Pacerizu investigaciones-validación del método analítico de endotoxinas en dipirona y clindamicina

PACERIZU: Docente de Biología y Química. Regente de Farmacia.
Integrante activo de la Asociación de Analistas y Asesores en Droguerías y Farmacias: Adrogyfarm.
Publicador de Artículos relacionados con las áreas de Educación y Farmacia.
1. INTRODUCCIÓN

Las endotoxinas son unas de las moléculas más comunes a las cuales los humanos están
expuestos. La introducción del termino Endotoxina esta atribuida a un discípulo de Robert Koch,
Richard Pfaiffer en 1892. Este término realmente procedido por la palabra pirógeno en 1876, que
todavía es frecuentemente empleado para describir en primer lugar y de forma básica las
propiedades biológicas de las endotoxinas, como la producción de la fiebre.

Aunque el termino “Endotoxina” se utiliza de vez en cuando para referirse a cualquier toxina
bacteriana relacionada con las células, se reserva correctamente para referirse al complejo del
lipopolisacárido asociado con la membrana externa de bacterias gram negativas tales como E. coli,
Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Neisseria, Haemophilus, y otros patógenos principales.

Pero, ¿por que es necesario hablar sobre contaminación bacteriana en productos farmacéuticos?
Las bacterias se encuentran en todas partes, algunas denominadas patógenas pueden causar
enfermedades y requieren generalmente un hospedero para su multiplicación y transmisión, aunque
pueden vivir en suelos o en ambientes acuáticos por largos periodos de tiempo. Por lo tanto, la
industria farmacéutica es cuidadosa en la producción de drogas, vacunas y dispositivos médicos
que sean estériles y libres de microorganismos.

En este caso se hablara de dos productos empleados con frecuencia como lo son Dipirona usado
como antihistamínico y Clindamicina utilizado como antibiótico contra bacterias gram positivas;
productos de uso cotidiano en seres humanos.

Para la detección de endotoxinas se realiza la prueba de Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL).
Esta prueba es de origen bacteriano la cual resulta ser sensible y especifica para la identificación de
endotoxinas bacterianas llegando a detectar pequeñas partículas de endotoxina. Debido a la
importancia de esta prueba en la industria farmacéutica es indispensable realizar una validación, que
permite dar la garantía de ofrecer productos que contribuyan al mejoramiento de la calidad humana y
la adquisición de productos de óptima calidad.

ESTUDIO DE VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE ENDOTOXINAS EN MEDICAMENTOS DE 15
DIPIRONA Y CLINDAMICINA-CONTROL Y ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE MATERIAS
PRIMAS


2. MARCO TEORICO

2.1 VALIDACIÓN DE TÉCNICAS ANALÍTICAS:

La validación de métodos analíticos es parte fundamental del desarrollo de una nueva formulación y
de la técnica de análisis de control de calidad de una forma farmacéutica, ya que es durante esta
secuencia de pruebas y análisis, en donde el científico se da cuenta si el estudio, el cual esta siendo
evaluado sistemáticamente, cumple con los propósitos para los cuales fue diseñado.
http://colegioqfb.org.mx/resenas/guiavalidacio.htm

De acuerdo a las Buenas Prácticas tanto de fabricación como de Laboratorio, es necesario que todos
los métodos analíticos que se empleen estén validados.

Bajo este marco y considerando la validación de métodos analíticos como el proceso por el cual
queda establecido, por los estudios de laboratorio, que la capacidad del método satisface los
requisitos para las aplicaciones analíticas deseadas.

La validación es el establecimiento de la evidencia documentada la cual provee un alto grado de
garantía de que un proceso específico producirá consistentemente un producto que cumple con sus
especificaciones y atributos de calidad predeterminada.

La validación sigue siendo de gran importancia en la industria farmacéutica ya que ha sido una forma
de conocer y establecer por escrito la calidad de todo aquello que involucre la producción de un
medicamento en particular. Esta consiste en varias etapas en las cuales podemos encontrar a la
validación de limpieza, de métodos analíticos, de proveedores de la materia prima, de procesos
divididos a su vez en procesos asépticos y no asépticos entre otros.
http://colegioqfb.org.mx/resenas/guiavalidacion.htm
2.1.1 Características de desempeño del método analítico:
16 ESTUDIO DE VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE ENDOTOXINAS EN MEDICAMENTOS DE
PRIMAS


El desempeño del método analítico tiene ciertas características que demuestran la capacidad de un
método analítico para mantener a lo largo del tiempo los criterios fundamentales de la validación,
estas son: Exactitud, Precisión, Especificidad, Límite de detección, Limite de cuantificación,
linealidad, Rango y Robustez. La USP XXVIII define las características de desempeño requeridas
para la validación del método, dependiendo del tipo de ensayo. Según U.S. Pharmacopeia &
National Formulary (2005)

 Ensayo de Categoría I: Métodos analíticos para la cuantificación de los componentes
principales de una formulación o ingredientes activos (incluyendo preservativos) en productos
farmacéuticos terminados.

