alcalina, peptidasas, cyt P450) le confiere actividad metabólica.En la BHE hay transportadores para AminoácidosGlucosaMicronutrientesElectrolitosHormonasPéptidosDesai et al, 2007

Creación de un microambiente estable que asegura el disparo de las neuronas y propagación del potencial de acción.

La BHE tiene relevancia clínica excepcional ya que su ruptura produce patologías graves.

Impide la entrada de algunos fármacos en el cerebro

La presencia de enzimas intra y extracelulares (MAO, fosfatasa alcalina, peptidasas, cyt P450) le confiere actividad metabólica.

Aminoácidos

Glucosa

Micronutrientes

Electrolitos

Hormonas

Péptidos

BHE : ¿cómo funciona?De especial interés para el diseño de estrategias de entrada de fármacos en el SNC es la presencia en la BHE de sistemas de transporte de eflujos.Entrada de nutrientes esenciales, glucosa,aminoácidos o moléculas relacionadas como L-DOPA, hay proteínas de membrana específicas presentes en la membrana de las células endoteliales.La P-glycoprotein, Bombea en sentido contrario moléculas lipofílicas desde el cerebro o desde las células endoteliales a la sangre. Es una parte funcional de la BHE ya que los ratones KO muestran una sensibilidad aumentada a fármacos de la circulación y toxinas que se quedan acumuladas en el cerebro a niveles más elevados de lo normal.Desai et al, 2007

Entrada de nutrientes esenciales, glucosa,aminoácidos o moléculas relacionadas como L-DOPA, hay proteínas de membrana específicas presentes en la membrana de las células endoteliales.

La P-glycoprotein,

Bombea en sentido contrario moléculas lipofílicas desde el cerebro o desde las células endoteliales a la sangre.

Es una parte funcional de la BHE ya que los ratones KO muestran una sensibilidad aumentada a fármacos de la circulación y toxinas que se quedan acumuladas en el cerebro a niveles más elevados de lo normal.

BHE : alteraciones en enfermedadesFallo de la BHE es un incidente crucial en el desarrollo y progresión de varias enfermedades del SNCAumento en su permeabilidadischemic stroketraumatic brain injuryApertura de la BHEEsclerosis múltipleNo tan claro en otras enfermedades neurodegenerativasParkinsonAlzheimer

Aumento en su permeabilidad

ischemic stroke

traumatic brain injury

Apertura de la BHE

Esclerosis múltiple

No tan claro en otras enfermedades neurodegenerativas

Parkinson

Alzheimer

BHE : alteraciones en enfermedadesRutas de entrada de leucocitos en el cerebroRansohoff et al . Nat Rev Immunol 2003

Las células gliales en el sistema nervioso centralLa neuroglia, está formada principalment por tres tiposcellulares: oligodendroglía, astroglía y microglía. Constituyen un sistema trófico y de soporte para las neuronas.Oligodendroglía: responsable de la producción y mantenimiento de la mielina en los axones del SNC. Presentan menos prolongaciones y ramificaciones que los astrocitosAstroglía:Secretan factores que modulan neuronas y las otras neuroglías.Microglía: Se encuentra en todo el SNC y constituye el sistema immunitario local del cerebro. Tienen capacidad de migrar, fagocitar y producir respuestas inflamatorias, liberando diversos factores que modulan la actividad neuronal.

Estados de la microglíaResting: quiescentes tienen una morfología ramificada que se adapta a su microambiente. También tienen una morfología nuclear característica con mucha heterocromatinaActivated but non-phagocytic: activada o reactiva. En respuesta a una agresión neuronal subletal. Se vuelve hipertrófica. Prolifera pero no fagocita.Activated phagocytic: activada ameboide. En respuesta a una agresión neuronal letal. Son los macrófagos del cerebro (pueden expresar marcadores específicos de macrófagos como el ED1.

Los tres estados de la microglía: características-++-++-++---+++++---/++++++-++-/+ + +-/+ + +-++activadaquiescentefagocíticaProliferación …………………………………………… Migración………………………………………………. Vimentina ……………………………………………... GFAP ………………………………………………….. Griffonia simplicifolia B4-isolectina …………………. Marcadores de macrófagos (ED1, ED2,OX-41) ….. Receptor de complemento CR3 (OX-42) ………….. Antígeno MHC classe I (OX-18) ……………………. Antígeno MHC classe I (OX-6) ……………………… Antígeno CD4 (W3/25) ………………………………. Antígeno común de los leucocitos (OX-1) ………….

