Meristemos de alamo

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El cultivo de meristemos se desarrolla con el objetivo de obtener plantas libres de virus y otros patógenos, se utilizó explantes de Alamo (Populus Alba) que fueron desinfectados con detergente al 2% + Tween 20 durante 20 minutos y posteriormente con cloro al 2% igualmente con Tween 20 durante 10 minutos, además se agregó dos fungicidas: Carbendazim que es un fungicida de sistémico de rápida penetración y Captan que es un fungicida de contacto. Para la siembra se lavó los explantes tres veces con agua estéril y se los cultivo en medio MS enriquecido con 2 mg/L de KIN y 0,5 mg/L de AIA. Después de una semana de incubación en luz natural se observó oxidación 25%, necrosis 15%n de los explantes, contaminación 35% y respuesta 25% en otros

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Meristemos de alamo

  1. 1. Obtención de plantas libres de enfermedades mediante el cultivo de meristemos de Alamo (populus alba). Ayala Paola Carrera de Ingeniería en Biotecnología, Cultivo de Tejidos Vegetales Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE Sangolquí - Ecuador. Noviembre, 2013 RESUMEN El cultivo de meristemos se desarrolla con el objetivo de obtener plantas libres de virus y otros patógenos, se utilizó explantes de Alamo(PopulusAlba) que fueron desinfectados con detergente al 2% + Tween 20 durante 20 minutos y posteriormente con cloro al 2% igualmente con Tween 20 durante 10 minutos, además se agregó dos fungicidas: Carbendazim que es un fungicida de sistémico de rápida penetración y Captan que es un fungicida de contacto. Para la siembra se lavó los explantes tres veces con agua estéril y se los cultivo en medio MS enriquecido con 2 mg/L de KIN y 0,5 mg/L de AIA. Después de una semana de incubación en luz natural se observó oxidación 25%, necrosis 15%n de los explantes, contaminación 35% y respuesta 25% en otros Palabras clave:Propagación, meristemos, y cultivo in vitro. ABSTRACT Meristem cultureis developed withthe aim of obtainingvirus-free plantsand other pathogens, Alamoexplantswas used(PopulusAlba) weredisinfected with2% detergent+Tween 20for 20 minutesand then with2%chlorineequallywithTween 20for 10 minutes, and addedtwo fungicides: Carbendazimwhich is asystemicfungicideCaptanrapid penetrationandwhich isa contact fungicide. For seedingexplantswerewashedthree times withsterile water andthecultureon MS mediumsupplemented with2 mg/LKINand 0.5mg/LIAA.After one weekof incubation indaylightoxidationwas observed25%15%nnecrosisof explants, pollution andresponse35%25%others Key words: Propagation, meristems, and in vitro culture. INTRODUCCIÓN Populuses una planta ornamentalmuy popular debido al color de sus hojas de en envés blanco, otra de lascaracterísticas para que esta planta seencuentre en muchos jardines es su adaptabilidad y que puedepermanecer todo el año sin presentar ningúnproblema (Pereira, 2007). Son capaces de crecer en un suelo arenoso costero soportando eventuales encharcamientos por agua de mar en su sistema radicular (InfoJardin, 2013). Se ha incrementado el interés por las plantas ornamentales debido a comercialización por lo cual se requiereuna producción industrial a granmasa de estas especies y es importante a nivel económico optimizar los procesos y una de lasmejores formas
  2. 2. para hacerlo es labiotecnología por medio del cultivo in vitro. En las yemas se encuentran un grupo de células que conforman los meristemos. La siembra in vitro de meristemos permite regenerar plantas libres de virus, por la gran asepsia que presentan estos explantes(Roca, W. Mroginski, L. 1993).Los meristemos no poseen tejido vascular, lo que los mantiene parcialmente aislados del resto de la planta.Además estas estructuras son dinámicas, es decir que se encuentran en constante crecimiento y división celular, por lo que son explantes muy apropiados ya que en su estado natural, generalmente están libres de patógenos, presentan un alto potencial de propagación y poseen estabilidad genética elevada (Roca & Beltrán, 1984). Para obtener un meristemo apical es necesario tomar segmentos apicales de tallos obtenidos in vitro o procedentes de plantas crecidas en condiciones en el exterior. Si se utiliza la segunda posibilidad será necesario realizar una asepsia previa del tejido. Posteriormente se eliminan los primorios foliares que rodean al meristemo hasta dejar al descubierto el domo meristemático. Finalmente con un bisturí se realiza un corte transversal, de 0.2 a 1.0 mm, debajo del meristemo, con uno o dos pares de primor dios foliares y se coloca sobre