 Ensayos de Categoría II: Métodos analíticos para la determinación de impurezas en
materias primas o productos de degradación en productos farmacéuticos terminados. Estos
métodos incluyen los análisis cuantitativos y ensayos límite, donde se incluye la determinación
de endotoxinas bacterianas por el método de L.A.L.

 Ensayos de Categoría III: Métodos analíticos para la evaluación de características de
desempeño.

 Ensayos de Categoría IV: Ensayos de identificación.
2.1.1.1 Especificidad

Es la capacidad del método para determinar un principio activo con base en sus características
fisicoquímicas o en este caso microbiológicas, independientemente de las respuestas obtenidas por
otras sustancias tales como productos de degradación, principios activos acompañantes o
excipientes. Para este caso la especificidad y selectividad se evalúa tomando como referencia una
solución del producto y determinando la no interferencia de excipientes u otros factores sobre el
resultado a obtener. La interferencia en estos productos se produce como la inhibición total de la
prueba. En este caso la especificidad se mide en los ensayos preliminares, donde podemos detectar
hasta que punto se presenta la inhibición.
PRIMAS


2.1.1.2 Limite de Detección

El límite de detección de un procedimiento analítico es la mínima cantidad de principio activo que
puede ser detectado en una muestra, en este caso la mínima cantidad de Endotoxina detectable con
confiabilidad que corresponde a la sensibilidad del reactivo de L.A.L., pero no necesariamente debe
ser cuantificado como un valor exacto. La evaluación visual puede ser utilizada para métodos de
análisis no instrumental. El limite de detección se determina por el análisis de muestras con
concentración conocidas de principio activo y establecido el nivel mínimo al cual este puede ser
determinado sabiendo el valor de la dilución partiendo del producto puro.
2.1.1.2.1 Limite de Cuantificación

Se define el límite de Endotoxina como la cantidad de Endotoxina permitida en un producto o materia
prima dada, esto dependiendo de la dosis administrada.
2.1.1.3 Rango

El rango de un método analítico, es el intervalo de concentraciones de un principio activo entre el
cual esta demostrado que el método cumple con los parámetros de precisión, exactitud y linealidad
en este caso se evaluó con el rango de especificidad y exactitud, ya que el método no nos permite
arrojar la cantidad de datos para hacer el tratamiento estadístico requerido. Para este ensayo se
toma como rango donde comienza la formación del gel hasta la máxima dilución valida, hasta la cual
permite la técnica; estos puntos son dados por el ensayo preliminar Spike. Dado por
http://colegiogfb.org.mx/resenas/llsimpvalid.htm.
2.2 VIAS DE ADMINISTRACION PARENTERALES (Inyectables)

Se refiere a todas aquellas vías en las que se evita el paso por el aparato digestivo, con especial
referencia a los “inyectables”. Según Goodman & Gilman (1996). Ver tabla N°1

PRIMAS


VIAS DE ADMINISTRACION PARENTERALES

Rutas Biodisponibilidad Ventajas Desventajas

Ejerce acción Incrementa la
inmediata, se puede probabilidad de
controlar los niveles anafilaxis.
Intravenosa, 100% considerada plasmáticos Requiere equipote
Infusión IV instantánea (infusión). Se puede infusión y personal
inyectar grandes especializado;
volúmenes y puede causar
fármacos irritantes. flebitis o
infecciones.

Requiere menos Los fármacos
Intramuscular Rápida para técnica que la IV, se irritantes causan
IM soluciones pueden aplicar dolor; la velocidad
acuosas y para suspensiones o de absorción es
oleosas. emulsiones. variable.

Subcutánea Pronta para Fácil aplicación por Se debe inyectar
SC soluciones el propio paciente poco volumen;
acuosas (insulina). velocidad de
absorción variable.

Tabla1. Características de las vías de administración parenteral

 Intravenosa: Vía parenteral por excelencia, dado que existe una suficiente cantidad de venas
superficiales de buen calibre (accesibles). Implican la disolución del fármaco en un líquido
PRIMAS

(generalmente agua) o vehículo, junto con el cual se administra directamente en la circulación,
por lo que no se produce el proceso de absorción.

