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Yemas de café

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La micropropagación de yemas es la técnica de cultivo in vitro más utilizada para la propagación obtención de plantas libres de agentes patógenos que causan enfermedades. El propósito de este trabajo …

La micropropagación de yemas es la técnica de cultivo in vitro más utilizada para la propagación obtención de plantas libres de agentes patógenos que causan enfermedades. El propósito de este trabajo es propagar plantas sanas mediante el cultivo de yemas aislados de Café (Coffea arabica). El medio utilizado fue el MS enriquecido con 2 mg/L de BAP y 0,05 mg/L de AIA. Los explantes se desinfectaron con detergente al 2% + Tween 20 durante 20 minutos y posteriormente con cloro al 2% igualmente con Tween 20 durante 10 minutos, además se agregó dos fungicidas: Carbendazim que es un fungicida de sistémico de rápida penetración y Captan que es un fungicida de contacto. Los resultados mostraron contaminación de los cultivos y una viabilidad de los explantes de un 25%.

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  • 1. Cultivo in vitro (micropropagación) de yemas de Café (Coffeaarabica). Establecimiento in vitro de meristemos de Café (Coffea arabica) a partir de esquejes. Ayala Paola Carrera de Ingeniería en Biotecnología, Cultivo de Tejidos Vegetales Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE Sangolquí - Ecuador. Noviembre, 2013 RESUMEN La micropropagación de yemas es la técnica de cultivo in vitro más utilizada para la propagación obtención de plantas libres de agentes patógenos que causan enfermedades. El propósito de este trabajo es propagar plantas sanas mediante el cultivo de yemas aislados deCafé (Coffea arabica). El medio utilizado fue el MS enriquecido con 2 mg/L de BAP y 0,05 mg/L de AIA. Los explantes se desinfectaron con detergente al 2% + Tween 20 durante 20 minutos y posteriormente con cloro al 2% igualmente con Tween 20 durante 10 minutos, además se agregó dos fungicidas: Carbendazimque es un fungicida de sistémico de rápida penetración y Captan que es un fungicida de contacto. Los resultados mostraron contaminación de los cultivos y una viabilidad de los explantes de un 25%. Palabras clave:Propagación, yemas, Coffeaarabica y cultivo in vitro. ABSTRACT The buds micropropagation technique is the most widely used in vitro culture for obtaining free plants spread of pathogens that cause disease. The purpose of this paper is to propagate healthy plants by meristem culture isolated from coffee (Coffeaarabica). The medium used was MS supplemented with 2 mg / L BAP and 0.05 mg / L IAA. The explants were disinfected with 2% detergent + Tween 20 for 20 minutes and then with 2% chlorine equally with Tween 20 for 10 minutes, and added two fungicides: Carbendazim which is a systemic fungicide Captan rapid penetration and is a contact fungicide. The results showed contamination of crops and viability of the explants of 25%. Key words: Propagation, buds, Coffeaarabica and in vitro culture. INTRODUCCIÓN Las técnicas de cultivo in vitro permiten la propagación clonal, masiva y rápida de plantas. Los métodos de desinfección superficial utilizados para la introducción de nuevas especies vegetativas al laboratorio no garantizan que la planta se encuentre libre de agentes patógenos (López & Cazola, 2006). La propagación por microesquejes es el cultivo de una sección (explante) proveniente del vástago de la planta (nudo o entrenudo), con el fin de obtener nuevos vástagos mediante el desarrollo de yemas preexistentes o neoformadas, las cuales podrán, a su vez, proporcionar nuevos esquejes, o ser enraizados, obteniéndose así múltiples plantitas,
  • 2. idénticas, en principio, a la planta madre (Rafael, 1987). En base a previas investigaciones desarrolladas por (Dublin, 1987) se sabe que la estrategia de esqueje in vitro para Arabusta comprende las fases siguientes: a) obtención y multiplicación de los microesquejes b) enraizamiento c) traspaso a condiciones ordinarias de cultivo. Por otra parte, Dublin estima que un solo microesqueje podría proporcionar, en un año, 20 000 plántulas aproximadamente, lo que significa un altísimo rendimiento, el cual unido a la garantía de conformidad genotípica que ofrece esta técnica, lo convierte en una muy buena alternativa para la propagación masiva de genotipos interesantes. Otros investigadores que también han aplicado exitosamente las técnicas de microesquejes son (Akamura & Sondahi, 1981), quienes