un medio de cultivo adecuado, procurando colocar la zona de corte hacia abajo. La composición del medio nutritivo es compleja, ya que un meristemo es una porción mínima de la planta. Los meristemos se aíslan sobre medios solidos aunque en algunos casos se utilizan medios líquidos. Frecuentemente se utilizan vitaminas: vitamina B1, piridoxina, ácido nicotínico, ácido pantoténico. Los reguladores suelen utilizarse en bajas concentraciones (0.10.5 mg/L); la auxina puede ser necesario para la formación de raíces, auxinas y citokininas para estimular la división celular; el GA3 se añade a veces para lograr la elongación del vástago (Cruz, 2005). El objetivo de este trabajo fue el cultivo de meristemos a partir de explantes dePopulus, para la obtención de plantas libres de enfermedades como las causadas por los virus. MATERIALES Y METODOS Preparación de la muestra: Se extrajo los meristemos de segmentos apicales de tallos de árboles de Populus, se eliminan los primorios foliares que rodean al meristemo hasta dejar al descubierto el domo meristemático. Finalmente con un bisturí se realiza un corte transversal, debajo del meristemo, hay q tomar en cuenta que en el momento de la siembra colocar la zona de corte hacia abajo. Preparación del medio de cultivo: El medio utilizado fue Murashige y Skoog enriquecido con 2 mg/l de KIN, 0,5 mg/l de AIA, 30g/L de azúcar y 7.5g/L de agar siendo pH ajustado a 5.75. Desinfección del explante: Se preparó 500 ml de una solución 2% de detergente añadiéndole 3 gotas de tween 20 durante 20 minutos. Se lavó las muestras tres veces con agua destilada y una con agua estéril. Posteriormente se colocó los explantes en 500 ml de cloro al 2% más tres gotas de tween 20 durante 10 minutos, todos estos procesos en constante agitación, evitando dañar al tejido del explante. Después de este proceso de desinfección, los explantes fueron trasladados a la cámara de flujo, donde se realizaron tres lavados listos para la siembra.
  3. 3. Preparación de la sala de siembra: Se desinfectó el piso de la sala de siembra con kalipto, se limpiaron las cámaras de flujo laminar con papel toalla estéril y sablón. Se introdujo en la cámara todo el material a utilizar en la siembra: lámparas de alcohol, juego de pinzas, bisturí, servilletas estériles, plástico adherente, ligas, botellas de agua estéril, vasos de precipitación vacíos. Se prendió las UV de las cámaras de flujo durante 20 min, se apagó la UV y encendió el flujo de aire durante 15 min. Siembra del explante: Se cortó los segmentos de material vegetal oxidado a causa del cloro. Se quitó las hojas y capas de tejido hasta llegar a un explante de aproximadamente 3mm y que contenía el meristemo. Se trabajó con el explante sobre una servilleta estéril y cerca del flujo de aire de la cámara. Se flameó las pinzas y bisturí con savlón antes y después de manipular cada explante y se colocó un explante por frasco. Se sembró dos explantes por cada frasco. Antes de sellar el frasco se flameó la boca. Finalmente se selló el frasco con 2 capas de plástico adherente, se aseguró con una liga y se rotuló cada frasco. Se evaluó aparición de contaminantes, brotes encontrados en los explantes y variaciones en forma y color. Otras características (oxidación, muerte, cambios de color) 1 Meristemo1 N° Brotes Contaminación (hongo o bacteria ) Explante RESULTADOS Verde Meristemo2 X 0 Café Meristemo3 X 0 Café Meristemo4 X 0 Café con moho Tabla 1.- Evaluación y comparación de meristemos cultivados in vitro. Fotografía 1.- Meristemo de Alano no contaminado Los explantes en su mayoría presentaron amplia contaminación y necrosis. Un meristemo posterior a la semana de incubación no presento contaminación pero por su meristemo contiguo si estaba contaminado se lo descarta también. DISCUSIÓN Según los resultados obtenidos para establecer un cultivo de meristemo es muy importante realizar la escisión solamente del explante seleccionado ya que de esta manera se garantiza la ausencia de posibles virus que afecten a la planta, lo que permitirá tener plantas libres de contaminación, en nuestro caso esto se debió a que las células meristemáticas se multiplican más rápido que los virus y bacterias de plantas, además el meristemo no posee de tejidos vasculares y por ende los virus no pueden propagarse por toda la planta (Acosta et al., 2002). En nuestros explantes a pesar del método de desinfección aplicado existió contaminación lo cual puede ser atribuido a que la planta de la cual se tomó la muestra estaba enferma o también a la manipulación y contaminación por parte del laboratorista en el momento de la siembra.
