1. Requerimiento de Recursos.<br />5.1 Muestra.<br />ADN genomico, mitocondrial o producto de PCR (El volumen de la muestra depende del tamaño de los posos del gel de agarosa).<br />5.2 Materiales.<br />5.2.1 Guantes desechables.<br />5.2.2 Bata de laboratorio <br />5.2.3 Tijeras. <br />5.2.4 Tarro de desecho para puntas y geles.<br />5.2.5 Papel parafilm<br />5.2.6 Pipeta 20 L<br />5.2.7 Puntas 100L.<br />5.2.8 Botellas de 1L<br />5.2.9 Erlenmeyer de 100 mL<br />5.2.10 Magnetos<br />5.3 Equipos.<br />5.3.1 Plancha magnética calentadora.<br />5.3.2 Cámara de electroforésis<br />5.3.3 Fuente de poder<br />5.3.4 Balanza electrónica<br />5.3.5 Soporte para el gel de agarosa con sus respectivas peinetas.<br />5.3.6 Trans-iluminador de luz ultravioleta<br />5.3.7 Cámara polaroid<br />5.3.8 Careta protectora contra luz ultravioleta.<br />5.4 Reactivos y soluciones.<br />5.4.1 Identificación<br />NombreMarcaCódigoAgarosaGIBCO BRL 14610-018Tris BaseGIBCO BRL14610-018Ácido Acético GlacialBake Analyzer9507-03EDTASIGMAE 5134Bromuro de EtidioSIGMAE 15-10Azul de bromofenolXylene cyanol FFGliserolAgua milQ<br />5.4.2 Preparación de reactivos<br />5.4.2.1 Buffer TAE (50X) pH 8.5 :<br />Tris base 242 g<br />Ácido acético 57.1 mL<br />EDTA 37.2 g<br />Mezclar y completar con agua destilada hasta 1000 mL. <br />5.4.2.2 Bromuro de Etidio 10 mg/mL:<br />Bromuro de etidio 0.1 g. <br />Completar a 10 mL con agua destilada. Agitar hasta disolver. Almacenar en frasco ámbar a temperatura ambiente.<br />5.4.2.3 Loading Buffer 6X<br />0.25% Azul de Bromofenol<br />0.25% Xylene cyanol FF<br />30% glicerol en agua<br />El 100% se completara con agua milli Q<br />Almacenamiento.<br />El buffer TAE puede ser almacenado a temperatura ambiente, mientras el Loading buffer 6X se debe guardad a una temperatura de 4ºC.<br />Solución madre de bromuro de etidio: 10 mg/mL (Mantener en frío y oscuridad).<br />5.5 Controles de calidad de la prueba.<br />No aplica<br />5.6. Planilla de trabajo <br />No aplica.<br />6. Desarrollo / Procedimiento.<br />Antes de iniciar el proceso, tenga en cuenta las recomendaciones descritas en el instructivo y normas generales para realizar electroforesis de agarosa ML-01-IOE-003<br />6.1 Procedimiento<br />6.1.1 Pesar la masa de agarosa requerida según el volumen del gel que se empleará (ver tabla. 1)<br />6.1.2 Disolver en un Erlenmeyer limpio con un volumen de Buffer TAE 1X, dependiendo del tipo de soporte para el gel que se desee utilizar, hirviendo la solución por algunos minutos en la plancha de calentamiento y agitándolo constantemente con ayuda del magneto.<br />Concentración de Agarosa en el gel %Rango de separación de fragmentos de ADN en análisis (Kb)0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2<br />Tabla. 1 Rango de separación en geles conteniendo diferentes concentraciones de agarosa<br />6.1.3 Enfriar la solución hasta 50 ºC, adicionar bromuro de etidio hasta alcanzar una Concentración de 0,5 μg/mL de gel. <br />6.1.4 Verter la solución en el molde del gel (este debe estar nivelado) y colocar la peineta dependiendo el numero de posos que se requieran. Esperar a que solidifique. 10 min. Aproximadamente.<br />6.1.5 Cargar el gel con la muestra de ADN y buffer de carga 6X Loading y correrlo a un voltaje apropiado (entre 80 y 200 V, según el tamaño del gel) sumergido en buffer TAE 1X.<br />6.2 Interpretación de resultados<br />La calidad del ADN se puede observar en el gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio 10mg/mL. El gel es corrido durante 30 minutos a 80 voltios en una cámara de electroforésis con buffer TAE 1x. Es suficiente la adición de 5L mas 1L de buffer de carga para obtener buenos resultados. La observación del gel a la luz ultravioleta debe mostrar una única banda bien definida.<br />6.3 Informe final.<br />El gel después de haber sido corrido para comprobar el estado del DNA, debe ser fotografiado y la foto pegada en el cuaderno de resultados especificando a qué muestra corresponde cada carril.<br /> 7. Restricciones y limitaciones del procedimiento<br />La mínima cantidad de ADN que puede ser detectada por el gel es de 2ng en un poso de 0.5cm.<br />8. Seguridad. <br />Deberán tomarse todas las medidas de seguridad de riesgo biológico. Todas las muestras de sangre deberán ser manipuladas como si estuvieran infectadas. Usar guantes desechables, evitar tocar la punta de la lanceta una vez haya sido usada, descartar las lancetas utilizadas en recipientes de paredes duras destinados exclusivamente para este fin. Las muestras deberán tomarse siempre en condiciones asépticas.<br />9. Formatos de Registro. <br />NA<br />10. Documentos Interrelacionados. <br />10.1 Instructivo y normas generales para realizar electroforesis de agarosa ML-01-IOE-003<br />11. Bibliografía<br />11.1 http://www.geocities.com/~maorera/hglaes2n.html<br />11.2http://bmv.fcien.edu.uy/protocolos/Preparacion%20de%20gel%20de%20agarosa %20para%20analisis%20de%20ADN.pdf<br />