Instytut Genetyki Człowieka    Polskiej Akademii Nauk   Sprawozdanie z działalności         w 2003 roku             Poznań...
Spis treści                       strona   I. Informacje ogólne                                                  3  II. Wy...
XI. Wymiana osobowa    67XII. Inne ważne dane   69                            3
I. INFORMACJE OGÓLNEStruktura organizacyjna Instytutu Genetyki Człowieka PANDyrekcja:Dyrektor Instytutu                   ...
Działalność publikacyjna w 2003 roku:Pracownicy Instytutu opublikowali 68, w tym 20 w naukowych czasopismach zagranicznych...
Przychody Instytutu ogółem w roku 2003 wyniosły – 6.460.890 zł, w tym z działalnościstatutowej – 4.076.700 zł, z działalno...
II. WYBRANE WYNIKIGrupa tematyczna: „Molekularne i cytogenetyczne badania chorób genetycznych”   •   Wykazanie wielu różno...
Grupa tematyczna: „Badania genetyczne niepłodności oraz mechanizmy patofizjologiirozrodu”   •   Wykonano po raz pierwszy w...
III. SPRAWOZDANIE Z REALIZACJI ZADAŃ BADAWCZYCH1. MOLEKULARNE I CYTOGENETYCZNE BADANIA CHORÓB GENETYCZNYCHPoszukiwanie mut...
Analiza różnorodności genomowej w populacjach ludzkich.(E. Ziętkiewicz, D. Labuda)    Temat jest kontynuacją współpracy z ...
analizowanych mikrojąder stwierdzono występowanie całych chromatyd, a nie ichfragmentów. Liczba mikrojąder w komórkach wzr...
46-47,XY,inv(16)(p13q22),t(11;22)(q23;q13),+4,+22[13]46,XY,t(14;22)(q32;q11)[4]46,XX,t(7;10)(q34;q24)AML46,XYMLL46,XY[6]/4...
chimeryzm (u 2 utrzymuje się, u 1 z przewagą dawcy, u 2 z przewagą biorcy - podejrzeniewznowy). U 18 pacjentów obserwowano...
2. BADANIA STRUKTURY I FUNKCJI KWASÓW NUKLEINOWYCHEkspresja genów w tętniaku aorty brzusznej.(R. Słomski, K. Waliszewski, ...
Opracowanie metod wprowadzania konstrukcji genowych do komórek i selekcjakomórek dla potrzeb ksenotransplantacji.(R. Słoms...
lysis) zapobiega formowaniu kompleksu atakującego błonę komórkową (MAC – ang.membrane attack complex). Uważa się, że CD59 ...
powierzchniowego rezonansu plazmonowego i wyodrębniono z grupy pacjentów z alergią nasierść kota podgrupę uczulonych na bi...
Identyfikacja białek tworzących hipotetyczną „cząstkę zarodkową” wokół kompleksuNANOS1–PUMILIO2–DAZ w męskiej linii germin...
Czy mutacje genu PUMILIO2 są przyczyną niepłodności męskiej?(K. Kusz, B. Ginter, K. Ziółkowska, A. Spik, A. Latos-Bieleńsk...
Analiza DNA polega na multipleksowej amplifikacji 20 STS mapujących w regionie AZF(ang. Azoospermia Factor) długiego ramie...
(PS2; chromosom 1 q31-42). Analiza mutacyjna genów APP i PS została przeprowadzonaw grupie 55 chorych z wczesną postacią A...
3. IMMUNOGENETYCZNE ASPEKTY CHORÓB AUTOIMMUNIZACYJNYCH   I ZAKAŹNYCHBadanie aktywności i ekspresji telomerazy oraz długośc...
Występowanie wirusa TT u człowieka i zwierząt. Czy wirus TT może rozprzestrzeniaćsię pomiędzy ludźmi i zwierzętami?(I. Liw...
4. BADANIA GENETYCZNE NIEPŁODNOŚCI ORAZ MECHANIZMY   PATOFIZJOLOGII ROZRODUGenetyczne badania niepłodności męskiej, ze szc...
uzyskaniu komórek CD 34+, odtrawiano przy pomocy zestawu kuleczki ferrytynowe, przedpodaniem komórek pacjentom. W niektóry...
Charakterystyka biochemiczna antygenów indukujących przeciwciałaprzeciwplemnikowe, uzyskane z surowic dorosłych osobników ...
5. GENETYCZNE ASPEKTY PODATNOŚCI NA NOWOTWORY GŁOWY I SZYIZnaczenie receptora Ah w regulacji genów odpowiedzialnych za akt...
Rola polimorficznych genów metabolizmu kancerogenów i naprawy DNAw kształtowaniu ryzyka mnogich nowotworów regionu głowy i...
Badania nad podłożem genetycznym drugich pierwotnych nowotworów regionu głowy i szyi.(M. Kujawski, M. Rydzanicz, M. Wierzb...
IV. REALIZOWANE PROJEKTY BADAWCZEProjekty badawcze realizowane w ramach działalności statutowej InstytutuProjekty badawcze...
Projekty badawcze własne (granty)            Rodzaj projektu               Kierownik projektu       Okres           Koszt ...
Projekty badawcze własne (granty)            Rodzaj projektu              Kierownik projektu         Okres          Koszt ...
Projekty badawcze zamawiane            Rodzaj projektu              Kierownik projektu           Okres          Koszt     ...
Współpraca w projektach badawczych w innych placówkach                Rodzaj projektu                 Kierownik projektu  ...
Współpraca w projektach badawczych w innych placówkach                Rodzaj projektu                Kierownik projektu   ...
36
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
- pobierz plik
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

- pobierz plik

3,229 views
3,089 views

Published on

0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
3,229
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
2
Actions
Shares
0
Downloads
6
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

- pobierz plik

  1. 1. Instytut Genetyki Człowieka Polskiej Akademii Nauk Sprawozdanie z działalności w 2003 roku Poznań Styczeń 2004
  2. 2. Spis treści strona I. Informacje ogólne 3 II. Wybrane wyniki 6 III. Sprawozdanie z realizacji zadań badawczych 8 IV. Realizowane projekty badawcze 29 V. Publikacje 1. Prace wydane drukiem w czasopismach zagranicznych 35 2. Prace wydane drukiem w czasopismach krajowych 38 VI. Zjazdy, konferencje i zebrania naukowe 1. Za granicą a) wykłady 43 b) komunikaty 45 c) przewodniczenie sesjom 48 2. W kraju a) wykłady 49 b) komunikaty 57 c) przewodniczenie sesjom 58 VII. Organizacja konferencji, kursów naukowych i seminariów 60VIII. Współpraca z zagranicą 62 IX. Działalność dydaktyczna 63 X. Seminaria instytutowe 64 2
  3. 3. XI. Wymiana osobowa 67XII. Inne ważne dane 69 3
  4. 4. I. INFORMACJE OGÓLNEStruktura organizacyjna Instytutu Genetyki Człowieka PANDyrekcja:Dyrektor Instytutu Prof. dr hab. Jerzy NowakZastępca Dyrektora ds. naukowych Prof. dr hab. Ryszard SłomskiZastępca Dyrektora ds. admin. Mgr Małgorzata StreckerGłówna Księgowa Mgr Ewa Gawrońska-RatajczakPrzewodniczący Rady Naukowej: Prof. dr hab. Jan SteffenJednostki organizacyjne:• Zespół Genetyki Molekularnej i Klinicznej (Prof. dr hab. Michał Witt)• Zespół Funkcji Kwasów Nukleinowych (Prof. dr hab. Ryszard Słomski)• Zespół Immunogenetyki (Prof. dr hab. Jerzy Nowak)• Zespół Biologii Rozrodu (Prof. dr hab. Maciej Kurpisz)• Zespół Mutagenezy (Prof. dr hab. Krzysztof Szyfter)Uprawiane specjalności naukowe:• Genetyka molekularna i inżynieria genetyczna.• Patologia molekularna.• Cytogenetyka i genetyka kliniczna.• Immunogenetyka.• Biologia rozrodu.• Mutageneza.Zatrudnienie:W roku 2003 Instytut Genetyki Człowieka PAN zatrudniał 67 pracowników, w tym 29pracowników naukowych: samodzielnych pracowników naukowych – 9, adiunktów – 16,asystentów – 4, biologów – 17; pracowników technicznych – 11, pracowników administracjii księgowości – 10. 4
  5. 5. Działalność publikacyjna w 2003 roku:Pracownicy Instytutu opublikowali 68, w tym 20 w naukowych czasopismach zagranicznych.Wygłosili 20 wykładów na konferencjach zagranicznych i 71 referatów na konferencjachkrajowych. Ponadto na zjazdach krajowych i zagranicznych przedstawiono 35 doniesieńnaukowych w formie plakatów.Działalność naukowa w 2003 roku:Tematy badawcze działalności statutowej - 5Projekty badawcze finansowane przez KBN - 30 w tym: własne - 21 promotorskie - 3 zamawiane - 6Projekty zagraniczne -1Współpraca w projektach badawczych w innych placówkach - 13Tematy realizowane we współpracy z zagranicą - 20 W roku 2003 - 2 pracowników uzyskało stopnie doktora. Ponadto w Instytucie wykonano17 prac magisterskich. Wzorem lat ubiegłych w 2003 roku zorganizowano XV Szkołę Letnią z zakresu biologiimolekularnej przygotowaną przez Instytut Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu, KatedręBiochemii i Biotechnologii AR w Poznaniu i Komitet Genetyki Człowieka i PatologiiMolekularnej PAN, przy współudziale sponsorów. Pracownicy naukowi i część pracowników technicznych prowadziła zajęcia dydaktycznez zakresu genetyki człowieka i ekogenetyki dla studentów Akademii Medycznej, AkademiiRolniczej i Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu. 5
  6. 6. Przychody Instytutu ogółem w roku 2003 wyniosły – 6.460.890 zł, w tym z działalnościstatutowej – 4.076.700 zł, z działalności ogólnotechnicznej – 56.000 zł, z projektówbadawczych KBN – 1.610.332 zł. W ramach działalności statutowej środki finansowe na 1 zatrudnionego wyniosły – 75.494zł, na 1 zatrudnionego w działalności podstawowej – 90.593 zł, na 1 pracownika naukowego– 163.068 zł. Ogółem środki finansowe na 1 zatrudnionego pracownika – 119.646 zł, na 1 zatrudnionegow działalności podstawowej – 143.575 zł, na 1 zatrudnionego pracownika naukowego –258.436 zł. 6
  7. 7. II. WYBRANE WYNIKIGrupa tematyczna: „Molekularne i cytogenetyczne badania chorób genetycznych” • Wykazanie wielu różnorodnych mutacji genu DNAH5 u polskich chorych na pierwotną dyskinezę rzęsek. • Na podstawie analizy różnorodności haplotypu dys44 stwierdzono, że współczesna różnorodność gatunku H. sapiens, zdominowana przez linię afrykańską, zawiera również domieszkę starszych linii ewolucyjnych. • Stwierdzenie częstszego niż u osób młodych występowania translokacji między chromosomami pary 9 i chromosomami akrocentrycznymi w grupie polskich osób stuletnich.Grupa tematyczna: „Badania struktury i funkcji kwasów nukleinowych” • Opracowanie metod wprowadzania konstrukcji genowych do komórek i selekcja komórek dla potrzeb ksenotransplantacji. • Przygotowanie konstrukcji genowych do modyfikacji świń dla pozyskiwania organów do transplantacji u człowieka. • Porównanie ekspresji i regulacja ekspresji hormonu wzrostu człowieka w gruczole mlekowym transgenicznego królika w badanich in vivo i in vitro. • Wdrożenie nowych metod wykrywania mutacji w genie APC warunkującym występowanie rodzinnej polipowatości jelita grubego. • Wykazano, że różnorodność fenotypów płciowych pacjentów 46,XX(SRY+) może być spowodowana zróżnicowanym poziomem ekspresji genu SRY wynikającym z „efektu pozycji”. • Stwierdzono, że mutacje punktowe genu NANOS1 prowadzą do fenotypu „czystej niepłodności” mężczyzn. Fenotypy pacjentów obarczonych mutacjami NANOS1 wskazują na rolę tego genu w samoodnawianiu macierzystych komórek męskiej linii germinalnej.Grupa tematyczna: „Immunogenetyczne aspekty chorób autoimmunizacyjnychi zakaźnych” • Wykazano brak korelacji pomiędzy wysoką aktywnością i ekspresją telomerazy w blastach białaczkowych a długością telomerów. • Wyniki badań wewnątrzrodzinnej transmisji wirusa C zapalenia wątroby wskazują na matki jako pierwotne źródło zakażenia dzieci z ryzykiem zakażenia HCV wynoszącym 16,67%. • Stwierdzono wyższą amplifikację i ekspresję sekwencji pol MSRV u pacjentów z SM, co może wskazywać na udział tego retrowirusa w patogenezie stwardnienia rozsianego. • Występowanie jedynie sekwencji TTV-podobnych u zwierząt nie uzasadnia hipotezy o rozprzestrzenianiu się wirusa TTV pomiędzy ludźmi i zwierzętami. • Zidentyfikowano, w obrębie ludzkiego genu delta receptora limfocytów T (TCRD), nowe zgrupowanie siedmiu elementów rekombinacyjnych delta (δRec2.1−2.7). 7