  4. 4. CONCLUSIONES: El cultivo meristemos es una técnica útil en la obtención de plantas libres de contaminantes, y que además, permite el desarrollo directo de brote, sin formación de callo u organogénesis asegurando que la inestabilidad genética y la variación somaclonal se reducen al mínimo. Pero en la cual se recomienda cuidados y asepsia. Al momento de elegir la planta madre del explante de preferencia evitar que se encuentre enferma. BIBLIOGRAFÍA Akamura, T., & Sondahi, M. (1981). Multiplicaçao "in vitro" de gemas ortiotópicas em Coffea spp. Brasil. Dublin, P. (1987). Multiplication végétative, "in vitro" de l. Arabusta. Café Cacao; Techniques de reproduction végétative "in vitro" et amélioration génetique chez les caféirs cultivés.; Techniques de reproduction végétative "in vitro" et amélioration génétique chez les ca. Paris: IFCC. García, E., & Menendez, A. (1987). Embriogénesis somática a partir de explantes foliares del cafeto 'Catimor'. George, E. F., Hall, M. A., & De Klerk, G. (2008). Plant Propagation by Tissue Culture (Tercera ed., Vol. Primer). The Background. InfoJardin. (2013). Alamo Blanco. Obtenido de http://fichas.infojardin.com/arboles/pop ulus-alba-alamo-blanco-chopoblanco.htm López, C., & Cazola, J. (2006). Saneamiento del material vegetal: Cultivo de Meristemos. Recuperado el 2 de 11 de 2013, de http://www.encuentros.uma.es/encuen tros41/meristemos.html Rafael, M. (1987). Regeneración "in vitro" de explantes caulinares del cafeto (Cofiea arabica cv. 'Catimor'). Caracas, Venezuela: Escuela de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Roca, W., & Beltrán, J. (1984). Cultivo de Meristemos para la Conservación de Germoplasma de yuca in vitro. Cali, Colombia: CIAT.
  5. 5. ANEXOS Cuestionario 1. Realice una tabla de comparación entre los cambios morfológicos de los ensayos de su grupo. Tabla adjunta en resultados. 2. ¿Cuáles son las condiciones necesarias para la propagación de plántulas libres de virus? Para la obtención de plantas libres de virus se requiere realizar técnicas como la termoterapia o técnicas in vitro como el cultivo de meristemos. La técnica del cultivo de meristemos consiste en la disección e incubación del meristemo apical de una planta en condiciones de asepsia. Los meristemos carecen de tejidos vasculares y al encontrarse en constante división mitótica se encuentra libre de patógenos(Roca & Beltrán, 1984). El tamaño del meristemo es quizá el factor más crítico de esta técnica, y el éxito en el saneamiento es mayor cuanto más pequeño es el explante (desde 0.05 mm a 0.2 mm de diámetro). También es necesario ajustar el tamaño del explante, es decir el número de primordios foliares que van a acompañar al meristemo para equilibrar el desarrollo del cultivo y conseguir un porcentaje de axenia óptimo. Es necesario indicar que los requerimientos de los medios de cultivo no son muy exigentes salvo si se cultiva el domo meristemático sin primordios foliares y sólo es necesario efectuar los habituales ajustes en el medio para cada especie (López & Cazola, 2006). Otros factores que influyen en el éxito del tratamiento son la rapidez en el aislamiento del meristemo, para evitar la deshidratación de esa frágil estructura y la época del año en que se obtiene el explante, siendo la influencia estacional muy fuerte en algunas especies como patata, clavel, etc. (López & Cazola, 2006) 3. ¿Por qué es aconsejable utilizar vástagos en crecimiento para el cultivo de meristemos? Porque de este modo, se cuenta con certeza, con tejido embrionario con potencial de diferenciación, que tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la planta, constituye un punto activo de crecimiento de la yema vegetal (procesos de diferenciación), y a partir de este se podrá regenerar plántulas completas (Rafael, 1987).

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