 Intramuscular: gracias a la amplia vascularización del tejido muscular, puede administrarse
allí una droga, la cual pasara a la circulación por los capilares. Esta administración suele
retardar un poco la absorción, por lo que se considera la posibilidad de formación de
depósitos de las drogas administradas, las cuales se van liberando lentamente a la sangre.

 Subcutánea: se explota la existencia de una rica red capilar en el tejido subcutáneo; suele ser
más rápida que la intramuscular

 Epidular-Intratecal: vías especiales, de uso más localizado, cuando se quiere evitar el paso
por una barrera hematoencefálica para causar un efecto en el SNC.

 Intraarterial: se puede considerar equivalente a la intravenosa, exceptuando por la menor
accesibilidad de las arterias a la punción. La administración intracardíaca es una forma
especial de la Intraarterial, limitada a muy pocos casos. Según Goodman & Gilman (1996).

2.3 PRODUCTOS A VALIDAR

DIPIRONA
Analgésica, antipirética y antiinflamatoria débil. Usado para dolor de intensidad moderada.

PRIMAS


Figura 1. Dipirona Inyectable 2,5 g/5mL

Usos terapéuticos: Cefaleas, neuralgias, dolores reumáticos y del periodo postoperatorio o de otro
origen. También como antipirético, especialmente en pacientes en los que está contraindicado el
ácido acetilsalicílico. IM se indica en el tratamiento del dolor de la fibra muscular lisa (p.e. cólico
renal).

Dosificación: Dipirona inyectable 2.5mg/5L. Vía IM o IV lenta (3 minutos): Adultos: 300 mg a 2 g.
Dosis máxima diaria: 5 g/ día, En niños: 7 a 25 mg/kg. Dosis máxima 40 mg/kg /día.

Contraindicaciones: Hipersensibilidad a pirazolonas (feprazona, fenilbutazona, oxifenbutazona).
Agranulositosis. Discrasias sanguíneas.

Precauciones y advertencias: Pacientes con antecedentes de alteraciones hematológicas. En el
uso prolongado, deben vigilarse los riesgos hematológicos. Administrar con precaución en pacientes
con disminución de los leucocitos, especialmente a personas con hipersensibilidad a los
pirazolónicos. La aparición de fiebre o ulceraciones bucales puede ser indicio de agranulositosis. En
este caso se recomienda el cese del tratamiento y realizar un hemograma, si se confirma una
agranulositosis el paciente debe ser hospitalizado. Al igual que otros agentes analgésicos
antiinflamatorios, el metamizol sódico ocasiona retensión de sodio y cloruro acompañada de
disminución del volumen de orina y aparición de edema. No modifica la excreción de potasio. El
volumen plasmático suele aumentar, por lo que podría llegar a producirse una descompensación

PRIMAS

cardíaca y edema pulmonar agudo. De acuerdo a lo anterior se debe pesar al paciente crónico
frecuentemente para detectar oportunamente retención de sodio y agua.

CLINDAMICINA

Es un antibiótico que pertenece al grupo de los lincosánidos. Se utiliza para el tratamiento de
infecciones provocadas por bacterias gram positivas sensibles a este antibiótico, especialmente en
pacientes que son alérgicos a los del grupo de las penicilinas.

Figura 2. Clindamicina Inyectable 300mg/mL

Usos terapéuticos: Tratamiento de infecciones provocadas por bacterias sensibles a la clindamicina
localizadas en el tracto respiratorio, la piel, el abdomen, los huesos, infecciones ginecológicas y
dentales graves. Tratamiento de focos de pus localizados. Tratamiento de infecciones cerebrales y
pulmonares en pacientes con SIDA.

Contraindicaciones: La clindamicina puede interaccionar con los siguientes medicamentos:
aminoglucósidos (amikacina, gentamicina), pancuronio, rocuronio, ciprofloxacino, eritromicina o
cloranfenicol. Si toma alguno de estos medicamentos consulte con su médico o farmacéutico.
PRIMAS

Dosificación: La clindamicina inyectable puede administrarse por vía intravenosa o por
intramuscular. La dosis adecuada de clindamicina puede ser diferente para cada paciente. A
continuación se indican las dosis más recomendadas: Dosis usual intravenosa o intramuscular en
adultos: En infecciones moderadas: de 1,2 a 1,8 g de clindamicina repartidos en 3-4
administraciones al día. En infecciones graves: de 2,4 a 2,7 g de clindamicina repartidos en 2-4
administraciones al día. La dosis máxima diaria es de 4,8 g al día. Dosis usual intravenosa o
intramuscular en niños mayores de 1 mes: De 20 a 40 mg de clindamicina por kg de peso repartidos
en 3-4 administraciones al día .Dosis usual intravenosa o intramuscular en niños menores de 1 mes:
De 15 a 20 mg de clindamicina por kg de peso repartidos en 3-4 administraciones al día. Por
inyección intramuscular no deben administrarse más de 600 mg de clindamicina por dosis.