  8. 8. Grupa tematyczna: „Badania genetyczne niepłodności oraz mechanizmy patofizjologiirozrodu” • Wykonano po raz pierwszy w świecie, we współpracy z Oddziałem Kardiologicznym Szpitala Wojewódzkiego w Poznaniu, przezskórne podanie macierzystych komórek mięśniowych do pozawałowego mięśnia sercowego, z wykorzystaniem żył wieńcowych. • Wykazano istnienie izoform genów SPANX, odpowiedzialnych za wywoływanie procesu nowotworowego, a jednocześnie czynnie uczestniczących w procesie spermatogenezy.Grupa tematyczna: „Genetyczne aspekty podatności na nowotwory głowy i szyi” • W zakresie badań nad podłożem genetycznym drugich (mnogich) nowotworów pierwotnych krtani ustalono: (i) znacząco podwyższone wskaźniki niestabilności chromosomowej w porównaniu z grupą osób zdrowych oraz chorych z pojedynczym nowotworem oraz (ii) oceniono rozkład genotypów genów kodujących enzymy metabolizujące kancerogeny oraz enzymy naprawcze, wskazując na te, które znacząco podwyższają ryzyko wystąpienia drugich pierwotnych nowotworów oraz te, które mają znaczenie ochronne. • Oceniono polimorfizm genu CYP2D6, kodującego enzym odpowiedzialny za aktywacje metaboliczną N-nitrozoamin oraz szeregu leków (debryzochina, sparteina) pod kątem udziału w kształtowaniu ryzyka wystąpienia tytonio-zależnego raka krtani. • W wybranych loci chromosomowych (3p13, 8p22, 9p) wykazano wysoki poziom utraty heterozygotyczności (LOH) w tkance prawidłowej krtani zarówno w bezpośrednim sąsiedztwie genu, jak i (w mniejszym stopniu) w dystalnej wobec guza części krtani. • Kontynuacja badań nad indukcją białka wiążącego β-naftoflawon wykazały funkcjonalne powiązanie tego białka z cytochromem 1A1. 8
  9. 9. III. SPRAWOZDANIE Z REALIZACJI ZADAŃ BADAWCZYCH1. MOLEKULARNE I CYTOGENETYCZNE BADANIA CHORÓB GENETYCZNYCHPoszukiwanie mutacji w genach DNAI1 i DNAH5 u chorych z pierwotną dyskineząrzęsek i zespołem Kartagenera.(M. Witt, E. Ziętkiewicz, M. Geremek, K. Borowski, K. Więckiewicz, K. Pilc, E. Rutkiewicz) Temat jest kontynuacją prowadzonych od lat badań mających na celu wyjaśnieniegenetycznego podłoża pierwotnej dyskinezy rzęsek (PCD) i zespołu Kartagenera (KS).Jednym z zadań projektu jest próba identyfikacji mutacji w genach kandydatach. Gen DNAI1,zlokalizowany w 9p13-21, składa się z 20 eksonów, ulega ekspresji w tchawicy i jądrachi koduje pośredni łańcuch dyneiny aksonemalnej, wchodzący w skład zewnętrznych ramiondyneinowych stanowiacych jeden z podstawowych elementów strukturalnych aparaturzęskowego. Gen DNAH5, zlokalizowany w chromosomie 5p, składa się z 79 eksonówi koduje ciężki łańcuch dyneiny aksonemalnej, wchodzący w skład zewnętrznych ramiondyneinowych. Badania w innych laboratoriach wykazały obecność różnych mutacji zarównow DNAI1 [Pennarun et al. 1999; Zariwala et al. 2001] jak i DNAH5 [Olbrich et al. 2002]w patogenezie niektórych (choć nie wszystkich) przypadków PCD/KS. Ze względu naopisywany w literaturze heterogenny charakter patogennych zmian w obu tych genachzakładamy, że testowanie wyłącznie znanych punktowych mutacji nie jest wystarczające.Poszukiwanie mutacji u pacjentów z PCD prowadzone jest metodą PCR/SSCP (amplifikacjafragmentów w obecności radioaktywnego znacznika i analiza migracji konformeróww niedenaturującym żelu poliakrylamidowym). Materiał przesiewowy to 42 chorych z PCDi 46 z KS, wraz z rodzinami. W sprawozdawanym okresie kontynuowano rozpoczęte wcześniej badania genu DNAI1.Uzupełniono przeprowadzone wcześniej badania czterech eksonów (1, 3, 4 i 16) o analizękolejnych próbek DNA od pacjentów. U chorego, u którego stwierdzono wcześniej obecnośćheterozygotycznej mutacji wprowadzającej miejsce restrykcyjne HpaI, potwierdzono metodąsekwencjonowania, że jest to insercja T w pozycji +3 intronu 1, opisana wcześniejw literaturze. Wyniki ujęto w pracy magisterskiej (K. Borowski). Rozpoczęto też badanieprzesiewowe kolejnych sześciu eksonów genu DNAI1. W sprawozdawanym okresie rozpoczęto analizę wybranych fragmentów genu DNAH5,w których w literaturze opisywano występowanie mutacji. Zaprojektowano i ustalonowarunki amplifikacji dla 9 eksonów i jednego intronu. Przebadano metodą SSCP od ~50(eksony 50, 53, 62) do ~80 (eksony 28, 32, 34) próbek DNA. W większości fragmentówstwierdzono występowanie różnych wzorów migracji. Po identyfikacji wywołujących jezmian nukleotydowych drogą sekwencjonowania ustalono, że część z nich (6 zmian) toneutralne, często występujące polimorfizmy, nie zmieniające sekwencji aminokwasów.Rzadziej obserwowane zmiany okazały się mutacjami wprowadzającymi zmianę kodowanegoAA lub kodon STOP (5 zmian). Mutacje zmieniające sekwencję łańcucha polipeptydowegonie powtarzają się w populacji (każda została wykryta u innej rodziny z PCD/S); u pacjentówmutacje te występują w stanie heterozygotycznym, stąd konieczność kontynuowania badaniapozostałych eksonów DNAH5. 9
  10. 10. Analiza różnorodności genomowej w populacjach ludzkich.(E. Ziętkiewicz, D. Labuda) Temat jest kontynuacją współpracy z laboratorium prof. Damiana Labudy w CentrumBadawczym Szpitala Ste-Justine przy Uniwersytecie Montrealskim. Podstawowym zadaniemjest odtworzenie historii populacji ludzkich na podstawie analizy różnorodności haplotypudys44. Badany haplotyp złożony jest z 35 prostych polimorfizmów nukleotydowych (SNP)rozmieszczonych w obrębie 8-kb intronowej sekwencji otaczającej egzon 44 genu dystrofinyw Xp21. W sprawozdawanym okresie opublikowano wyniki analizy haplotypów, będącychwynikiem mutacji punktowych, jak również wymiany istniejących polimorfizmów poprzezrekombinacje, w próbie 1343 chromosomów z 33 populacji ludzkich reprezentującychAfrykę, Azję, Europę, Oceanię i Ameryki. Analiza drzewa filogenetycznego opartego nasekwencjach haplotypów wskazuje na to, że obecna różnorodność wynika z udziału trzechróżnych linii ewolucyjnych. Na podstawie analizy proporcji nowych rekombinantówi różnorodności w mikrosatelitarnym locus Tn oceniono wiek linii haplotypowych i dokonanooceny czasu poszczególnych zdarzeń kolonizacyjnych. Stwierdzono, że współczesnaróżnorodność gatunku H. sapiens jest co prawda zdominowana przez linię afrykańską, którauległa ekspansji 27-56 tys. temu, zawiera jednak również domieszkę starszych liniiewolucyjnych (np. lini, której wiek oceniono na 160 tys lat). Obecna populacja ludzka jestzatem mozaiką wynikającą z udziału różnych grup H. sapiens, które opuszczały afrykańskąkolebkę w kilku falach na przestrzeni ponad 100 tys. lat poprzedzających okres GórnegoPaleolitu. Analiza haplotypu dys44 w rozszerzonej liczbie chromosomów w populacjacheuroazjatyckich wykazała, że w samej Europie brak jest znaczącej struktury genetycznej.Z drugiej strony, uwzględnienie heterozygotyczności w próbkach ze Środkowego Wschodupozwoliło wykryć obecność słabego, chociaż istotnego klinu frekwencji rozciągającego sięw Eurazji ze wschodu na zachód. Wydaje się, że rozkład ten może odzwierciedlać pradawne,niejednorodne procesy migracji z Afryki, które wywarły wpływ na kolonizację zarównoEuropy, jak i Azji. Obecny rozkład różnorodności europejskiej odzwierciedlanajprawdopodobniej nie tylko osiedlanie się ludów migrujących z Bliskiego Wschodu, aletakże wpływ innych ruchów populacyjnych, jak ekspansja ludów azjatyckicj czy przepływgenów w obrębie samej Europy.Analiza aberracji chromosomowych w grupie polskich stulatków.(A. Wojda, M. Lubka, M. Mossakowska, M. Witt) W 2003 roku badania nad genetycznymi czynnikami długowieczności obserwowanymi napoziomie cytogenetycznym przeprowadzono u 20 polskich stulatków. Badano chromosomylimfocytów krwi obwodowej z zastosowaniem technik cytogenetyki klasycznej i cytogenetykimolekularnej (FISH). Do badań niestabilności genomu wykorzystano także komórkidwujądrowe i mikrojądra. Stwierdzono występowanie aberracji liczby i struktury. Aneuploidiiulegają głównie chromosomy płci. Spośród chromosomów autosomowych aberacji liczbyulegają przede wszystkim chromosomy z grupy C (średnie submetacentryki) - chromosomypary 8 i 10, ponadto chromosomy pary 20 (grupa F - małe metacentryki). Duże i małechromosomy akrocentryczne (grupa D i G) wykazują aberracje liczby, jednak zgodniez danymi literaturowymi zaburzenia te nie są związane z wiekiem. Mechanizmy powstawania aneuploidii chromosomów obserwowano w komórkachdwujądrowych po zastosowaniu techniki FISH z sondami molekularnymi centromerowymii malującymi specyficznymi dla chromosomów par 1, 4, 6, 8, 20, X i Y. Stwierdzono, żechromosom X ulega aneuploidii na drodze tworzenia mikrojąder. Aneuploidia badanychchromosomów autosomowych zachodzi głównie na drodze non dysjunkcji. W ok. 90 % 10
  11. 11. analizowanych mikrojąder stwierdzono występowanie całych chromatyd, a nie ichfragmentów. Liczba mikrojąder w komórkach wzrasta z wiekiem. U osób stuletnich stwierdzasię także występowanie komórek poliploidalnych. O niestabilności genomu świadczy także spontaniczna ekspresja w chromosomach miejscłamliwych (fragile sites). W rutynowo prowadzonych hodowlach limfocytów krwiobwodowych osób stuletnich, ekspresji najczęściej ulegają następujące miejsca łamliwe:3p14, 4q32, 6q13-26, 11q23, 16q22 oraz regiony heterochromatyny. Miejsca łamliwe mogąbyć źródłem różnorodnych aberracji struktury chromosomów. U osób stuletnich, w miejsce pojawiającej się u osób młodszych translokacji międzychromosomem pary 7 a chromosomami akrocentrycznymi, stwierdza się częstszewystępowanie translokacji pomiędzy chromosomem pary 9 a chromosomamiakrocentrycznymi. Zaobserwowano, że chromosomy, które ulegają aneuploidii rzadko lub wcale nie ulegająrearanżacjom struktury. Chromosomy długie, np.: pary 1 i 3, ulegają różnorodnymaberracjom struktury, a nie ulegają aneuploidii. U osób stuletnich zmieniona jest morfologia chromosomów. Chromosomy są krótkie,skondensowane. W poszczególnych parach chromosomy są nierówno skondensowane. Indeksmitotyczny jest obniżony. Zmieniona jest także morfologia komórek: spontanicznie pojawiająsię komórki wielojądrowe, jądra komórkowe mają nieregularny kształt, często sąwielopłatowe. Stwierdza się obecność jader komórkowych bardzo dużych. Między jądramikomórkowymi występują mosty nukleoplazmatyczne. W komórkach często występująmikrojądra. Wymienione zmiany morfologii jąder interfazowych są związane z wy-stępującymi u badanych osób aberracjami chromosomowymi. Podwyższenie liczbymikrojader stwierdza się u osób z wysoką częstością aneuploidii. Spontanicznie występującekomórki wielojądrowe stwierdza się u osób, u których wykryto komórki poliploidalne. Mostynukleoplazmatyczne są związane z występowaniem aberracji liczby i strukturychromosomów. Komórki wielopłatowe, nieregularne, duże, u osób stuletnich występująpowszechnie.Analiza aberracji chromosomowych w chorobach rozrostowych wieku dziecięcego.(A. Wojda, M. Lubka, J. Wachowiak, M. Witt) W 2003 roku wykonano 76 badań z zastosowaniem technik cytogenetyki klasyczneji cytogenetyki molekularnej u dzieci chorych na białaczkę. U 31 pacjentów w momencierozpoznania choroby i u 45 pacjentów po przeszczepie szpiku. U 33 pacjentów badaniawykonano przed przeszczepem szpiku. U dzieci z poszczególnymi rozpoznaniami określononastępujące kariotypy:białaczka46,XY[12]/45,XY,-14[3]/47,XY,+12[2]/46,XY,del(3)(q13)[1]46,XX[5]/46,XX,inv(14)(q11q32),t(8;22)(q24;q11)[2]/46,XX,t(8;22)(q24;q11)[2]46,XY,t(9;22)(q33.2;q11)[8]44-45,XY,-19,-21,-22,del(17)(p13.1), inv(16)(p13q22)[7]MDS46,XY[12]/45,XY,-14[3]/47,XY,+12[2]/46,XY,del(3)(q13)[1]46,XX46,XY,t(9;22)(q34;q11)[12]/46,idem,t(7;12)(q36;p13)[5]46,XX[25]/46.XX,inv(3)(q21q26)[8]/46,XX,del(5)(q13)[1]/46,XX,del(10)(q23)[1]ALL46,XY,t(9;22)(q34;q11)[5] 11
