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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

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PCR

  1. 1. Universidad de ChileFacultad de MedicinaEscuela de Tecnología MédicaBioquímica II PCR Reaccion en cadena de la polimerasa Integrantes: Bárbara Avello Paulina Campos Profesor Guía: Isabel Castro
  2. 2. Un poco de historia… Técnica desarrollada en 1985 por el Bioquímico Estadounidense Kary B. Mullis quien recibió el premio Nobel de Química de 1993. Esta tecnica resultó ser una revolución en la investigación biológica y médica.
  3. 3. Definición de PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa Técnica de Biología Molecular que tiene porobjetivo la amplificación directa de un gen (ofragmento de DNA) o indirecta de un RNA,presente en mezclas de muy diversas fuentes. * No es necesaria una purificación previa de la muestra íntegra original.
  4. 4.  Tiene la capacidad de amplificar millones de veces fragmentos pequeños de DNA de hasta 10 Kb (10.000 pares de bases), en un período de tiempo relativamente corto. Es un método muy adecuado para preparar ácidos nucleicos en una cantidad muy superior a la de la muestra original.
  5. 5. Objetivo básico de la PCR AMPLIFICACION Para disponer de cantidad suficiente como para utilizarlo con fines diversos.AMPLIFICAR DNA DETECCION Para poderlo detectar en muestras con pequeñas cantidades del DNA diana.
  6. 6. FundamentosMimetiza el proceso de replicación Complementariedad BN Capacidad del DNA paradesnaturalizarse/ renaturalizarse
  7. 7. Requerimientos1.- Muestra (templado o molde: DNA o cDNA)2.- Primers3.- DNA polimerasa resistente a alta temperatura4.- Mg++5.- Desoxinucleótidos trifosfatos – dNTPs (dATP, dGTP,dCTP, dTTP)6.- Buffer, KCl
  8. 8. 1.- Templado o Molde Molécula que contiene la región de DNA que se quiere amplificar. Puede ser DNA o cDNA. Se requiere poca cantidad.No debe ser necesariamentepuro. Tiene que ser libre de altasconcentraciones de EDTA ocationes que pueden actuarcomo quelantes.
  9. 9. 2.-Primers (iniciadores, partidores o cebadores) 2 oligonucleótidos sintéticos que flanquean a la región blanco, uniéndose por complementariedad de bases a cada uno de los extremos del fragmento de DNA que se quiere amplificar. Primer sentido Primer antisentido
  10. 10.  Deben ser específicos para la secuencia a amplificar. Deben tener idealmente un alto % de C+G, entre un 40-60%. Deben evitar ser complementarios entre si, especialmente en el extremo 3´. Deben evitar formar estructuras secundarias. Generalmente su longitud debe variar entre 18 y 30 pb.
  11. 11.  La concentracion debe ser adecuada para favorecer la hibridacion entre el molde y el primer. Ambos primers deben tener una Tm (temperatura de melting) similar,con una diferencia de no mas de 5ºC. Tm = [2 x (A + T) + 4 x (G + C)] – 5 La temperatura de annealing o de hibridacion (Ta) debe ser aprox. 5ºC menos que los valores de Tm obtenidos.
  12. 12. 3.- DNA polimerasaCaracterísticas que debe tener la enzima: PROCESIVIDAD FIDELIDAD TERMOESTABLE
  13. 13. Taq DNA polimerasa Termoestable:-Aislada de Thermus aquaticus (vive en aguastermales).-Comete un error cada 10.000 nucleótidos.-Su temperatura optima de actuación es a72ºC.-Su concentracion varia entre 1 a 2 unidadesde enzima por cada 100µL de reaccion.-No posee la actividad editora o correctora (3`exonucleasa). Otras DNA polimerasas termoestables, obtenidas de bacterias termófilas: Pwo Pyrococcus woesei Pfu Pyrococcus furiosus Tli Thermococcus littoralis
  14. 14. 4.- Mg++ (MgCl2, MgSO4)Mg++ es un cofactor de DNA polimerasas.Determinar la [Mg++] óptima es uno de lospasos más importantes en la puesta a punto deuna PCR. [Mg++] muy bajas : la polimerasa no funcionacorrectamente, afectando el rendimiento de lareacción. [Mg++] muy altas :favorece amplificacionesinespecificas, afectando la especificidadreacción.