Modelos de activación de la microglíaPerry et al Nat Rev Immunol 2007

Modelos de activación de la microglíaPerry et al Nat Rev Immunol 2007

Neuroinflamación-Activación microglialMicroglía quiescente(ramificada)Incremento de lafagocitosisLesión, infecciones,desequilibrios en la homeostasis del calcio, etc.Microglía activada(ameboide)Incremento de la proliferaciónLiberación de citocinas(IL-1, IL-1, IL-6,TNF-)Expresión de iNOS y liberación desubstancies neurotóxicasNO, ROS...Expresión de receptores de membrana(molécules MHC, receptores del sistema del complemento)Migración alfoco de inflamación o de dañoActivación de factores de transcripción(NFB)

Células y neuroinflamaciónPopovich and Longbrake (2008) Nat Rev Nsc

PhosphodiesterasecAMP or cGMPAMP or GMPThe PDE superfamily consists of 11 members of which PDE4, 7 and 8 specifically hydrolyze cAMP

Alterations in mRNA expression during neuroinflammation

cAMPlevelsInflammatoryreaction cAMP inhibition function of cells involved in immune responserelease of proinflammatory mediatorsMolecular regulation of cAMP signaling in neuroinflammationcAMP-PDEs inhibition(PDE4, PDE7 y PDE8)Beavo 2001

PDEs en InflamaciónRespuesta AntiinflamatoriaAMPcInhibidores PDEInhibidores selectivos PDE4RolipramSupresión o estimulación de citocinasInhibición producción TNFPDE4B implicada en la respuesta inflamatoria inducida por LPS en células inmunes (Jin et al., 2005). PDE4B2 en cerebro de rata en un modelo animal de Esclerosis Múltiple (EAE) (Reyes-Irisarri et al., 2007).

Supresión o estimulación de citocinas

Inhibición producción TNF

PDE4B implicada en la respuesta inflamatoria inducida por LPS en células inmunes (Jin et al., 2005).

 PDE4B2 en cerebro de rata en un modelo animal de Esclerosis Múltiple (EAE) (Reyes-Irisarri et al., 2007).

Inhibition of the PDE4-familySelective inhibition, both in vitro and in vivo, of PDE4 has several proven anti-inflammatory effects (Banner and Trevethick, 2004)

LPSTNFAMPc(+ PDE inh)Ratón wtLPSLPSTNFTNF= rata control90%PDE4B knock outPDE4D knock outInflamación inducida por LPSLPSTNFRatón wtJin and Conti, 2005

Esclerosis múltipleEnfermedad inflamatoria neurodegenerativa caracterizada por la desmielinización de haces de nervios en el SNC. Los síntomas dependen del lugar de la lesión, pero incluyen pérdida sensorial, debilidad en los músculos de las piernas, dificultades de hablar , falta de coordinación, mareos.‘tHart et al, Trends Mol Med 2009

Esclerosis múltipleMarcadores neuropatológicos: La placa desmielinizadaInfiltrados de células inmunes en el parénquima cerebralÁrea hipocelular caracterizada por pérdida de mielina axones relativamente preservados formación de cicatrices de astrocitosImagen de Resonancia Magnética de una paciente de 25 años con EM, con lesiones múltiples en sustancia blanca del área periventricularNoseworthy et al., (2000) New Engl J MedHan et al., (2008) Nature

La placa desmielinizada

Infiltrados de células inmunes en el parénquima cerebral

pérdida de mielina

axones relativamente preservados

formación de cicatrices de astrocitos

Esclerosis múltipleTipos de placas: activas e inactivas pons humanoglia/MImm CD45MielinaLuxol fast blue periódic acid-schiftPlaca activa (nueva formación)Placa inactivaMielinaMyelin HeidenhainMNisslPrineas etal .1993 Ann Neurol

PDE4 y neuroinflamaciónModelos animales de neuroinflamaciónEncefalomielitis autoimmune experimental, EAE, inducida en ratas y ratones como modelo animal de esclerosis múltiple.Neuroinflamación inducida por LPS en ratas y ratones.