  12. 12. 46-47,XY,inv(16)(p13q22),t(11;22)(q23;q13),+4,+22[13]46,XY,t(14;22)(q32;q11)[4]46,XX,t(7;10)(q34;q24)AML46,XYMLL46,XY[6]/46,XY,t(9;11)(p21-22;q23)[9]CML46,XX[18]/46,XX,inv(9)(q32;q34)[5]/46,XX,del(7)(p11.2)[2] U 56 pacjentów, z rozpoznaniem ALL, AML, MDS, CML, Guz Wilmsa, chłoniak Bkomórkowy, wykonano badania z zastosowaniem sond molekularnych BCR/ABL,MLL/AF4, D7Z1. Występowanie fuzji genów bcr/abl stwierdzono u 15 dzieciz rozpoznaniem ALL (3), AML (3), CML (7), LCAL (1). Aberracje chromosomu pary 11stwierdzono u 3 dzieci z rozpoznaniem ALL. Aneuploidię chromosomu pary 7 występującąw 50% analizowanych jąder interfazowych stwierdzono u 1 dziecka z rozpoznaniem JCML.Badanie chimeryzmu komórkowego po transplantacji szpiku kostnego.(J. Jółkowska, M. Dawidowska, J. Wachowiak, M. Witt) U 10 dzieci z białaczkami lub chorobami nierozrostowymi, które poddane zostałyallogenicznej transplantacji szpiku kostnego w 2003 roku przeprowadzono badaniamolekularne chimeryzmu z zastosowaniem metody polegającej na analizie wybranychmarkerów mikrosatelitarnych oraz automatycznej detekcji fluorescencyjnych produktów PCR(sekwenator ALF Express). W badaniach chimeryzmu wykorzystano DNA izolowany z krwiobwodowej oraz szpiku kostnego. Badania molekularne chimeryzmu poprzeszczepowegoprowadzono w określonych odstępach czasu po zabiegu transplantacji szpiku kostnego.W miarę możliwości materiał od pacjentów pobierano co 20, 30 dni. Jeśli wystąpiła takakonieczność, analizę chimeryzmu wykonywano znacznie częściej (co kilka dni). U 8pacjentów stwierdzono we wszystkich badanych próbach pełny chimeryzm, u 1 wystąpiłchimeryzm mieszany (80-90% biorcy). W jednym przypadku wszystkie badane markerymikrosatelitarne (TH, FGA, VWA, D21S11, D12S391) okazały się nieinformatywne dladanej pary dawca/biorca. U dzieci, u których w roku 1998, 1999, 2000, 2001, 2002 określonyzostał chimeryzm po allo-TSK, i od których materiał biologiczny otrzymaliśmy,przeprowadzone zostały dalsze badania markerów mikrosatelitarnych: średnio 3 m-ce, 6 m-vy, 9 m-cy po transplantacji szpiku oraz w chwili podejrzenia nawrotu choroby zasadniczej. Przeprowadzono wstępne eksperymenty zastosowania ilościowej metody analizychimeryzmu komórkowego w subpopulacji limfocytów T. Opracowano szybką metodęizolacji DNA z wyizolowanej subpopulacji komórkowej przez inkubację w temp. 95oC).Materiał (frakcja CD3) uzyskano od 2 pacjentów, w obu przypadkach zidentyfikowanochimeryzm mieszany, wyniki chimeryzmu były zgodne z wynikami chimeryzmu uzyskanymiwe krwi obwodowej. Zebrano dane o stanie klinicznym pacjentów, którzy poddani zostali allo-TSK w latach1998-2003, a następnie porównano molekularne wyniki badania chimeryzmupoprzeszczepowego ze stanem klinicznym pacjentów. U pacjentów, u którychzidentyfikowano obecność własnego genotypu biorcy (2), obserwowano odrzucenieprzeszczepu, u drugiego wznowę i zgon. Zwykle u pacjentów z pełnym chimeryzmem (66)obserwowano pełną odnowę hematologiczną od dawcy i stan ogólny dobry [wyjątkiem bylitacy, u których stwierdzono GvHD (6) lub wystąpiła posocznica (1), bądź nieoczekiwaniewznowa choroby (4)]. U 4 pacjentów we wszystkich badanych próbach stwierdzono mieszany 12
  13. 13. chimeryzm (u 2 utrzymuje się, u 1 z przewagą dawcy, u 2 z przewagą biorcy - podejrzeniewznowy). U 18 pacjentów obserwowano zmiany stanu chimeryzmu.Identyfikacja mutacji genu CFTR w populacji polskiej.(E. Rutkiewicz, M. Witt) W 2003 roku w Zespole Genetyki Molekularnej i Klinicznej kontynuowano programidentyfikacji w rodzinach ryzyka genetycznego mutacji genu CFTR powodującychmukowiscydozę (CF). Zespół pełni rolę jednego z dwóch krajowych ośrodkówreferencyjnych ds. analizy molekularnej genu CFTR w mukowiscydozie i chorobachzwiązanych z genem CFTR. Badaniami objęto chorych na mukowiscydozę i na wrodzonąobustronną lub jednostronną niedrożność nasieniowodów. W uzasadnionych przypadkachbadania prowadzone były u członków najbliższej rodziny. Przeprowadzono 125 badańmających na celu identyfikację mutacji genu CFTR. Chorzy kierowani byli z 9 ośrodkówklinicznych w kraju. Przynajmniej jedną mutację powodującą mukowiscydozę wykryto u 12chorych, u 18 chorych wykryto dwie mutacje genu CFTR (z tego u 8 osób chorychstwierdzono układ homozygotyczny F508del/F508del). Przebadano 13 potencjalnychbezobjawowych nosicieli mutacji genu CFTR, potwierdzając nosicielstwo u 8 osób. Rodzinyz potwierdzonym genetycznie rozpoznaniem CF kierowano na poradę genetyczną. Zespółz sukcesem wziął udział w kolejnej edycji European Quality Control Trial for Cystic Fibrosis,organizowanej przez European Network for Cystic Fibrosis, uzyskując stosowny certyfikat.Analiza chromosomów markerowych człowieka z użyciem mikrodysekcji chromosomówi FISH.(M. Zawada, A. Pieńkowska, C. Schelling) Materiałem badawczym były chromosomy markerowe wykryte we krwi obwodowej osóbz różnorodnymi wskazaniami do badania cytogenetycznego. Chromosomy markerowe zostaływcześniej zidentyfikowane z użyciem komercyjnych sond malujących oraz FISH jakopochodzące z chromosomów 3, 9, 13, 15, 16, 18 i 22. W celu scharakteryzowania materiaługenetycznego (ramię p, q, centromer) zawartego w chromosomach markerowychprzeprowadzono ich analizę z życiem techniki mikrodysekcji skojarzonej z DOP-PCR i FISH.Stwierdzono, że wymienione chromosomy markerowe mapują się w następujących regionachchromosomowych: 3q22-q25, 9q12, 13q12-33, 15pter-q12, 16q22-qter. Chromosomymarkerowe pochodzące z chromosomów 18 i 22 wymagają dalszej analizy. Ponadto stwierdzono, że w przypadku chromosomu markerowego 3q22-q25zidentyfikowany region może być, zgodnie z danymi literaturowymi, potencjalnym miejscemwystępowania genu związanego z niektórymi typami epilepsji. Ze względu na faktwystąpienia tego chromosomu markerowego u osoby z atakami epileptycznymi zasadne stajesię dalsze badanie tego przypadku. Chromosomy markerowe zidentyfikowane jako 9q12,13q12-q33 wystąpiły u osób z niepłodnością i niepowodzeniami rozrodu. Natomiastchromosomy markerowe 15pter-q12 oraz 16q22-qter zostały zidentyfikowane u osóbz cechami dysmorfii i upośledzeniem umysłowym. 13
  14. 14. 2. BADANIA STRUKTURY I FUNKCJI KWASÓW NUKLEINOWYCHEkspresja genów w tętniaku aorty brzusznej.(R. Słomski, K. Waliszewski, A. Korcz,D. Lipiński, A. Pawlak, E. Strauss, M. Gabriel,S. Zapalski) Celem pracy była ocena wpływu ekspresji genów na powstawanie tętniaka aortybrzusznej (AAA). Materiał kliniczny pochodził z Kliniki Chirurgii Ogólnej i Naczyń AMw Poznaniu i obejmował 112 chorych z AAA (w tym 45 operowanych), 25 operowanychz powodu zespołu Leriche’a i 125 osób grupy kontrolnej (w tym 50 zdrowych i 75 z grupypopulacyjnej). Badania polimorfizmu konwertazy angiotensynowej (ACE) z wykorzystaniemreakcji PCR wykonano w trzech grupach: I - 47 chorych z AAA i prawidłowym ciśnieniemtętniczym, II - 65 chorych z AAA i nadciśnieniem tętniczym, III - 50 osób zdrowych.Wykazano następujące genotypy ACE: D/D, I/D oraz I/I. Genotyp D/D występowałnajczęściej w grupie I (65,9%), rzadziej w grupie II (30,8%) i III (24%). Genotyp I/Dwykazano najczęściej w grupie II (47,7%), a potem w grupie III (42%) i (21,3%). Genotyp I/Izanotowano najczęściej w grupie III (34%) i dalej odpowiednio w grupie II (21,5%)i I (12,8%). Rozkład genotypów I/I, I/D, oraz D/D różnił się w sposób znamiennystatystycznie między grupą I i III (p<0,001). Badania polimorfizmu C677T i A1298C genu reduktazy metylenotetrahydrofolianowejMTHFR wykonano w dwóch grupach: I - chorych z AAA i II - 75 osób z grupy kontrolnej(populacyjnej). Stwierdzono statystycznie znamienny wzrost częstości (p=0,0001) alleluMTHFR 677CT w grupie I w porównaniu z grupa II. Częstość poszczególnych genotypówdla polimorfizmu C677T wyniosła w grupie I 33% (CC), 60% (CT) i 6% (TT), dla grupy IIodpowiednio 65%, 2% i 8%. Zanotowano 4,4-krotny wzrost ryzyka AAA dla homozygot677CT w stosunku do homozygot bez mutacji. Występowanie substytucji C677T w jednymlub obu allelach było związane z 3,8 krotnym wzrostem ryzyka występowania AAA. Badania ekspresji genów na poziomie transkrypcji metodą różnicową (differentialdisplay) umożliwiające identyfikację cząsteczek RNA ulegających ekspresji w określonejpopulacji RNA przeprowadzono w 2 grupach operowanych chorych: I - 45 z AAA oraz II –25 z zespołem Leriche’a. W ocenianych wycinkach ściany tętniaka stwierdzono w kilkuprzypadkach zmiany ekspresji. Ekspresję genów z zastosowaniem makromacierzy oceniano zestawem genów firmyClontech zawierajacym 588 genów podlegajacych ekspresji w naczyniach krwionośnych(Atlas cardiovarscular array) i 234 geny ulegające ekspresji w stresie (Atlas stress array).W ten sposób przebadano ekspresję genów w wycinkach ze ściany aorty u 45 chorychoperowanych z powodu AAA i u 5 zmarłych dawców narządów. W cDNA genów związa-nych z metabolizmem w naczyniach krwionośnych wykazano obniżenie ekspresji w 39genach, w tym biglikanu, fibromoduliny, dekoryny oraz genów kolagenowych. Wzrostekspresji dotyczył genów metaloproteinazy 3 (MMP3) oraz inhibitorów metaloproteaz(TIMP1, TIMP2). MMP3 katalizują procesy rozpadu kolagenu i innych białek fibrylarnych.Spośród genów odpowiedzi na stres zwiększoną ekspresję wykazał gen acylotransferazy i 2geny niedoboru hydroksylazy oraz gen kodujący wimentynę, ale już 25 genów z jej macierzymiało obniżoną ekspresję. Również zmniejszoną ekspresję stwierdzono w genach czynnikówkrzepnięcia II, III i w genach replikacji i naprawy DNA oraz białek siateczkiendoplazmatycznej i białek o pozakomórkowych funkcjach. 14
  15. 15. Opracowanie metod wprowadzania konstrukcji genowych do komórek i selekcjakomórek dla potrzeb ksenotransplantacji.(R. Słomski, D. Lipiński, M. Szalata, R. Kalak, K. Wielgus, W. Juzwa, J. Zeyland) We współpracy z grupą prof. Smorąga wyprowadzono 8 linii fibroblastów płodowychświni i opracowano dla nich warunki długotrwałej hodowli. Wyprowadzone liniefibroblastów przeznaczono do wstępnych doświadczeń nad wprowadzaniem do nichkonstrukcji genowych metodą transfekcji. Konstrukcje genowe zostały przygotowanew sposób sterylny w formie liniowej. Po przeprowadzeniu w formę liniową usuniętowszystkie białka poprzez ekstrakcję fenolem i chloroformem. W badaniach stosowano 4-5 μgDNA. DNA wprowadzano do komórek tylko w przypadku hodowli wykazujących bardzowysoką żywotność. Najlepsze wyniki uzyskiwano dla hodowli wykazujących 30-50%konfluencji. Zauważono również korzystny wpływ wymiany pożywki na świeżą na kilkagodzin przed wykonaniem transfekcji. Do wprowadzania konstrukcji genowych stosowano trzy metody – lipofekcję,elektroiniekcję i koprecypitację jonami strontu. W przypadku lipofekcji stosowano 10-20 μgkonstrukcji genowej. Drugą stosowaną metodą była elektroiniekcja – odmiana elektroporacji,w której stosowano 2 impulsy elektryczne. Trzecią metodę wprowadzania konstrukcjigenowych do komórek stanowiła koprecypitacja jonami strontu. Selekcję prowadzono z za-stosowaniem antybiotyku odpowiedniego dla konstrukcji genowej tj. pochodnej neomycyny –G418 lub blastycydyny. Inkubację z czynnikiem selekcyjnym prowadzono przez 14 dni.Uzyskano liczne kolonie. Kilka linii fibroblastów i fibroblastów płodowych można uznać zawyprowadzone. Równolegle przygotowywano się do prowadzenia badań nad selekcjąkomórek transgenicznych i mapowaniem transgenów.Przygotowanie konstrukcji genowych do modyfikacji świń dla pozyskiwania organów dotransplantacji u człowieka.