  15. 15. 5.- Desoxinucleótidos trifosfato(dNTPs) Provee de nucleotidos (base+ azucar + fosfato) a la reaccion para la sintesis de DNA. Deben estar presentes en cantidad suficiente para que se logre la extensión a lo largo de todos los ciclos (~200 µM cada dNTP). No deben estar en exceso para que los iones Mg++ no estén formando complejos con los dNTPs.
  16. 16. 6.- Buffer y salesBuffer Mantiene el pH optimo paraque la enzima actúe.El buffer es en general Tris baseajustado a un pH específico con HCl. pH óptimo para Taq: 8.3Sales KCl: contribuye al plegamientocorrecto de la enzima.
  17. 17. Aditivos adyuvantesExisten una serie de reactivos que pueden contribuir a la reacción de amplificación. Formamida y el dimetil-sulfóxido (DMSO) Glicerol
  18. 18. Equipos: TermocicladorInstrumento programado para cambiar la temperatura de las muestras rápidamente desde una temperatura a otra.
  19. 19. PCR convencional en el laboratorio1.Creación del Primer 2.Extracción de DNA (o RNA) 3. PCR 4. Detección de resultados
  20. 20. 1. Creación del primer Los primer o cebadores (compuestos por oligonucleótidos específicos) son sintetizados químicamente. *Para realizar esta labor se utilizan bases de dato universales y programas computacionales que establecen la secuencia primer para un gen determinado.
  21. 21. 2. Extracción de DNA Se extrae el DNA genómico desde la muestra a analizar*Para esto existen Kitscomerciales que aseguran:  Alto rendimiento.  Alta pureza. Gran cantidad de DNA
  22. 22.  La correcta extracción de DNA o RNA se comprueba mediante la determinación de:Integridad y concentración aproximada de DNA o RNA (electroforesis en gel de agarosa 1%)Relación Ác. Nucleicos/Proteínas (ABS a 260/280 con espectrofotometro)
  23. 23. 3. PCR y sus etapas 3.1 Desnatura- lización del DNA 3.3 3.2 Unión del Elongación iniciador a la secuencia de la complementa cadena -ria
  24. 24. 3.1 Desnaturalización del DNAEl DNA molde de doble hebra esdesnaturalizado por calor a un t° por encima desu punto de fusiónT° inicial del PCR: 95°C por 5 minT° inicial de cada ciclo: 95°C por 30 seg.
  25. 25. 3.2 Alineamiento/unión del iniciador a la secuencia complementariaSe desciende la t° lo suficiente para queocurra la hibridación entre los cebadores y elDNA molde.T° ideal: 65°C por 45 seg.
  26. 26. 3.3 Extensión/elongación de las cadenasLa t° es nuevamente aumentada parafavorecer la actividad catalítica de lapolimerasa la cual se ha unido al extremo delduplex molde-cebador.T° ideal en cada ciclo: 72°C por 45 seg.T° Final: 72°C por 10 min.
  27. 27. *Amplificación exponencial
  28. 28. 4. Detección de resultados La detección del producto del PCR se realiza normalmente mediante una electroforesis. *Electroforesis en gel de agarosa, revelado con rayos UV gracias a la utilización de bromuro de etidio (colorante)
  29. 29. Precauciones Contaminación con DNA
  30. 30. Controles Control sin molde. Control positivo. Control de primers.
  31. 31. Ventajas Desventajas Velocidad Secuencia Facilidad Tamaño limitado Contaminaciones Sensibilidad (por sensibilidad) Muestras
  32. 32. Aplicaciones PCR Huella digital genética. Test de paternidad. Detección de enfermedades hereditarias. Comparación de la expresión génica. Clonamiento de genes. Mutagénesis. Análisis de DNA antiguo. Genotipificacion de polimorfismos
  33. 33. Bibliografía Texto Ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética (Conceptos, Técnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud), José Luque y Ángel Herráez. Biología molecular y Biotecnología (2da edición), J.M. Walker y E. B. Gingold. 1997

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