trabajaron con nudos de ramas ortótropas de C. arabica cv. Mundo Novo, obteniendo el desarrollo del 45% de las yemas preformadas, con una eficiencia de 7,5 plántulas por nudo cultivado en sólo seis meses. Otro aspecto importante en la micro propagación in vitro de café es la inducción de embriogénesis somática. Al respecto se puede mencionar el trabajo de(García & Menendez, 1987), en el cual se logró la formación hasta de 75 embrioides por explante foliar de Catimor, utilizando primero un medio para la inducción del callo embriogénico [MS/2, 8 mg/I BAP y 1 mg/1 de Acido 2,4diclorofenexiacético (2,4D)], y posteriormente otro medio para la diferenciación de los embrioides (MS/2 y 10% de agua de coco). La composición del medio nutritivo es compleja, ya que una yema es una porción mínima de la planta. Las yemas se aíslan sobre medios solidos aunque en algunos casos se utilizan medios líquidos. Frecuentemente se utilizan vitaminas: vitamina B1, piridoxina, ácido nicotínico, ácido pantoténico. Los reguladores suelen utilizarse en bajas concentraciones (0.10.5 mg/L); la auxina puede ser necesario para la formación de raíces, auxinas y citokininas para estimular la división celular; el GA3 se añade a veces para lograr la elongación del vástago (Cruz, 2005). El objetivo de este trabajo fue el cultivo de yemas a partir de explantes de Coffeaarabica, para la obtención de plantas libres de enfermedades como las causadas por los virus. MATERIALES Y METODOS Preparación de la muestra: Se extrajomicroesquejes de Coffeaarabica, se los lavó y desinfectocuidadosamente, se tomó 4 yemas apicales. Preparación del medio de cultivo: El medio utilizado fue Murashige y Skoog enriquecido con 2 mg/l de BAP, 0,5 mg/l de AIA, 30g/L de azúcar y 7.5g/L de agar siendo pH ajustado a 5.75. Desinfección del explante: Se preparó 500 ml de una solución 2% de detergente añadiéndole 3 gotas de tween 20 durante 20 minutos. Se lavó las muestras tres veces con agua destilada y una con agua estéril. Posteriormente se colocó los explantes en 500 ml de cloro al 2% más tres gotas de tween 20 durante 10 minutos, todos estos procesos en constante agitación, evitando dañar al tejido del explante, agregando fungicidas el primero Carbendazin que es un fungicida sistémico y Captan fungicida de contacto.
  • 3. Después de este proceso de desinfección, los explantes fueron trasladados a la cámara de flujo, donde se realizaron tres lavados listos para la siembra. Preparación de la sala de siembra: Se desinfectó el piso de la sala de siembra con kalipto, se limpiaron las cámaras de flujo laminar con papel toalla estéril y sablón. Se introdujo en la cámara todo el material a utilizar en la siembra: lámparas de alcohol, juego de pinzas, bisturí, servilletas estériles, plástico adherente, ligas, botellas de agua estéril, vasos de precipitación vacíos. Se prendió las UV de las cámaras de flujo durante 20 min, se apagó la UV y encendió el flujo de aire durante 15 min. Siembra del explante: Se cortó los segmentos de material vegetal oxidado a causa del cloro. Se quitó las hojas y capas de tejidoque contenía el meristemo. Se trabajó con el explante sobre una servilleta estéril y cerca del flujo de aire de la cámara. Se flameó las pinzas y bisturí con alcohol al 90% antes y después de manipular cada explante y se colocó un explante por frasco. Fotografía 1.- Vista superior del 1er contaminación y necrosis del explante. frasco con Fotografía 2.- Vista lateral del 1er contaminación y necrosis del explante. frasco con Se sembró dos explantes por cada frasco. Antes de sellar el frasco se flameó la boca. Finalmente se selló el frasco con 2 capas de plástico adherente, se aseguró con una liga y se rotuló cada frasco. Fotografía 3.- Vista superior del 2do frasco con contaminación y necrosis del explante. Se evaluó aparición de contaminantes, brotes encontrados en los explantes y variaciones en forma y color. RESULTADOS Se pudo determinar que en los cultivos in vitro que contienen el explante de la planta de (Coffeaarabica) sembrado, si se obtuvo necrosamiento de los explantes además de contaminación como se observa en las Fotografía 1,Fotografía 2,Fotografía 3 y Fotografía 4. Fotografía 4.- Vista lateral del 2do contaminación y necrosis del explante. frasco con Se observó cambios morfológicos representativos en los frascos de cultivo, en su mayoría el cambio consistió en