(R. Słomski, D. Lipiński, M. Szalata, A. Pławski, M. Kaczmarek, R. Kalak, K. Wielgus,W. Juzwa, J. Zeyland) Dla potrzeb ksenotransplantacji przygotowano trzy typy konstrukcji genowych -konkurencyjną, inaktywującą i regulatorową. Konstrukcja genowa konkurencyjna dotyczywprowadzenia do komórek świni genów kodujących enzymy swoiste dla tego samegosubstratu, co endogenny enzym dawcy. Konstrukcja genowa konkurencyjna ma wprowadzićdo komórek dawcy dodatkowe kopie genów kodujących enzymy swoiste dla tego samegosubstratu, co enzym endogenny dawcy. Przygotowano konstrukcję genową zawierającą genα1,2-fukozylotransferazy człowieka, która konkuruje z α1,3-galaktozylotransferazą o ten samsubstrat N-acetylolaktozoaminę. Gen kodujący enzym α1,2-fukozylotransferazę wklonowanodo plazmidu pGT-N29. Konstrukcja genowa inaktywująca stanowi układ, w którym gen świni będzie zastąpionygenem nieaktywnym α1,3-galaktozylotransferazy. Uważa się, że przeszczep narządugenetycznie zmienionej świni pozbawionej enzymu α1,3-galaktozylotransferazy, a zatempozbawionego antygenu Gal, byłby tolerowany przy jednoczesnym podawaniu lekówdziałających na inne mniej nasilone reakcje immunologiczne. Fragment 5’ eksonu 9 genuα1,3-galaktozylotransferazy wprowadzono do wektora pGT-N29 zawierającego pozytywnymarker selekcyjny. Prace nad tą konstrukcją genową nadal trwają. Konstrukcje genowe o charakterze regulatorowym, mają regulować ekspresję białekdopełniacza. Planuje się wprowadzenie do komórek świni genów kodujących białkaregulujące kaskadę enzymatyczną dopełniacza: CD46, CD55 i CD59. Geny te wytwarzajączynniki blokujące aktywację dopełniacza i zapobiegające formowaniu się kompleksuatakującego błonę komórkową. Czynnik CD59 (MIRL – ang. membrane inhibitor of reactive 15
  16. 16. lysis) zapobiega formowaniu kompleksu atakującego błonę komórkową (MAC – ang.membrane attack complex). Uważa się, że CD59 wiąże się z czynnikiem C8 i C9 blokującpolimeryzację czynnika C9 i wejście kompleksu do błony. Czynnik CD55 (DAF – ang. decayaccelerating factor) reguluje podatność komórek na atak dopełniacza. Blokuje tworzenie sięfunkcjonalnego kompleksu konwertazy C3 przez wiązanie czynnika C4b. Czynnik CD46(MCP – ang. membrane cofactor protein) blokuje aktywację dopełniacza. Zablokowaniedziałania konwertazy C3 może nastąpić przez hydrolizę czynnika C4b. Czynnik I hydrolizujeC4b na dwa fragmenty C4c i C4d. Hydroliza może wystąpić tylko w obecności kofaktora,którego może dostarczyć czynnik CD46. Geny kodujące czynniki CD59, CD55, CD46wklonowano do plazmidu pGT-N29. Do plazmidu zawierającego czynnik CD59wprowadzono promotor CMV.Diagnostyka molekularna dystrofii mięśniowej Duchenne’a (DMD).(R. Słomski, M. Kala, J. Hoppe-Gołębiewska, J. Wigowska-Sowińska, B. Galas-Zgorzalewicz) Najczęściej występującymi mutacjami w genie DMD są delecje jednego, kilku, a nawetkilkunastu eksonów, występujące u 60% chorych na DMD/BMD. Dużą grupę stanowią teżmutacje punktowe (35%) oraz duplikacje (5%). Opracowano warunki analizy, metodą PCR-multipleks, eksonów położonych w regionach genu DMD podatnych na delecje, jak równieżmetody analizy mutacji punktowych metodą PCR-SSCP i PCR-HD. Metody przesiewoweumożliwiły wykrycie mutacji punktowych u 17% chorych. Do analizy nosicielstwa wybranosekwencje mikrosatelitarne położone przy promotorze C, w intronach centralnych, częstoulegających delecji oraz w regionie 3UTR. Opracowano warunki ich jednoczesnejamplifikacji i rozdziału elektroforetycznego na zestawie ALFExpress. Zastosowanie markera,położonego w miejscu objętym u chorego delecją, pozwoliło w wielu przypadkach nabezpośrednie określenie nosicielstwa u kobiet z jego rodziny.Oczyszczanie i ocena aktywności rekombinowanych białek głównego alergenu kota,czynnika martwicy nowotworu człowieka, liazy hydronadtlenkowej rzodkiewnikai hormonu wzrostu człowieka.(R. Słomski, M. Szalata, D. Lipiński, P. Toboła) Oczyszczanie rekombinowanych białek przeprowadzono z zastosowaniem chromatografiipowinowactwa metali na złożu Talon dzięki wyposażeniu białek we wstawkę histydynową.Oczyszczanie obydwu łańcuchów FeldI oraz TNFα przeprowadzono w warunkachdenaturujących z 8 M mocznikiem, który później usuwano w czasie dializy. Uzyskanośrednio 13 mg białka na 1000 ml hodowli dla łańcucha 1 FeldI, 43 mg białka dla łańcucha 2FeldI oraz 11,4 mg dla TNFα. Oczyszczanie HPL, podobnie jak hGH przeprowadzonow warunkach natywnych uzyskując odpowiednio 0,1 mg na 1000 ml hodowli bakteryjnejHPL i 1,5 mg hGH na 1000 ml mleka. Oczyszczanie hGH wymagało dodatkowych etapówzwiązanych z usunięciem lipidów i kazein z mleka królika. Po oczyszczeniu i sprawdzeniu elektroforetycznym czystości preparatów usuwanowstawki histydynowe poprzez działanie trombiną na sekwencje rozpoznawaną przez trombinęwprowadzoną do obydwu łańcuchów FeldI i hGH oraz hydrolizę enterokinazą sekwencjirozpoznawanej przez enterokinazę dla TNFα. W przypadku HPL nie usuwano wstawkihistydynowej. Wykazano aktywność biologiczną rekombinowanych białek. W hodowlach komórkowychsprawdzano dla TNFα cytotoksyczność a dla hGH zdolność do pobudzania podziałówkomórek zależnych od hormonu. W przypadku głównego alergenu kota wykazano aktywnośćimmunologiczną wobec surowic pacjentów uczulonych na sierść kota z zastosowaniem 16
  17. 17. powierzchniowego rezonansu plazmonowego i wyodrębniono z grupy pacjentów z alergią nasierść kota podgrupę uczulonych na białko FeldI. W przypadku enzymu HPL sprawdzonoaktywność enzymatyczną wobec różnych substratów i analizowano produkty reakcji.W przypadku hGH przeprowadzono również dwukierunkową elektroforezę białekuzyskanych z hodowli fibroblastów z zastosowaniem fluorochromów.Diagnostyka molekularna rodzinnej polipowatości jelita grubego.(A. Pławski, R. Słomski) Rodzinna polipowatość jelita grubego (FAP) uwarunkowana jest mutacjami w geniesupresorowym APC (ang. adenomatous polyposis coli), zlokalizowanym na chromosomie5q21. Mutacje genu APC mają charakter heterogenny, obserwuje się podwyższoną częstośćwystępowania delecji AAAGA w kodonie 1309 i delecji ACAAA w kodonie 1061, którerazem stanowią 15% mutacji. Zgromadzono materiał od 145 rodzin z FAP. Zaobserwowano24 przypadki klasycznego FAP, 11 przypadków łagodnej formy FAP i 10 przypadkówzespołu Gardnera. Do wykrywania mutacji u chorych stosowano cztery metody - ocenępolimorfizmu konformacji jednoniciowego DNA (SSCP), analizę heterodupleksów (HD),DHPLC oraz test terminacji translacji (PPT). Główny nacisk położono na analizę eksonów 5,8, 11 i końca 3’ eksonu 15 genu APC. W trakcie badań wykryto mutacje u 38% rodzinz Banku DNA oraz określono rozkład mutacji genu APC w populacji polskiej.Rola „efektu pozycji” genu SRY w różnorodności fenotypów płciowych pacjentów46,XX(SRY+).(A. Sharp, K. Kusz, M. Szarras-Czapnik, J. Wolski, J. Jaruzelska) Pacjenci o kariotypie 46,XX(SRY+) wykazują zróżnicowany fenotyp płciowy:klasycznego mężczyzny XX, mężczyzny 46,XX z cechami obojnactwa (np. spodziectwo) lubhermafrodytyzm prawdziwy. W opublikowanej poprzednio pracy wysunęliśmy hipotezę, żejednym z czynników tego stanu jest zróżnicowany stopień rozprzestrzeniania się inaktywacjichromosomu X na translokowany fragment Yp. W niniejszym roku sprawdzaliśmy tę hipotezę poprzez analizę inaktywacji siedmiu loci Yptranslokowanych na chromosom X. Zastosowaliśmy do tego celu odpowiednie markeryumożliwiające ocenę poziomu metylacji loci Y oraz ich ekspresję w liniach wyprowadzonychz limfocytów krwi obwodowej kilku pacjentów. Wykazaliśmy brak inaktywacji badanychprzez nas genów Yp niezależnie od tego czy był translokowane na aktywny czy nieaktywnychromosom X. Pokazaliśmy natomiast, że translokacje Yp na X nie wynikały z prostychzłamań chromosomów, ale że towarzyszyły im bardziej złożone i specyficzne dlaposzczególnych pacjentów rearanżacje regionu determinacji płci. Zakładamy, że mogły onew różnym stopniu wpływać na ekspresję genu SRY. Chociaż roli rozprzestrzenianiainaktywacji X na Yp nie da się wykluczyć (badaliśmy zaledwie kilka loci), efekt pozycjiwydaje się bardziej prawdopodobnym mechanizmem zróżnicowania fenotypów płciowychpacjentów. Wykazaliśmy ponadto, że efekt pozycji był szczególnie silny w przypadkach,w których SRY znajdował się w bliskim sąsiedztwie miejsca pęknięcia chromosomu Y.Skrajnym przypadkiem efektu pozycji było występowanie w tej samej rodzinie osób 46,XX(SRY+) o fenotypie odpowiadającym hermafrodytyzmowi prawdziwemu oraz prawidłowychpłodnych kobiet. 17
  18. 18. Identyfikacja białek tworzących hipotetyczną „cząstkę zarodkową” wokół kompleksuNANOS1–PUMILIO2–DAZ w męskiej linii germinalnej człowieka.(A. Spik, K. Kusz, K. Matylla, J. Jaruzelska) Układ rozrodczy uważany jest za najszybciej ewoluujący spośród wszystkich układóworganizmu. Na tym tle, wykrycie przez nas w komórkach linii germinalnej człowiekahomologów białek takich jak Nanos, Pumilio i Boule (tworzących tzw plazmę zarodkowąw cytoplazmie much, nicieni, płazów i ryb) wydaje się szczególnie interesujące. Wysokiezakonserwowanie ludzkich homologów tych białek (odpowiednio NANOS1, PUMILIO2i DAZ) wskazuje na ich istotną rolę również w rozwoju linii germinalnej człowieka. Poprzez zastosowanie drożdżowego systemu dwu-hybrydowego kontynuowane byłybadania zmierzające do wykrycia następnych białek, które w komórkach germinalnychmężczyzn oddziałują z NANOS1. Do wykrytych w poprzednim roku RENT1 oraz SBP2,interaktorów białka NANOS1, mogliśmy dodać dwa następne białka: PABPC3 orazHSPCO21. PABPC3 jest cytoplazmatycznym białkiem translacyjnym wiążącym się z poly(A)wpływając na stabilność mRNA. Jest ono specyficzne dla gonady męskiej i posiada domenęwiązania z RNA typu RRM (ang. RNA Recognition Motif). Z kolei cytoplazmatyczne białkoHSPCO21 funkcjonuje w inicjacji translacji oddziałując z podjednostką 6 czynnika eIEF3.Powyższe wstępne wyniki podtrzymują naszą hipotezę, że białka NANOS1 i PUMILIO2 sązaangażowane w procesie translacji nie tylko u zwierząt posiadających plazmę zarodkową, alerównież u człowieka.Mutacje genu NANOS1 (homologa morfogenu Drosophila) powodują utratę komórekmęskiej linii germinalnej, a w konsekwencji fenotyp „czystej niepłodności”.(K. Kusz, A. Spik, A. Latos-Bieleńska, M. Kotecki, J. Bierła, P. Jędrzejczak, L. Pawelczyk,J. Jaruzelska) Kontynuowaliśmy rozpoczęte w poprzednim roku poszukiwania mutacji genu NANOS1u 178 mężczyzn wykazujących tzw. czysty fenotyp niepłodności (brak zaburzeńsomatycznych). Dwie zmiany wykryte w poprzednim roku (G/A +50 oraz P34T) okazały sięzmianami neutralnymi, ponieważ występowały one z podobną częstością w grupie płodnychmężczyzn, również w postaci homozygot. W tym roku wykryliśmy trzy nowe typy mutacjigenu NANOS1 u 5 pacjentów. Dwie z tych mutacji były delecjami pojedynczych tripletówaminokwasowych (odpowiednio ΔS78 i ΔA173), natomiast trzecia z nich jest w analizie i niewiadomo jeszcze czy ma ona wpływ na ekspresję genu. Mutacje te występowały poza domenąpalców cynkowych warunkującą wiązanie białka NANOS1 z RNA. Były one zlokalizowanew mniej zakonserwowanym N-końcowym regionie. Żadna z tych trzech mutacji niewystępowała w grupie 300 płodnych mężczyzn posiadających co najmniej dwójkę dzieci.Mutacje były obecne tylko w jednym allelu co wskazuje na dominujące dziedziczenie. Analizarodowodów pacjentów wskazuje, że mutacje były dziedziczone po matce, a wszystkie kobietyz mutacją NANOS1 były płodne. Oznacza to, że mutacje genu NANOS1 wykazują penetracjęograniczoną do płci męskiej. Wszystkie trzy typy mutacji występowały u pacjentów z zespołem samych komórekSertoliego, który charakteryzuje się całkowitym brakiem komórek linii germinalnejw kanalikach plemnikotwórczych. Ta obserwacja wskazuje na rolę genu NANOS1 w rozwoju i/lub samodnawianiu spermatogoniów – macierzystych komórek męskiej linii germinalnej.Powyższe badania to pierwszy przykład mutacji punktowej genu autosomowego powodującejfenotyp „czystej niepłodności” mężczyzn. 18
