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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

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PCR PCR Presentation Transcript

  • Universidad de ChileFacultad de MedicinaEscuela de Tecnología MédicaBioquímica II PCR Reaccion en cadena de la polimerasa Integrantes: Bárbara Avello Paulina Campos Profesor Guía: Isabel Castro
  • Un poco de historia… Técnica desarrollada en 1985 por el Bioquímico Estadounidense Kary B. Mullis quien recibió el premio Nobel de Química de 1993. Esta tecnica resultó ser una revolución en la investigación biológica y médica.
  • Definición de PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa Técnica de Biología Molecular que tiene porobjetivo la amplificación directa de un gen (ofragmento de DNA) o indirecta de un RNA,presente en mezclas de muy diversas fuentes. * No es necesaria una purificación previa de la muestra íntegra original.
  •  Tiene la capacidad de amplificar millones de veces fragmentos pequeños de DNA de hasta 10 Kb (10.000 pares de bases), en un período de tiempo relativamente corto. Es un método muy adecuado para preparar ácidos nucleicos en una cantidad muy superior a la de la muestra original.
  • Objetivo básico de la PCR AMPLIFICACION Para disponer de cantidad suficiente como para utilizarlo con fines diversos.AMPLIFICAR DNA DETECCION Para poderlo detectar en muestras con pequeñas cantidades del DNA diana.
  • FundamentosMimetiza el proceso de replicación Complementariedad BN Capacidad del DNA paradesnaturalizarse/ renaturalizarse
  • Requerimientos1.- Muestra (templado o molde: DNA o cDNA)2.- Primers3.- DNA polimerasa resistente a alta temperatura4.- Mg++5.- Desoxinucleótidos trifosfatos – dNTPs (dATP, dGTP,dCTP, dTTP)6.- Buffer, KCl
  • 1.- Templado o Molde Molécula que contiene la región de DNA que se quiere amplificar. Puede ser DNA o cDNA. Se requiere poca cantidad.No debe ser necesariamentepuro. Tiene que ser libre de altasconcentraciones de EDTA ocationes que pueden actuarcomo quelantes.
  • 2.-Primers (iniciadores, partidores o cebadores) 2 oligonucleótidos sintéticos que flanquean a la región blanco, uniéndose por complementariedad de bases a cada uno de los extremos del fragmento de DNA que se quiere amplificar. Primer sentido Primer antisentido
  •  Deben ser específicos para la secuencia a amplificar. Deben tener idealmente un alto % de C+G, entre un 40-60%. Deben evitar ser complementarios entre si, especialmente en el extremo 3´. Deben evitar formar estructuras secundarias. Generalmente su longitud debe variar entre 18 y 30 pb.
  •  La concentracion debe ser adecuada para favorecer la hibridacion entre el molde y el primer. Ambos primers deben tener una Tm (temperatura de melting) similar,con una diferencia de no mas de 5ºC. Tm = [2 x (A + T) + 4 x (G + C)] – 5 La temperatura de annealing o de hibridacion (Ta) debe ser aprox. 5ºC menos que los valores de Tm obtenidos.
  • 3.- DNA polimerasaCaracterísticas que debe tener la enzima: PROCESIVIDAD FIDELIDAD TERMOESTABLE
  • Taq DNA polimerasa Termoestable:-Aislada de Thermus aquaticus (vive en aguastermales).-Comete un error cada 10.000 nucleótidos.-Su temperatura optima de actuación es a72ºC.-Su concentracion varia entre 1 a 2 unidadesde enzima por cada 100µL de reaccion.-No posee la actividad editora o correctora (3`exonucleasa). Otras DNA polimerasas termoestables, obtenidas de bacterias termófilas: Pwo Pyrococcus woesei Pfu Pyrococcus furiosus Tli Thermococcus littoralis
  • 4.- Mg++ (MgCl2, MgSO4)Mg++ es un cofactor de DNA polimerasas.Determinar la [Mg++] óptima es uno de lospasos más importantes en la puesta a punto deuna PCR. [Mg++] muy bajas : la polimerasa no funcionacorrectamente, afectando el rendimiento de lareacción. [Mg++] muy altas :favorece amplificacionesinespecificas, afectando la especificidadreacción.