Encefalomielitis autoimmune experimental, EAE, inducida en ratas y ratones como modelo animal de esclerosis múltiple.

Neuroinflamación inducida por LPS en ratas y ratones.

PDE4 y EAEEncephalomielitis autoimmune experimental : EAE Utilizado como modelo animal de esclerosis múltiple .Enfermedad neuroinflamatoria inducida por inmunización activa contra la mielina en animales genéticamente susceptibles. Los animales se califican entre 1 y 5 según los síntomas clínicos.Caracterizada por infiltrados celulares, células T, macrófagos y células B en la médula espinal y el cerebro.Tratamiento con inhibidores de PDE4 reducen la EAE así como el número de infiltrados y altera el perfil temporal de expresión de las citocinas proinflamatorias.

Utilizado como modelo animal de esclerosis múltiple .

Enfermedad neuroinflamatoria inducida por inmunización activa contra la mielina en animales genéticamente susceptibles. Los animales se califican entre 1 y 5 según los síntomas clínicos.

Caracterizada por infiltrados celulares, células T, macrófagos y células B en la médula espinal y el cerebro.

Tratamiento con inhibidores de PDE4 reducen la EAE así como el número de infiltrados y altera el perfil temporal de expresión de las citocinas proinflamatorias.

PDE4 y EAEPDE4B mRNA splicing variants expression in EAE ratsControlT-cells 10 days p.i.PDE4B2/ dig TcRT-cells (CD3)PDE4B2PDE4B113 days p.i.PDE4B mRNA splicing variantsin EAE 13 days p.i.Macrophages/Microglia PDE4B2/ dig PAFRMicroglia (CD68)PDE4B4PDE4B3PDE4B mRNAReyes-Irrisari et al, 2007

PDE4 y neuroinflamaciónModelos animales de neuroinflamaciónEncefalomielitis autoimmune experimental, EAE, inducida en ratas y ratones como modelo animal de esclerosis múltiple.Neuroinflamación inducida por LPS en ratas y ratones.

Encefalomielitis autoimmune experimental, EAE, inducida en ratas y ratones como modelo animal de esclerosis múltiple.

Neuroinflamación inducida por LPS en ratas y ratones.

Modelo neuroinflamación por LPS Expresión de marcadores inflamatorios.Control24hControl3hCOX-2AstrogliosisIL-1βActivación endotelial

Expresión de marcadores inflamatorios.

Modelo neuroinflamación por LPS Expresión de marcadores inflamatorios.Activación microglial

Expresión de marcadores inflamatorios.

Modelo neuroinflamación por LPS Cambios de expresión a nivel de ARNm de PDE4.PDE4BPDE4B2PDE4B3Control3h8h

Cambios de expresión a nivel de ARNm de PDE4.

Modelo neuroinflamación por LPS Cambios de expresión a nivel de ARNm de PDE4.PDE4BPDE4B2PDE4B3Control3h8h

Cambios de expresión a nivel de ARNm de PDE4.

Modelo neuroinflamación por LPS Caracterización celular de los cambios de expresión por LPS.PDE4B3PDE4B225%OligodendrocitosEndotelioMicroglíaNeuronasAstrocitosAstrocitos

Caracterización celular de los cambios de expresión por LPS.

PDE4 y neuroinflamaciónConclusionsPDE4B2 en células endoteliales, microgñia y astrocitos.PDE4B3 en oligodendrocitos, astrocitos y neuronas.PDE4B2 en microglia y células T.PDE4 está involucrado en procesos neuroinflamatorios y constituye una clara diana terapeútica para el desarrollo de fármacos. Dissect the cAMP role in EAE and neuroinflammation by analyzing the induction of EAE in transgenic mouse lines for some of the molecules involved in cAMP signaling.

Grupo de Neurofarmacología MolecularEmily JohanssonCristina SanabraGiuseppe MocciAnna García MirallesRocío RodríguezSilvia SerranoRocío MartínDra. Elisabet ReyesDra. Patricia de GortariDr Julián de AlmeidaDra. Roser CortésDra. M.Teresa VilaróProf. Guadalupe MengodFinanciación: CICYT, CIBERNED, MARATÓ TV3, FIS.