  19. 19. Czy mutacje genu PUMILIO2 są przyczyną niepłodności męskiej?(K. Kusz, B. Ginter, K. Ziółkowska, A. Spik, A. Latos-Bieleńska, P. Jędrzejczak, L. Pawelczyk,J. Jaruzelska) Kontynuowano i poszukiwanie mutacji genu PUMILIO2 u 178 niepłodnych mężczyzncharakteryzujących się azoospermią lub ostrą postacią oligospermii. W genie PUMILIO2składającym się z 20 eksonów wykryto tylko dwa typy zmienionych wariantów SSCP. Analizasekwencyjna wykonana w tym roku wykazała, że pierwszy wariant reprezentował substytucjępojedynczego nukleotydu w eksonie 5. Substytucja ta nie powodowała zmiany kodonuaminokwasowego. Występowała ona u jednego pacjenta i jest wysoce prawdopodobne, że niema ona wpływu na ekspresję genu. Drugi zmieniony wariant SSCP to substytucjapojedynczego nukleotydu (G→A) w pozycji +6 donorowego miejsca splicingu intronu 14,w regionie kodującym zakonserwowaną domenę PUF (DmPumilio CeFBF) wiązania RNA.Wariant ten został wykryty u trzech pacjentów z azoospermią. Jest to potencjalna mutacjasplicingu. Jednak badania nad jej znaczeniem dla ekspresji PUMILIO2, w tym analizapopulacji prawidłowej, są jeszcze w toku.Kompleks białek NANOS1—PUMILIO2 w warunkach in vitro oddziałujeze specyficznymi motywami 3’UTR mRNA SIAH1.(A. Spik, A. Olszak, J. Jaruzelska) Prowadziliśmy dalsze badania zmierzające do odpowiedzi na pytanie, czy białka NANOS1i PUMILIO2 są regulatorami translacji specyficznych mRNA w męskich komórkach liniigerminalnej człowieka. W tym celu kontynuowaliśmy analizę interakcji mRNA SIAH1 z tymibiałkami w warunkach in vitro. Przeprowadzone w poprzednim roku doświadczenia nasurowych ekstraktach białkowych wskazujące na tworzenie potrójnego kompleksu NANOS1/PUMILIO2/mRNA SIAH1, powtórzono w tym roku na oczyszczonych białkach stosująctechnikę retardacji żelowej. Potwierdziły one tworzenie potrójnego kompleksu oraz pozwoliływyznaczyć stałe wiązania dla obu białek. Następnym etapem pracy była próba odpowiedzi na pytanie, które fragmenty 3’ UTRSIAH1 są niezbędne w tworzeniu potrójnego kompleksu. W regionie 3’UTR SIAH1 występują4 motywy (nazwane przez nas odpowiednio A1, B1, A2 i B2). Są one identyczne z motywamiwystępującymi w mRNA hunchback wiążącymi represory translacji Nanos i Pumiliou Drosophila. Poprzez zastosowanie ukierunkowanej mutagenezy usuwano te motywy z3’UTR SIAH1 poprzez wprowadzanie substytucji nukleotydowych. Uzyskano w ten sposóbcztery typy zmutowanych mRNA SIAH1, z których każdy pozbawiony był motywu A1, B1,A2 lub B2. Testy retardacji żelowej wiązania NANOS1 i PUMILIO2 ze zmutowanymi 3’UTRSIAH1 wykazały, że motywy te są niezbędne w tworzeniu potrójnego kompleksu.Najważniejszy w tworzeniu kompleksu okazał się motyw B2. Powyższe dane potwierdziłynasze oczekiwania, że mamy do czynienia ze specyficznymi oddziaływaniami białko-RNA.Molekularna diagnostyka chromosomu Y w niepłodności.(A. Spik, A. Latos-Bieleńska, P. Jędrzejczak, L. Pawelczyk, J. Jaruzelska) Molekularną diagnostykę chromosomu Y wykonujemy u mężczyzn z niepłodnościąidopatyczną mających zamiar skorzystać z metod wspomaganego rozrodu. Pacjenciz podejrzeniem genetycznej przyczyny niepłodności, leczeni w Klinice Niepłodnościi Endokrynologii Rozrodu AM w Poznaniu, kierowani są do Katedry Genetyki Medycznej AMw Poznaniu. Po zebraniu wywiadu oraz wyrażeniu zgody na badania genetyczne analizowanyjest kariotyp na podstawie limfocytów krwi obwodowej i pobierana jest krew do analizy DNA. 19
  20. 20. Analiza DNA polega na multipleksowej amplifikacji 20 STS mapujących w regionie AZF(ang. Azoospermia Factor) długiego ramienia chromosomu Y w poszukiwaniu delecji. Wśród200 badanych delecje AZF wykryto dotąd u 10 pacjentów z azoospermią. Pod względemhistologicznym pacjenci z delecjami AZF charakteryzowali się zespołem samych komórekSertoliego lub zatrzymaniem podziału mejotycznego. W świetle tych badań rokowania nauzyskanie potomstwa u pacjentów z delecjami AZF drogą ICSI są pesymistyczne.Polimorfizm genów warunkujących podatność na choroby naczyń krwionośnychi krążenia.(E. Strauss, K. Waliszewski, J. Głuszek, A. Pawlak) Oceniono interakcję między genotypem MTHFR 677C>T a występowaniem nadciśnieniatętniczego oraz paleniem papierosów w grupie 62 chorych z tętniakiem aorty brzusznej (ang.:abdominal aortic aneurysm, AAA). Stwierdzono znamiennie wyższe częstości genotypówMTHFR 677CT i TT w grupie chorych z prawidłowym ciśnieniem tętniczym (AAA PC)w porównaniu do chorych z nadciśnieniem tętniczym (AAA NT) (p=0,03; OR=3; 95%CI(0,9-10)) oraz w grupie chorych palących z prawidłowym ciśnieniem tętniczym (AAA PCPP) w porównaniu do grupy chorych niepalących z nadciśnieniem tętniczym (AAA NT PP)(p=0,02; OR=7; 95% CI (1,7-45,9)). W grupach chorych z prawidłowym ciśnieniemtętniczym (AAA PC) oraz chorych palących z prawidłowym ciśnieniem tętniczym (AAA PCPP) częstości allela MTHFR 677T były znamiennie wyższe (0,37 i 0,42) w porównaniu dogrupy kontrolnej (0,3; wartości p odpowiednio 0,02 i 0,03). Najwyższą częstość allela MTHFR 677T (0,42) zaobserwowano w grupie palącychpapierosy chorych z tętniakami aorty brzusznej i prawidłowym ciśnieniem tętniczym (AAAPC PP). Opisane różnice genetyczne mogą wskazywać na odrębność mechanizmówpatogenezy tętniaków w tej grupie chorych.Charakterystyka wrażliwości na dym papierosowy w zakresie funkcji rozrodczychu myszy różniących się allelami genu ahr.(A.L. Pawlak, E. Strauss, E. Florek) Efekt dymu papierosowego (DP) podanego w okresie kojarzenia i wczesnej ciążyoceniano na myszach kongenicznych wobec standardowego szczepu C57BL, ale różniącychsię allelami genu ahr. W warunkach standardowych, bez ekspozycji na DP, stwierdzonowiększą przeżywalność potomstwa samic ahr bb w porównaniu do przeżywalnościpotomstwa skojarzenia z udziałem samic ahr bd. Po ekspozycji na DP nie stwierdzono zmianprzeżywalności potomstwa rodziców (samica x samiec) ahr bb x ahr bd, natomiastpotomstwo rodziców kongenicznych z C57BL ahr bd x ahr dd wykazywało w seriieksponowanej na DP wyższą przeżywalność od wartości charakteryzujących myszy nieeksponowane.Badania nad podłożem genetycznym zespołów otępiennych: choroby Alzheimera orazotępień czołowo-skroniowych.(A. Kowalska) Choroba Alzheimera (AD) w ok. 10% rodzin dziedziczy się autosomalnie dominująco(ADFAD: autosomal dominant familial AD) według praw Mendla. Dotychczas wykrytow genomie ludzkim trzy geny związane z ADFAD: gen białka prekursora amyloidu (APP;chromosom 21 q21.2), gen preseniliny 1 (PS1; chromosom 14 q24.3) oraz gen preseniliny 2 20
  21. 21. (PS2; chromosom 1 q31-42). Analiza mutacyjna genów APP i PS została przeprowadzonaw grupie 55 chorych z wczesną postacią AD (EOAD) wyselekcjonowanych np. kryteriówNINCDS-ADRDA przez Klinikę Neurologii AM w Poznaniu (prof. M. Wender, prof.W. Kozubski) oraz Wojewódzki Szpital dla Nerwowo i Psychicznie Chorych w Ciborzu (dr G.Rossa). Wykryto 4 mutacje w genie preseniliny 1: A246E, P267L, E318G w tym nową L424R.Częstość zmian patogennych oszacowano na 50% w grupie przypadków ADFAD.W poszukiwaniu nowych czynników ryzyka genetycznego dla postaci późnej i sporadycznejAD (stanowiącej ponad 90% całej populacji chorych) badano asocjację pomiędzy ADa polimorfizmami DNA w genach: katepsyny D (catD), IL-1A, IL-1B oraz IL-1RA.Potwierdzono podwyższoną istotnie statystycznie częstość genotypu CT catD w grupiechorych, także z EOAD, w porównaniu z grupą kontrolną. Wykazano brak asocjacji pomiędzyAD a 4 innymi badanymi polimorfizmami DNA: IL-1A (-889), IL-1B (-511), IL-1B (+3953) I-RA. W kooperacji z Vanderbilt University w Nashville, USA podjeto próbę zastosowaniametody MDR do analizy wzajemnych interakcji pomiędzy polimorfizmami DNA możliwieistotnych dla patogenezy AD. We współpracy z Kliniką Neurologii AM w Warszawie (prof. H. Kwieciński, dr. Z.Jamrozik) oraz Kliniką Neurologii AM w Białymstoku (prof. W. Drozdowski) rozpoczętozbieranie materiału klinicznego do badań nad genetyką postępującego porażenianadjądrowego, jednego z najczęstszych otępień typu czołowo-skroniowego. 21
  22. 22. 3. IMMUNOGENETYCZNE ASPEKTY CHORÓB AUTOIMMUNIZACYJNYCH I ZAKAŹNYCHBadanie aktywności i ekspresji telomerazy oraz długości telomerów w wybranychnowotworach. Ocena przydatności telomerazy jako markera procesu nowotworowego.(J. Nowak, D. Januszkiewicz-Lewandowska, K. Lewandowski, M. Pernak, K. Nowicka,J. Rembowska) Celem podjętych badań była analiza aktywności i ekspresji telomerazy w powiązaniuz długością telomerów w komórkach ostrych białaczek u dzieci. Badania prowadzono nakomórkach izolowanych ze szpiku kostnego lub krwi obwodowej, pobranych w chwilirozpoznawania białaczki. Kontrolę stanowiły komórki linii K562 i prawidłowe limfocyty krwiobwodowej. Ekspresja trzech składowych telomerazy (hTR, hTERT, TP1) była badanatechniką RT-PCR. Dla oceny aktywności telomerazy posłużono się testami telomerase repeatamplification protocol-TRAP and PCR-ELISA. Badania długości telomerów prowadzonoz użyciem testu Telo TAGGG Telomere Length. Komórki białaczkowe, zarówno ALL jaki ANLL wykazywały ekspresję wszystkich trzech składowych telomerazy. Wyniki ilościowejoceny aktywności telomerazy w teście PCR-ELISA, jak również doświadczeniaz rozcieńczaniem zawiesiny komórek wykazały co najmniej 100-krotnie wyższą aktywnośćtelomerazy w komórkach białaczkowych w porównaniu z prawidłowymi limfocytami.Analogiczne testy dla oceny ekspresji telomerazy potwierdziły znacznie wyższą ekspresjęskładowych telomerazy w komórkach białaczkowych. Chemiluminescencyjna detekcja TRF(terminal restriction fragments) z DNA komórek ALL wykazała zróżnicowany wzór długościtelomerów. Komórki ALL posiadały zarówno długie jak i krótkie telomery, w przeciwieństwiedo prawidłowych limfocytów wykazujących jedynie krótkie telomery. Komórki ANLLposiadały głównie krótkie telomery, pomimo wysokiej aktywności i ekspresji telomerazy.Z uwagi na znacząco wyższą ekspresję i aktywność telomerazy w komórkach białaczkowychw porównaniu z prawidłowymi limfocytami, telomerazę można uznać za markernowotworowy pod warunkiem wykonania oceny ilościowej. Przeprowadzone badaniawykazały, że wysoka aktywność i ekspresja telomerazy w blastach białaczkowych nie korelujez długością telomerów.Występowanie i ekspresja sekwencji pol retrowirusa MSRV u pacjentówze stwardnieniem rozsianym i u osób zdrowych.(M. Pernak, M. Zawada, D. Januszkiewicz-Lewandowska, I. Liweń, K. Nowicka,J. Rembowska, H. Hertmanowska, M. Wender, J. Nowak) Celem pracy była analiza techniką FISH sekwencji pol MSRV u chorychna stwardnienie rozsiane. Materiałem badawczym była krew obwodowa od 16 chorych z SMoraz 10 osób zdrowych. Średnia liczba kopii sekwencji pol MSRV w komórce u osób z SMwahała się od 6 do 24, podczas gdy u osób zdrowych od 3 do 6. Stosując FISH do włókienchromatynowych zaobserwowano, że sekwencja pol MSRV występuje najczęściej w postacitandemowych powtórzeń na różnych chromosomach. U pacjentów SM stwierdzonosekwencje pol MSRV na większej liczbie włókien chromatynowych, niż u osób zdrowych.Uzyskane wyniki tłumaczą stwierdzoną wyższą ekspresję MSRV u pacjentów z SM, co możewskazywać na potencjalny udział tego retrowirusa w patogenezie stwardnienia rozsianego. 22