  • 5.- Desoxinucleótidos trifosfato(dNTPs) Provee de nucleotidos (base+ azucar + fosfato) a la reaccion para la sintesis de DNA. Deben estar presentes en cantidad suficiente para que se logre la extensión a lo largo de todos los ciclos (~200 µM cada dNTP). No deben estar en exceso para que los iones Mg++ no estén formando complejos con los dNTPs.
  • 6.- Buffer y salesBuffer Mantiene el pH optimo paraque la enzima actúe.El buffer es en general Tris baseajustado a un pH específico con HCl. pH óptimo para Taq: 8.3Sales KCl: contribuye al plegamientocorrecto de la enzima.
  • Aditivos adyuvantesExisten una serie de reactivos que pueden contribuir a la reacción de amplificación. Formamida y el dimetil-sulfóxido (DMSO) Glicerol
  • Equipos: TermocicladorInstrumento programado para cambiar la temperatura de las muestras rápidamente desde una temperatura a otra.
  • PCR convencional en el laboratorio1.Creación del Primer 2.Extracción de DNA (o RNA) 3. PCR 4. Detección de resultados
  • 1. Creación del primer Los primer o cebadores (compuestos por oligonucleótidos específicos) son sintetizados químicamente. *Para realizar esta labor se utilizan bases de dato universales y programas computacionales que establecen la secuencia primer para un gen determinado.
  • 2. Extracción de DNA Se extrae el DNA genómico desde la muestra a analizar*Para esto existen Kitscomerciales que aseguran:  Alto rendimiento.  Alta pureza. Gran cantidad de DNA
  •  La correcta extracción de DNA o RNA se comprueba mediante la determinación de:Integridad y concentración aproximada de DNA o RNA (electroforesis en gel de agarosa 1%)Relación Ác. Nucleicos/Proteínas (ABS a 260/280 con espectrofotometro)
  • 3. PCR y sus etapas 3.1 Desnatura- lización del DNA 3.3 3.2 Unión del Elongación iniciador a la secuencia de la complementa cadena -ria
  • 3.1 Desnaturalización del DNAEl DNA molde de doble hebra esdesnaturalizado por calor a un t° por encima desu punto de fusiónT° inicial del PCR: 95°C por 5 minT° inicial de cada ciclo: 95°C por 30 seg.
  • 3.2 Alineamiento/unión del iniciador a la secuencia complementariaSe desciende la t° lo suficiente para queocurra la hibridación entre los cebadores y elDNA molde.T° ideal: 65°C por 45 seg.
  • 3.3 Extensión/elongación de las cadenasLa t° es nuevamente aumentada parafavorecer la actividad catalítica de lapolimerasa la cual se ha unido al extremo delduplex molde-cebador.T° ideal en cada ciclo: 72°C por 45 seg.T° Final: 72°C por 10 min.
  • *Amplificación exponencial
  • 4. Detección de resultados La detección del producto del PCR se realiza normalmente mediante una electroforesis. *Electroforesis en gel de agarosa, revelado con rayos UV gracias a la utilización de bromuro de etidio (colorante)
  • Precauciones Contaminación con DNA
  • Controles Control sin molde. Control positivo. Control de primers.
  • Ventajas Desventajas Velocidad Secuencia Facilidad Tamaño limitado Contaminaciones Sensibilidad (por sensibilidad) Muestras
  • Aplicaciones PCR Huella digital genética. Test de paternidad. Detección de enfermedades hereditarias. Comparación de la expresión génica. Clonamiento de genes. Mutagénesis. Análisis de DNA antiguo. Genotipificacion de polimorfismos
  • Bibliografía Texto Ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética (Conceptos, Técnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud), José Luque y Ángel Herráez. Biología molecular y Biotecnología (2da edición), J.M. Walker y E. B. Gingold. 1997