  • 4. contaminación y cambio de coloración debido a la necrosis, la comparación entre frascos se muestra en las siguientes tablas. Leyenda: 0 es ningún cambio 1 es un cambio ligero 2 es un cambio notorio 3 es un cambio destacable Explante (Cofeearabica) Parámetro Crecimiento Explante 0 1 2 3 1 X 2 X 3 X 4 X Tabla 1.- crecimiento en rango después de la siembra del explante. Explante (Cofeearabica) Parámetro Contaminación Explante 0 1 2 3 1 X 2 X 3 X 4 X Tabla 2.- índices de contaminación después de la siembra del explante. Explante (Cofeearabica) Parámetro Coloración Café Explante 0 1 2 3 1 X 2 X 3 X 4 X Tabla 3.ñ- cambio de coloración de verde a café después de la siembra del explante. DISCUSIÓN Según los resultados obtenidos para establecer un cultivo de yemas es muy importante realizar la escisión solamente del explante seleccionado ya que de esta manera se garantiza la ausencia de posibles virus que afecten a la planta, lo que permitirá tener plantas libres de contaminación, en nuestro caso esto nose dio por una previa infección de la planta, por lo cual los explantes no eran libres de contaminación, otro factor que influencia en la contaminación es el adecuado manejo de limpieza de la sala de sembrío y por parte del investigador que debe seguir todos los pasos correctos para no contaminar el explante. De acuerdo a ello estos explantes al estar libres de contaminantes su viabilidad de generar nuevos brotes a partir dela yema según Santos, 2000 los explantes invitro después de verificación de que no poseen contaminación, permite a la planta absorber todos los nutrientes del medio para poder desarrollarse sin tener que competir por ellos, la presencia de contaminantes es un obstáculo para que el explante sobreviva o logre regenerarse, por ello existe un 90% de viabilidad de que estos explantes con el tiempo logren generar brotes. CONCLUSIONES: El crecimiento de la planta (Coffeaarabica) en el medio de cultivo fue escaso tan solo el cultivo de presento un crecimiento en un rango de 2 en la escala, los demás cultivos estuvieron en los de rangos de cero y uno, poco crecimiento o ausencia del mismo. El tratamiento de desinfección con detergente al 2% durante 20 min + 3 gotas de tween 20 y cloro al 2% durante 20 min + tres gotas de tween 30 y fungicidas,no fue el óptimo para los explantes de Coffea arabicaen la fase de establecimiento del cultivo porque con este tratamiento la mayoría de los explantes están contaminados. El cultivo a partir de yemas es una técnica útil en la obtención de plantas libres de contaminantes, y que además, permite el desarrollo directo de brote, sin formación de callo u organogénesis asegurando que
  • 5. la inestabilidad genética y la variación somaclonal se reducen al mínimo. La tasa de viabilidad durante el establecimiento in vitro se asoció con la presencia ausencia de microrganismos (hongos y bacterias), oxidación y elevado porcentaje de necrosis. RECOMENDACIONES: Para la inducción in vitro de Coffea arabicay un buen manejo de la contaminación microbiana es recomendable utilizar material vegetal joven proveniente de plantas madre de invernadero bajo cuidados fitosanitarios estrictos durante algún tiempo. En este estudio no se investigó la influencia del tamaño de los explantes. Se conoce que la probabilidad de aislar un tejido limpio, es decir, un explante libre de todo microorganismo es proporcional a su tamaño inicial por lo que se recomienda este tipo de estudio para futuras investigaciones. BIBLIOGRAFÍA Akamura, T., & Sondahi, M. (1981). Multiplicaçao "in vitro" de gemas ortiotópicas em Coffea spp. Brasil. Dublin, P. (1987). Multiplication végétative, "in vitro" de l. Arabusta. Café Cacao; Techniques de reproduction végétative "in vitro" et amélioration génetique chez les caféirs cultivés.; Techniques de reproduction végétative "in vitro" et amélioration génétique chez les ca. Paris: IFCC. García, E., & Menendez, A. (1987). Embriogénesis somática a partir de explantes foliares del cafeto 'Catimor'. George, E. F., Hall, M. A., & De Klerk, G. (2008). Plant Propagation by Tissue Culture (Tercera ed., Vol. Primer). The Background. López, C., & Cazola, J. (2006). Saneamiento del material vegetal: Cultivo de Meristemos. Recuperado el 2 de 11 de 2013, de http://www.encuentros.uma.es/encuen tros41/meristemos.html Rafael, M. (1987). Regeneración "in vitro" de explantes caulinares del cafeto (Cofiea arabica cv. 'Catimor'). Caracas, Venezuela: Escuela de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Roca, W., & Beltrán, J. (1984). Cultivo de Meristemos para la Conservación de Germoplasma de yuca in vitro. Cali, Colombia: CIAT.

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