  23. 23. Występowanie wirusa TT u człowieka i zwierząt. Czy wirus TT może rozprzestrzeniaćsię pomiędzy ludźmi i zwierzętami?(I. Liweń, M. Pernak, D. Januszkiewicz-Lewandowska, M. Zawada, J. Wysocki,K. Lewandowski, K. Nowicka, J. Rembowska, J. Nowak) W przeprowadzonych badaniach wykazano obecność TTV-DNA w krwi obwodowejkrwiodawców w 47% przypadków. U pacjentów z wirusowym zapaleniem wątroby typu Bczęstość występowania TTV-DNA wynosiła 47%, z zapaleniem typu C 42% i z zapaleniemwątroby o nieustalonej etiologii 30%. Wykazano także obecność TTV-DNA w ślinie, moczui kale osób z wiremią TTV w krwi obwodowej. Badania przeprowadzone u zwierzątwykazały obecność TTV DNA w leukocytach krwi obwodowej u pojedynczych osobnikówbadanych gatunków zwierząt – krowy, świni, psa, jenota, lisa, konia, kota, chomika, myszy,kury, kurczaka i ślimaka. Najwyższą częstość występowania TTV-DNA stwierdzono u psa(w krwi 52%, w kale 57%, w ślinie 66%). Analiza sekwencyjna izolatów TTV u ludzii zwierząt wykazała homologię w 46-73%. Z uwagi na niską homologię badane sekwencjeTTV u zwierząt należy uznać za tzw. TTV-podobne (TTV-like sequences). Występowaniejedynie sekwencji TTV-podobnych u zwierząt nie uzasadnia hipotezy o rozprzestrzenianiu sięwirusa TTV pomiędzy ludźmi i zwierzętami.Wewnątrzrodzinne ryzyko zakażenia wirusem C zapalenia wątroby.(D. Januszkiewicz-Lewandowska, J. Wysocki, I. Małecka, K. Nowicka, J. Rembowska, M. Pernak, J. Nowak) Ryzyko transmisji wewnątrzrodzinnej wirusa zapalenia wątroby przeanalizowano w 30rodzinach, w których kobieta, najczęściej ciężarna, wykazywała serologiczne markeryzapalenia wątroby typu C (przeciwciała anty HCV). Badania przeprowadzono dwukrotniew odstępie jednego roku w celu wykluczenia zakażenia dzieci od matek na drodzekrwiopochodnej. W 18 rodzinach wykazano występowanie HCV-RNA przynajmnieju jednego członka rodziny - w 15 rodzinach była to matka, a w trzech matka i ojciec.W trzech rodzinach zakażenie HCV stwierdzono dodatkowo u dwojga lub trojga rodzeństwa.We wszystkich przypadkach zakażonych dzieci i matek stwierdzono ten sam genotyp 1b lub1a. Spośród trzech rodzin, w których matka i ojciec byli HCV-RNA pozytywni, w jednejwykazano różne genotypy wirusa (1a i 1a+1b). Wyniki badań wskazują na matki jakopierwotne źródło zakażenia dzieci z ryzykiem zakażenia HCV wynoszącym 16,67%.Identyfikacja i charakterystyka nowych elementów rekombinacyjnych genu TCR delta.(G. Przybylski) Zidentyfikowano, w obrębie ludzkiego genu delta receptora limfocytów T (TCRD), nowezgrupowanie siedmiu elementów rekombinacyjnych delta (δRec2.1−2.7). Wykazano,że elementy δRec2.1−2.7 ulegają rearanżacjom z segmentami Dδ3 i Jδ1 genu TCRD orazz segmentem ψJα genu TCRA. Przegrupowania te znaleziono we wszystkich próbkach krwiobwodowej 10 zdrowych osób. Wykazano, że przegrupowania δRec2-Jδ1 i δRec2-ψJα sąswoiste dla linii komórek T, podczas gdy rearanżacje δRec2-Dδ3 występują równieżw limfocytach B i komórkach NK. Uzyskane wyniki sugerują, że rearanżacjeδRec2.1−2.7, prowadzące do delecji znacznej części genu TCRD, są przejściowym etapemw procesie rekombinacyjnym locus TCRAD, decydującym o różnicowaniu komórek Tw kierunku limfocytów T typu αβ. 23
  24. 24. 4. BADANIA GENETYCZNE NIEPŁODNOŚCI ORAZ MECHANIZMY PATOFIZJOLOGII ROZRODUGenetyczne badania niepłodności męskiej, ze szczególnym uwzględnieniem niepłodnościidiopatycznej i teratozoospermii.(E. Wiland, M. Szczygieł, M. Zając, M. Kurpisz) Wykonywano badania cytogenetyczne, zarówno we krwi obwodowej jak i w plemnikachod pacjentów z teratozoospermią. Z powodu słabej ruchliwości patologicznych plemników,podawano ją drogą iniekcji śródplazmatycznej do komórki jajowej chomika syryjskiego.Analiza seminologiczna u analizowanych pacjentów z teratozoospermią wykazałakompleksowy charakter wady spermiogramu (AT, OA, OT, OAT). Ujawnionymi aberracjamichromosomowymi w plemnikach okazały się fragmentacje chromosomów, dotyczace wieluchromosomów. W przypadku płodnego mężczyzny całkowita częstość aberracji strukturychromosomów plemnikowych wyniosła 7,7%. W przypadku osobników z teratozoospermiąoceniono kariotyp w 132 plemnikach, 76-ruchliwych i 56-nieruchliwych. Średnia częstośćwystępowania płytek z aberracjami wyniosła 9%, gdy wykorzystano do ICSI gamety ruchliweod osobników z teratozoospermią. Analiza kariotypów w plemnikach nieruchliwych odosobników z teratozoospermią ujawniła wysoki odsetek aberracji, aż w 93% analizowanychpłytek. Parametr ruchliwości okazał się decydujący dla wykazania aberracjichromosomowych w plemnikach od osobników z teratozoospermią.Badania transgenezy: efektywność przenoszenia transgenu w plemnikach.(M. Szczygieł, R. Yanagimachi, M. Kurpisz) Wydajność transgenezy wykonywanej drogą śródplazmatycznego podania (ICSI) DNA dokomórki jajowej jest często upośledzona słabym rozwojem zarodka. Ponieważ częstoupośledzony rozwój wczesnej fazy zarodkowej spowodowany jest wadami genetycznymi,postawiono hipotezę, że obcy DNA lub warunki poprawiające integrację obcego DNAz komórką jajową mogą indukować uszkodzenia chromosomowe. Badano chromosomyzarodków mysich, uzyskanych w wyniku transgenezy z genem EGFP. Plemniki poddawano3 metodom naruszenia integralności błon – szok rozmrożeniowy, dodanie Triton X orazTriton-X z przemywaniem w sacharozie. Plemniki z naruszoną integralnością błoninkubowano z plazmidami EGFP i wstrzykiwano do oocytów II metafazy. Trzy parametrybyły finalnie oceniane: ojcowskie chromosomy w zygocie, zdolność rozwoju zarodka,ekspresja transgenu w stadium blastocysty. We wszystkich przypadkach stwierdzono2-krotnie wyższą częstość nietypowych kariopłytek, w przypadku gdy plemniki inkubowanoz egzogennym DNA. Poszukując możliwego mechanizmu degradacji chromosomów, użytochelatorów jonowych EGTA i EDTA, i wykryto, że neutralizują one szkodliwy efekttransgenu stabilizując chromosomy ojcowskie.Komórki macierzyste: nowe formy terapii narządowej.(N. Rozwadowska, D. Fiszer, B. Grygielska, R. Kalawski, T. Siminiak, M. Kurpisz) Badano 2 typy komórek macierzystych w regeneracji pozawałowego mięśnia sercowego,tj. macierzyste komórki mięśniowe (mioblasty) oraz macierzyste komórki szpiku (CD34+).W pierwszym przypadku mioblasty izolowano od tych samych pacjentów, z biopsji mięśniaszkieletowego uda, natomiast w drugim przypadku zastosowano pozytywna izolację komórekszpikowych w oparciu o kolumnę umieszczoną w polu magnetycznym (tzw. MACS). Po 24
  25. 25. uzyskaniu komórek CD 34+, odtrawiano przy pomocy zestawu kuleczki ferrytynowe, przedpodaniem komórek pacjentom. W niektórych przypadkach, komórki znakowanoradioaktywnym Indem dla uwidocznienia migracji tkankowej. W przypadku komórekszpikowych, wykonano pierwsze w Polsce podanie drogą przezskórną (uwalnianie z prądemkrwi w dozawałowej tętnicy wieńcowej) komórek szpikowych, natomiast w przypadkumioblastów było to dojście do uszkodzonego zawałem segmentu przez żyły serca – pierwszytego typu zabieg w świecie. Ocenę frakcji wyrzutowej serca będzie przeprowadzać się w 3 i 6miesiącu po zabiegu.Ekspresja genów w spermatogenezie.(D. Fiszer, N. Rozwadowska, M. Kurpisz) Analizowano ekspresję genów z rodziny IL-1 w prawidłowej gonadzie męskiej człowiekana poziomie RNA. Do genów tych należą: IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-1RI, IL-1RII, IL-1RA.Zastosowano ocenę aktywności transkrypcyjnej genu wykonując ilościowy PCR, stosującizotopową (fosfor radioaktywny) jak i nie-izotopową metodę detekcji. Uzyskiwano tzw.standardowe cRNA w dwóch typach plazmidów, dla dwóch różnych grup genów. Komórkiz gonady uzyskiwano drogą enzymatyczno-mechaniczną i frakcjonowano na frakcjękanalikową oraz śródmiąższową. Poprzez przyrównanie standardowego cRNA oraz badanegomRNA w tej samej probówce (stosując seryjen rozcieńczenia standardów) dokonanoilościowej oceny transkrypcji badanych genów (liczba kopii/ ng całkowitego RNA).Wykazano statystycznie znamienne różnice w występowaniu transkrypcji poszczególnychgenów, w badanych frakcjach komórkowych. Stwierdzono dominującą ekspresję genu IL-1alfa we frakcji kanalikowej oraz genu dla receptora II interleukiny w śródmiąższu. Ponieważposzczególne inhibitory działania interleukin układały się wg poszczególnych przedziałówfunkcjonalnych (deocy IL-1RII oraz IL-1RA) stwierdzono, że określone korelacje aktywnościgenów mają związek z ich hamowaniem (regulacją) na drodze sprzężenia zwrotnego,w określonych przedziałach gonady.Mechanizm stresu tlenowego jako przyczyna niepłodności męskiej.(M. Frączek, D. Sanocka, M. Kurpisz) Utworzono układ modelowy, składający się ze spontanicznych, bądź aktywowanychleukocytów (receptorowo lub estrami forbolu) oraz 3 frakcji plemnikowych, plemnikówuzyskanych techniką ‘swim-up’, oczyszczanych na gradiencie perkolu, frakcji żywotnej orazplemników uszkodzonych. Ostatnie 2 frakcje (po gradiencie perkolu) różniły się znamienniewzględem podstawowych parametrów seminologicznych, natomiast plemniki ze ‘swim-up’oraz po perkolu, we frakcji żywotnych, nie różniły się zasadniczo pod względem jakości. Pododaniu plemników (ze wszystkich badanych frakcji) do leukocytów spoczynkowychstwierdzano obniżenie syntezy rodników przez plemniki uzyskane drogą swim-up lubżywotnych z frakcji perkolu, natomiast przy dodaniu plemników uszkodzonych, poziompodstawowej syntezy rodników tlenowych wzrastał. Jednak podstawową różnicą pomiędzyfrakcjami plemnikowymi pochodzącymi z techniki ‘swim’up’, a z 90% perkolu (frakcjaplemników żywotnych), okazał się potencjał plemników ‘wypływanych’ do obniżenia stresutlenowego leukocytów pobudzanych drogą receptorową wobec plemników żywotnychuzyskanych po perkolu. Świadczy to o podstawowych różnicach funkcjonalnych plemnikóww ejakulacie, przy podobnych parametrach seminologicznych. Zdolność obniżenia stresutlenowego przez same plemniki, warunkuje ich fizjologiczna wartość uczestniczeniaw procesie zapłodnienia. 25
  26. 26. Charakterystyka biochemiczna antygenów indukujących przeciwciałaprzeciwplemnikowe, uzyskane z surowic dorosłych osobników niepłodnychoraz od chłopców przed pokwitaniem.(A. Domagała, M. Kamieniczna, M. Kurpisz) Wykonywano szereg immunoprecypitacji posługując się surowicami (przeciwciałapoliklonalne) od 26 dorosłych osobników (kobiet i mężczyzn) oraz od 93 chłopców przedpokwitaniem, z wadami w drogach rozrodczych. Grupy tych osobników podzielono na a)z przeciwciałami przeciwplemnikowymi, b) bez przeciwciał przeciwplemnikowychw surowicy. Dokonywano immunprecypitacji z próbkami surowic z obu grup wobecantygenów powierzchniowych plemników, erytrocytów oraz limfocytów. Stwierdzonoróżnice w masach cząsteczkowych antygenów, pochodzących od osobników niepłodnychodmiennej płci jak i wobec chłopców przed pokwitaniem. Pozytywnej immunoprecypitacjidokonywano zarówno surowicami ASA(+) jak i ASA(-). Stwierdzono, że przy pomocyimmunoprecypitacji można łatwo rozróżnić antygeny plemnikowe swoiste, jak i antygenyprecypitowane przez te same surowice we wszystkich typach analizowanych komórek.Można zatem wyróżnić surowice o charakterze tzw. naturalnych przeciwciał (precypitująantygeny ze wszystkich typów komórek), antygeny precypitowane zarówno z komóreksomatycznych jak i plemnikowych, jednak o wysokiej częstości występowania w populacjiniepłodnej ASA(+), (są to przeciwciała występujące poprzez fenomen ‘molecular mimicry’)oraz specyficzne przeciwciala przeciwplemnikowe.Wpływ tlenku azotu na rozwój odpowiedzi immunologicznej i zachowanie równowagifunkcjonalnej komórek T.(W. Niedbała, F.Y. Liew, D. Fiszer, M. Kurpisz) Wykonywano dalsze zadania badawcze, których celem było wyjaśnienie mechanizmudziałania tlenku azotu na różnicowanie się komórek regulatorowych CD4+CD25+T. Komórkite wykazują konstytutywną ekspresję receptora (typu alfa) dla IL-2 i odgrywają kluczową rolęw rozwoju niektórych chorób z autoagresji. 1/ Stwierdzono pobudzający wpływ tlenku azotuw niskich stężeniach oraz hamujący w wysokich dawkach na proliferację komórekCD4+CD25+ 2/ Wykazano, że pomimo wzrostu proliferacji komórek CD4+CD25-(komórki odpowiadające) hodowanych w obecności wysokich dawek (do 200uM) tlenkuazotu, komórki te w hodowlach mieszanych z komórkami CD4+CD25+ nie były zdolne dowejścia w cykl komórkowy. Obecność tlenku azotu nawet w bardzo wysokich dawkach niepowodowała zaburzeń funkcji hamującej komórek CD4+CD25+. Jest to istotna informacja,która może wskazać na mechanizm działania komórek regulatorowych typu CD25+. Sugerujebowiem, że komórki te są zdolne do pełnienia funkcji hamującej proliferację innychsubpopulacji komórek T nawet przy niemal całkowitym zatrzymaniu cyklu komórkowegooraz wyłączeniu własnych procesów metabolicznych. 26
  27. 27. 5. GENETYCZNE ASPEKTY PODATNOŚCI NA NOWOTWORY GŁOWY I SZYIZnaczenie receptora Ah w regulacji genów odpowiedzialnych za aktywacjęi detoksykację kancerogenów.(D. Brauze, M. Widerak) W roku 2003 kontynuowano prace zmierzające w kierunku dalszego poznaniawłaściwości opisanego przez nas wcześniej białka wiążącego β-naftoflawon; białko toopisane przez nas wcześniej jest regulowane przez receptor Ah wspólnie z enzymamizaangażowanymi w procesy detoksykacji i kancerogenezy. U szczurów, którym podanoligandy receptora Ah, porównano kinetykę indukcji białka wiążącego β-naftoflawonz indukcją modelowych białek kontrolowanych przez receptor Ah – cytochromu P450 1A1należącego do białek I fazy metabolizmu leków oraz reduktazy chinonów należącej do II fazymetabolizmu leków. Stwierdzono podobieństwo indukcji białka wiążącego β-naftoflawon zindukcją cytochromu 1A1, co sugeruje funkcjonalne powiązanie białka wiążącegoβ-naftoflawon z białkami I fazy. We współpracy z innymi ośrodkami badawczymi scharakteryzowano wpływ naturalniewystępujących fenoli roślinnych na modulację aktywności enzymów zaangażowanychw aktywację i metabolizm kancerogenów oraz na tworzenie adduktów benzo(a)pirenu z DNAw naskórku myszy. Uzyskane wyniki wskazują, że zarówno modulacja aktywności enzymówaktywujących kancerogeny, jak i zapobieganie wiązaniu końcowych metabolitów z DNA leżyu podstaw antykancerogennych właściwości badanych fenoli roślinnych.Analiza utraty heterozygotyczności u pacjentów z płaskonabłonkowym rakiem krtani.(K. Szukała, A. Sowińska, M. Kujawski, M. Wierzbicka, K. Szyfter) Inaktywacja genów supresorowych w wyniku zdarzeń genetycznych i działaniamechanizmów epigenetycznych związana jest z rozwojem procesu nowotworzenia w wielunowotworach, w tym też krtani. Przeprowadzono analizę utraty heterozygotyczności (LOH)w regionach znanych lub domniemanych genów supresorowych u 65 pacjentówz płaskonabłonkowym rakiem krtani. Materiał do badań stanowiło DNA wyizolowane z krwiobwodowej, guza, tkanki marginesu i 1-2 makroskopowo niezmienionych wycinków błonyśluzowej pobranych z punktów najbardziej odległych od guza w preparacie operacyjnym.LOH analizowano z zastosowaniem trzech polimorficznych markerów mikrosatelitarnych:D3S1284 (częsty region utraty – 3p13), D8S261 (region utraty 8p22) oraz D9S171 (w pobliżugenu p16). Utraty w obrębie tych trzech ramion postrzegane są jako wczesne etapy w procesienowotworzenia w rakach głowy i szyi. Dla markera D3S1284 przeanalizowano 64 pacjentów.LOH wystąpiło: w guzie u 26 spośród 37 informatywnych przypadków (70%), w tkancemarginesu u 3/37 przypadków (8%), w prawidłowej błonie śluzowej z okolic gardła dolnegou 2/37 przypadków (5%) i w prawidłowej błonie śluzowej z okolic tchawicy u 1/25przypadków (4%). Dla markera D8S261 przeanalizowano 65 pacjentów. LOH wystąpiło:w guzie u 20 spośród 41 informatywnych przypadków (49%), w tkance marginesu u 2/41przypadków (5%), w prawidłowej błonie śluzowej z okolic gardła dolnego u 3/41przypadków (7%). Nie obserwowano LOH w prawidłowej błonie śluzowej z okolic tchawicy.Dla markera D9S171 przeanalizowano 60 pacjentów. LOH wystąpiło: w guzie u 17 spośród31 informatywnych przypadków (55%), w tkance marginesu u 4/31 przypadków (13%),w prawidłowej błonie śluzowej z okolic gardła dolnego u 8/31 przypadków (26%)i w prawidłowej błonie śluzowej z okolic tchawicy u 4/20 przypadków (20%). Wystąpienie LOH w niezmienionych klinicznie wycinkach błony śluzowej mogłoby miećwartość predykcyjną do oszacowania ryzyka rozwoju wznów miejscowych u tych pacjentów.Przemawiałoby także za poszerzeniem pola operacyjnego. 27
  28. 28. Rola polimorficznych genów metabolizmu kancerogenów i naprawy DNAw kształtowaniu ryzyka mnogich nowotworów regionu głowy i szyi.(M. Rydzanicz, M. Wierzbicka, M. Gajęcka, M. Kujawski, K. Szyfter) W 2003 roku zakończono badania nad indywidualną podatnością na rozwój mnogichnowotworów w regionie glowy i szyi. Określono częstości występowania genotypówwybranych genów zaangażowanych w metaboliczną aktywację (CYP 1A1, CYP 2E1)i detoksykację (GSTM1, GSTT1 GSTM3, NAT2) kancerogenów oraz naprawę DNA (XPDekson 23 i 6, XRCC1 ekson 10 i 6, XRCC3 ekson 7) w trzech grupach badanych: (i) chorzyz mnogimi nowotworami głowy i szyi (n=84), (ii) chorzy z jednym guzem (n=182), (iii)zdrowi palacze papierosów (n=143). Materiał do badań stanowiły limfocyty krwi obwodowej,z których izolowano genomowe DNA. Genotypowanie prowadzono w oparciu o technikęPCR-RFLP. Istotnie częstsze występowanie niektórych genotypów/alleli u osób z mnogiminowotworami w porównaniu z grupami referencyjnymi, pozwoliły na wskazaniegenotypów/alleli „ryzyka”:- istotnie większe ryzyko rozwoju mnogich nowotworów wiązało się z: genotypem CYP1A1*1/*4 i allelem CYP1A1 *4, genotypem delecyjnym GST M1 (GSTM1 0) oraz allelem NAT 2*7B,- analiza współwystępowania poszczególnych genotypów sugeruje, że ryzyko rozwojudrugiego nowotworu rośnie przy skojarzeniu genotypów delecyjnych GST M1 i GST T1(GSTM1 0/GSTT1 0), NAT2 *7B i GSTM1 0 (NAT2 7B/ GSTM 0) oraz allela CYP1A1 *4z allelem NAT2 *7B i genotypem XPD CC (CYP1A1 *4/NAT2 7B/ XPD CC). Najsilniejsząasocjację udowodniono przy współwystępowaniu genotypów GSTT1null i CYP1A1 *1/*4oraz GSTM1null i CYP1A1 *1/*4: ryzyko rozwoju mnogich nowotworów rosło czterokrotnie,- stwierdzono wysoce istotną asocjację u chorych z mnogimi nowotworami pomiędzyobciążeniem rodzinnym chorobą nowotworową w wywiadzie a wystąpieniem genotypówryzyka: NAT2 warunkującego wolną acetylację i kombinacji GSTT1 0 i CYP1A1 *1/*4.Udział czynnika genetycznego w etiopatogenezie płaskonabłonkowych raków głowyi szyi u młodych dorosłych.(W. Gawęcki, M. Kostrzewska, K. Szyfter, W. Szyfter) Celem projektu była ocena udziału czynnika genetycznego w etiopatogeneziepłaskonabłonkowych raków głowy i szyi u młodych dorosłych (osób poniżej 45 roku życia). Materiał stanowili pacjenci z rakami płaskonabłonkowymi głowy i szyi leczeni w KliniceOtolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej Akademii Medycznej w Poznaniu.Zastosowano jak dotąd dwie techniki badawcze: test bleomycynowy (ocena poziomuniestabilności chromosomowej) i test kometkowy (ocena uszkodzeń spontanicznychi indukowanych DNA oraz zdolności naprawy DNA). Wstępne badania wykazały wyższą niż u pacjentów starszych ilość złamań chromosomów(współczynnik b/c) oraz większy procent uszkodzonych komórek w grupie młodychdorosłych. W obu grupach pacjentów stwierdzono zbliżone poziomy uszkodzeńspontanicznych i indukowanych DNA oraz zbliżone zdolności jego naprawy. Planuje się kontynuowanie badań w oparciu o większą grupę pacjentów i dodatkowowykonanie genotypowania w celu określenia polimorfizmów wybranych genów związanychz detoksykacją i naprawą uszkodzeń DNA. 28
  29. 29. Badania nad podłożem genetycznym drugich pierwotnych nowotworów regionu głowy i szyi.(M. Kujawski, M. Rydzanicz, M. Wierzbicka, M. Giefing, K. Szukała, K. Doba) W pierwszej części badań skoncentrowano się na analizie genetycznej wrażliwości namutageny w grupie chorych z mnogimi pierwotnymi nowotworami regionu głowy i szyi(MPT). Wykorzystano w tym celu test bleomycynowy, analizując zarówno indukowane, jaki spontaniczne złamania chromosomów. Indywidualna podatność na uszkodzenia DNAmierzona wrażliwością limfocytów krwi obwodowej na bleomycynę (wartości średniei mediana wskaźnika b/c) była ponad dwukrotnie wyższa w grupie MPT w porównaniuz chorymi z jednym guzem, co wskazuje na ewidentne powiązanie podwyższonejniestabilności chromosomowej z ryzykiem mnogich epizodów kancerogenezy. Liczbanieindukowanych aberacji chromosomowych w limfocytach krwi obwodowej była istotniewyższa u chorych, u których oba nowotwory były zupełnie odrębne i niepowiązanepotencjalnym wspólnym czynnikiem kancerogennym. Rozkład częstości złamań pewnychregionów chromosomów w limfocytach krwi obwodowej chorych z MPT byłnierównomierny i bardzo często obejmował loci genów zaangażowanych w proceskancerogenezy. Druga część badań dotyczyła analizy utraty heterozygotyczności (LOH) dla 4 markerówmikrosatelitarnych zlokalizowanych na chromosomach 3, 8, 9 i 13. Przeanalizowano grupę 23chorych, w których określano LOH dla dwóch lub trzech ognisk nowotworowych. LOHstwierdzono w 76,2%, 50%, 70% i 42,1% informatywnych przypadków, odpowiednio dlamarkerów D3S1284, D8S261, D9S171 i D13S185. Jednocześnie prowadzone są badania z wykorzystaniem porównawczej hybrydyzacjigenomów (CGH), a uzyskane wyniki są w trakcie analizy statystycznej.Ocena roli polimorficznego genu CYP2D6 w kancerogenezie płaskonabłonkowego rakakrtani.(M. Gajęcka, B. Głowacki, K. Szyfter, W. Szyfter) Gen CYP2D6 koduje enzym odpowiedzialny za aktywację metaboliczną ksenobiotyków,a wśród nich N-nitrozoaminy, należące do kancerogenów obecnych w dymie tytoniowym.Tym samym enzym kodowany przez CYP2D6 zaliczany jest do enzymów detoksykacyjnychfazy I. Celem badań była ocena, czy zmienność polimorficzna w obrębie CYP2D6 wiąże sięz indywidualną podatnością na działanie kancerogenne dymu papierosowego. Badanieprzeprowadzono na DNA z krwi obwodowej pozyskanym od 293 chorych na raka krtani oraz322 osób zdrowych traktowanych jako grupa referencyjna. Za pomocą techniki RFLP-PCRoceniano częstość występowania alleli w odniesieniu do dwóch opisanych w literaturzemiejsc polimorficznych: DelT1798, G1974A i DelA2637. Różnice częstości występowania alleliCYP2D6 w grupie chorych i grupie kontrolnej były niewielkie. Na podstawieprzeprowadzonych badań można wnioskować, występowanie allelu CYP2D6*4 w postacihomozygotycznej zwiększa ryzyko wystąpienia tytoniozależnego płaskonabłonkowego rakakrtani. 29
  30. 30. IV. REALIZOWANE PROJEKTY BADAWCZEProjekty badawcze realizowane w ramach działalności statutowej InstytutuProjekty badawcze własne (granty) Rodzaj projektu Kierownik projektu Okres Koszt Tytuł projektu realizacji projektu (lata od – do)1. „Rekombinowany, rozpuszczalny re- Dr Dariusz Kowalczyk 01.06.2000-31 322.000ceptor TGF-beta w odwracaniu immu- .05.2003nosupresji wywołanej nowotworem”4P05A 013 192. „Analiza występowania oraz ekspre- Dr Dariusz Ładoń 01.09.2000-31 230.000sji genów chimerycznych u dzieci cho- .08.2003rych na białaczki poddanych transplan-tacji szpiku kostnego”4P05E 074 193. „Wpływ tlenku azotu na rozwój Dr Wanda Niedbała 01.11.2000- 200.000odpowiedzi immunologicznej i zacho- 28.02.2004wania równowagi funkcjonalnejkomórek Th1:Th2”.4PO5B 013 194. „Ocena tła genetycznego i zaburzeń Prof. dr Maciej Kurpisz 15.09.2000-30 255.000funkcji plemników u niepłodnych .06.2003osobników męskich z teratozoospermią”4P05E 132 195. „Analiza ekspresji i aktywności Doc. Danuta Januszkiewicz- 15.03.2001-31 265.000telomerazy oraz długości telomerów Lewandowska .12.2003w schorzeniach limfoproliferacyjnychu dzieci ze szczególnym uwzględnie-niem okresu remisji i wznowy”6P05E 102 206. „Czynniki stanu zapalnego zakłóca- Dr Dorota Sanocka 15.03.2001- 190.000jące równowagę pro- i antyoksydacyjną 15.03.2003nasienia, wpływające na powstanieniepłodności męskiej”6P05E 104 207. „Podłoże genetyczne cech Dr hab. Piotr Gronek 01.09.2001-30 150.000instynktownych świni domowej (Sus .08.2004scrofa f. domestica) i lisa pospolitego(Vulpes vulpes)6P06D 032 218. „Poszukiwanie czynników genetycz- Dr Andrzej Pławski 01.11.2001-30 250.000nych zaangażowanych w powstawanie .10.2004i przebieg rodzinnej polipowatości jelitagrubego”6P05A 130 21 30
  31. 31. Projekty badawcze własne (granty) Rodzaj projektu Kierownik projektu Okres Koszt Tytuł projektu realizacji projektu9. „Analiza aberracji chromosomo- Dr Maciej Kujawski 11.02.2002- 140.000wych u chorych z mnogimi pierwo- 30.06.2004tnymi nowotworami głowy i szyi –cytogenetyka molekularna guzówpochodzących z różnych ognisknowotworowych”3P05A 020 2210. „Analiza przegrupowań z udziałem Dr Grzegorz Przybylski 10.02.2002- 100.000nowych elementów rekombinacyjnych 31.12.2003genu delta receptora limfocytów T(TCRδ)”3P05A 102 2211. „Analiza utraty heterozygotyczności Mgr Katarzyna Szukała 18.02.2002- 20.000(LOH) w 3 loci mikrosatelitarnych na 30.06.2003ramieniu 13q. Porównanie utraty alleliw materiale tkanki nowotworowej,tkanki marginesu i zdrowej błonyśluzowej w preparatach od chorychz płaskonabłonkowym rakiem krtani”3P05A 075 22MŁODY BADACZ12. „Identyfikacja mutacji w genach – Prof. Michał Witt 30.10.2002- 200.000kandydatach zaangażowanych w pato- 29.10.2005genezę chorób o heterogennym podłożugenetycznym – badania modelowew pierwotnej dyskinezie rzęsek”3P05E 019 2313. „Źródła i drogi zakażenia wirusem Dr Izabela Liweń 18.11.2002- 95.500TT. Czy możliwe jest przeniesienie 17.05.2004zakażenia TTV ze zwierząt na dziecioraz osoby dorosłe?”3P05E 025 2314. „Poszukiwanie genów ulegających Dr Aleksandra Korcz 16.04.2003- 230.000ekspresji w komórkach tętniaków aorty 15.04.2006brzusznej oraz w zespole Leriche’a”3P05A 110 2415. „Czy istnieje korelacja pomiędzy Dr Jacek Wysocki 6.05.2003-5.0 193.000występowaniem wirusa C zapalenia 5.2005wątroby w leukocytach krwi obwodo-wej a obecnością HCV-RNA i przeciw-ciał anty-HCV w surowicy krwi u cho-rych z wirusowym zapaleniem wątrobytypu C leczonych interferonem i riba-wiryną?”3P05E 101 2416. „Konstrukcja fagowej biblioteki Dr Dorota Fiszer 23.05.2003- 220.000fragmentów Fab swoistych dla 22.05.2006antygenów plemników ludzkich”3P05A 118 24 31
  32. 32. Projekty badawcze własne (granty) Rodzaj projektu Kierownik projektu Okres Koszt Tytuł projektu realizacji projektu17. „Badanie profilu różnorodności Dr hab. Ewa Ziętkiewicz 26.05.2003- 220.000genomowej w wybranych segmentach 25.05.2006genomu – wykorzystanie analizy genówistotnych z medycznego punktu widze-nia w tworzeniu podstaw epidemiologiigenetycznej w populacji polskiej”3P05E 038 2418. „Badanie wykładników infekcji Dr Przemysław Kądziołka 150.000wirusowych u ciężarnych z zagra-żającym poronieniem lub porodemprzedwczesnym oraz w ciążach powi-kłanych patologią jaja płodowego (wadapłodu, małowodzie, wielowodzie)”3P05E 093 2519. „Samoodnawianie czy różnicowa- Doc. Jadwiga Jaruzelska 20.08.2003 – 250.000nie? – Poszukiwania molekularnego 19.08.2006mechanizmu regulującego rozwójludzkich komórek macierzystych liniigerminalnej”3P05A 005 2520. „Badanie funkcji białek NANOS1 Dr Kamila Kusz 17.09.2003 – 200.000i PUMILIO2 w rozwoju komórek 16.09.2006germinalnych oraz ich znaczeniaw niepłodności męskiej”3P05E 013 2521. „Transplantacja autologicznych Dr hab. Ryszard Kalawski 15.10.2003 – 250.000mioblastów szkieletowych podczas 14.10.2006pomostowania aortalno-wieńcowegou pacjentów z pozawałowąniewydolnością krążenia”3P05C 041 25Projekty badawcze promotorskie Rodzaj projektu Kierownik projektu Okres Koszt Tytuł projektu realizacji projektu1. „Badania ilościowe chimeryzmu Prof. Michał Witt 01.06.2001-31 40.000komórkowego u dzieci chorych na .05.2003białaczki poddanych allogenicznejtransplantacji szpiku kostnego”6P05E 035 202. „Analiza molekularna genów systemu Prof. Maciej Kurpisz 15.10.2001- 50.000interleukiny-1 w gonadzie męskiej” 30.09.20046P05A 101 213. „Ocena częstości genetycznie uwa- Prof. Andrzej Pawlak 17.04.2003 - 40.000runkowanych niedoborów aktywności 16.04.2005PON1 i MTHFR w wybranychchorobach naczyń krwionośnych”3P05A 121 24 32
  33. 33. Projekty badawcze zamawiane Rodzaj projektu Kierownik projektu Okres Koszt Tytuł projektu realizacji projektu1. „Przygotowanie konstrukcji Prof. Ryszard Słomski 28.11.2002 – 571.000genowych do modyfikacji świń dla 19.11.2005pozyskiwania organów do transplantacjiu człowieka”. Zadanie badawczenr PBZ-KBN-048/PO5/2001/04.2. „Identyfikacja mRNA regulowanych Doc. Jadwiga Jaruzelska 12.03.2003 – 250.000translacyjnie przez białkowy kompleks 31.12.2005białek PUMILIO2-NANOS1 w męskichkomórkach płciowych”. Zadaniebadawcze nr PBZ-KBN-084/P06/2002.3. „Wykorzystanie markerów Doc. Danuta Januszkiewicz- 25.11.2003 – 200.000molekularnych w diagnozowaniu, Lewandowska 31.10.2006prognozowaniu i w optymalizacjileczenia zwojaka zarodkowego(neuroblastoma) u dzieci”. Zadaniebadawcze nr PBZ-KBN-091/P05/2003/09, umowa nr519/03.4. „Analiza częstości występowania Prof. Jerzy Nowak 25.11.2003 – 300.000mutacji i polimorfizmów w 16 31.10.2006egzonach genu NBS1 u dzieci z ostrąbiałaczką limfoblastyczną”. Zadaniebadawcze nr PBZ-KBN-090/P05/03,umowa nr PBZ-KBN-11.5. „Ocena statusu immunologicznego Prof. Maciej Kurpisz 15.12.2003 – 180.000transgenicznych świń”. Zadanie 31.05.2005badawcze nr PBZ-KBN-048/P05/2001/12, umowa nr 10/PBZ-12/2003.6. “Ocena częstości nosicielstwa Prof. Jerzy Nowak 25.11.2003 – 175.000mutacji genów BRCA1 I CHEK2 31.10.2006w populacji polskiej z uwzględnieniemróżnicowania regionalnego orazstruktury zachorowań na nowotworyw rodzinach nosicielek mutacji tychgenów”. Zadanie badawcze nr PBZ-KBN 090/PO5/02IGCz PAN – podwykonawca. 33
  34. 34. Współpraca w projektach badawczych w innych placówkach Rodzaj projektu Kierownik projektu Okres Tytuł projektu realizacji1. „Optymalizacja efektu przeciwbiałaczkowe- Prof. M. Witt, dr J. Jółkowska 01.07.2000-3go allogenicznej transplantacji szpiku u dzieci Kierownik - doc. J. Wachowiak 0.06.2003z ostrą białaczką limfoblastyczną”.Grant KBN 4P05E 108 18.Akademia Medyczna w Poznaniu.2. „Występowanie sekwencji retrowirusowych Prof. M. Kurpisz, dr D. Fiszer 01.06.2001-3i ich rola w patogenezie chorób autoimmuni- Kierownik - dr J. Prokop 1.12.2003zacyjnych oraz różnych odmianach klinicznychłuszczycy”.Grant KBN 6P05B 092 21.Akademia Medyczna w Poznaniu.3. „Ocena skażenia anestetykami wziewnymi Prof. K. Szyfter, dr M. Rydzanicz 1.07.2001 –sal operacyjnych; możliwy wpływ na aparat Kierownik – prof. R. Szulc 30.06.2003genetyczny”.Grant KBN 6P05C 005 21.Akademia Medyczna w Poznaniu.4. „Organizacja banku DNA i unieśmiertelnio- Prof. M. Witt, dr A. Wojda 01.11.2001-3nych limfocytów oraz badanie aberracji Kierownik – dr J. Kuźnicki 0.10.2004chromosomowych i polimorfizmu genówzwiązanych z procesami starzenia”.Grant PBZ/KBN-22/PO5/10 w ramach projektuzamawianego „Genetyczne i środowiskowewyniki długowieczności polskich stulatków”dla Międzynarodowego Instytutu BiologiiMolekularnej i Komórkowej w Warszawie.5. „Analiza asocjacji polimorficznych odmian Prof. A. Pawlak 2002-2004MTHFR i PON-1 u chorych z niedokrwieniem Kierownik – prof. J. Głuszekserca bez obciążenia czynnikami ryzykawieńcowego”.KBN AM 501-2-02-05.Akademia Medyczna w Poznaniu.6. “European CF Network and NAS” Prof. M. Witt, dr E. Rutkiewicz 01.01.2002-3QLRT-1999-00241, “Thematic Network Kierownik – prof. J. J. Cassiman 1.01.2004around Cystic Fibrosis and Related Diseases”QLRT-2001-02876 (w ramach 5 ProgramuRamowego UE).Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowejw Warszawie.7. „Badanie in vitro aktywności interferonu tau Prof. M. Kurpisz, dr D. Fiszer 2002-2004wobec jednojądrzastych komórek krwi Kierownik – doc. A. Chełmońska-obwodowej u bydła”. SoytaInstytut Immunologii i Terapii DoświadczalnejPAN, Wrocław.8. „Centre of Excellence in Molecular Bio- Prof. M. Witt 2003-2005Medicine” QLK6-CT-2002-90363 (w ramach Koordynator – Prof. J. Kuźnicki5 Programu Ramowego UE); MiędzynarodowyInstytut Biologii Molekularnej i Komórkowejw Warszawie. 34
  35. 35. Współpraca w projektach badawczych w innych placówkach Rodzaj projektu Kierownik projektu Okres Tytuł projektu realizacji9. „Porównanie ekspresji i regulacja ekspresji Prof. Ryszard Słomski 2002-2003hormonu wzrostu człowieka w gruczolemlekowym transgenicznego królika w bada-niach in vivo i in vitro”.KBN 3P05A 103 23.Akademia Rolnicza w Poznaniu.10. „Wykorzystanie transgenezy w genetycznej Prof. Ryszard Słomski 2002-2005modyfikacji świń dla pozyskiwania organów dotransplantacji u człowieka. Opracowanie metodwprowadzania konstrukcji genowych dokomórek i selekcja komórek dla potrzebksenotransplantacji”.KBN PBZ/KBN/048/P05/03.Akademia Rolnicza w Poznaniu.11. „Wykorzystanie transgenezy w genetycznej Prof. Ryszard Słomski 2002-2005modyfikacji świć dla pozyskiwania organów do Kierownik - prof. J. Modlińskitransplantacji u człowieka. Uzyskiwanietransgenicznych świń do ksenotransplantacjipoprzez transfer jąder komórkowych doenukleowanych oocytów”.PBZ/KBN/048/P05/02.Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PANw Jastrzębcu.12. „Wykorzystanie transgenezy w genetycznej Prof. Ryszard Słomski 2002-2005modyfikacji świć dla pozyskiwania organów do Kierownik – doc. J. Juratransplantacji u człowieka. Uzyskiwanietransgenicznych świć metodami standardowegoi wspomaganego wprowadzania informacjigenetycznej do genomu zygot i zarodków”.PBZ-KBN-048/P05/05.Instytut Zootechniki w Balicach.13. „Konstrukcja nowych modeli badawczych Prof. Ryszard Słomski 2003-2006z wykorzystaniem zwierząt modyfikowanych Dr M. Skrzyszowskagenetycznie. Wpływ różnych metod sztucznejaktywacji rekonstytuowanych oocytów świń napotencjał rozwojowy zarodków transgenicz-nych uzyskiwanych techniką klonowania”.PBZ-MIN-005/P04/2002.Instytut Zootechniki, Balice.Projekty badawcze finansowane przez podmioty/instytucje zagraniczne1. „Konstrukcje genetyczne prawidłowych Prof. Ryszard Słomski 2000-2003i zmutowanych genów do ekspresji u zwierząt”PienGen Biomedical Corp., Knoxville, USA 35
  36. 36. 36

×