Precauciones y advertencias: Este medicamento debe administrarse con especial precaución en
pacientes con antecedentes de enfermedades intestinales como diarrea o colitis, enfermedad del
hígado o enfermedad del riñón. Para que el tratamiento con clindamicina sea eficaz, debe
administrarse el tratamiento durante 10 días, aunque se haya producido una mejoría de los
síntomas. Como consecuencia del tratamiento con clindamicina puede aparecer diarrea de
intensidad moderada o grave. Si aparece una diarrea intensa, suspenda inmediatamente el
tratamiento con clindamicina, no tome ningún medicamento antidiarreico y consulte a su médico.

2.4 ENDOTOXINAS BACTERIANAS

Las endotoxinas son unas de las moléculas más comunes a las cuales los humanos están
expuestos. La introducción del termino Endotoxina esta atribuida a un discípulo de Robert Koch,
Richard Pfaiffer en 1892. Este término realmente procedido por la palabra pirógeno en 1876, y
todavía es frecuentemente empleado para describir en primer lugar y forma básica las propiedades
biológicas de las endotoxinas, como la producción de la fiebre. Según Prior (1990)

Las bacterias gram negativas tienen lipopolisacáridos como parte de la capa externa de su pared
celular, y bajo determinadas condiciones estos compuestos son tóxicos. Se denominan endotoxinas
porque normalmente se hallan unidas a la célula liberándose en grandes cantidades sólo cuando se
lisan las células. En la mayoría de los casos, el termino Endotoxina puede compararse al de
lipopolisacárido. Según Morrison (1992) y Novitsky (1988)
PRIMAS


Aunque el termino “Endotoxina” se utiliza de vez en cuando para referirse a cualquier toxina
bacteriana relacionada con las células, se reserva correctamente para referirse al complejo del
lipopolisacárido asociado con la membrana externa de bacterias gram negativas tales como E. coli,
Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Neisseria, Haemophilus, y otros patógenos principales. Según
Prior (1990).

2.4.1 Reseña Histórica

La historia de las endotoxinas bacterianas se remonta al siglo pasado. En 1892, Richard Pfeiffer,
descubrió que el Vibrio cholerae, microorganismo causante del cólera, sintetizaba una sustancia
resistente al calor, que solo se liberaba al exterior cuando este se desintegraba.
www.horsheshoecrab.org

Por ser una toxina que pertenece al interior de la bacteria la denomino “Endotoxina”, termino que es
inexacto puesto que las endotoxinas residen en la superficie de la bacteria y no en su interior.

Simultáneamente los estudios de Centanni condujeron a la obtención de una toxina termoestable a
partir de Salmonella typhi, a la cual determino “pirotoxina”. La Endotoxina de Pfeiffer y la pirotoxina
de Centanni resultaron básicamente idénticas.

En la década de los treinta, Boivin y Co, trabajando con extractos relativamente impuros, coincidieron
en que la toxina termoestable de todas las bacterias gram negativas estudiadas contenían en su
estructura un polisacárido, un lípido y una proteína, elucidando así una aproximación a la
composición real de las endotoxinas.

Murria J. Shear, en 1943, determino que el material tóxico extraído de Serratia marcescens, estaba
constituido fundamentalmente por un lípido y un polisacárido, en razón de estos rasgos químicos le

PRIMAS

dio el nombre de Lipopolisacáridos o LPS. Para entonces, la información acumulada sugería que el
lipopolisacárido, la pirotoxina y la Endotoxina eran el mismo término. Según Rietschel (1992)

Continuando estas investigaciones, Wesphal y Luderitz desarrollaron una técnica que permito
obtener a partir de bacterias gran cantidad de un extracto tóxico, muy puro, constituido siempre por
un lípido y un polisacárido junto con fósforo. Este resultado indicó que las moléculas debían ser
prácticamente idénticas desde el punto de vista químico. A partir de entonces el termino “pirotoxina”
cayo en desuso y se empleó indistintamente el de Endotoxina o lipopolisacárido. Además
contribuyeron a demostrar que todas las bacterias gram negativas producen endotoxinas. Según
Morrison (1992)

A medida que progresaban los trabajos estructurales, se acumulaba las pruebas que apoyan la idea
de un lípido A responsable, a la vez de las alteraciones producidas por las Endotoxinas, así como del
refuerzo de la inmunidad. Quedo de esta manera demostrado que la cadena polisacárida (Antigeno-
O y núcleo) no era necesaria para la toxicidad ni la inducción de la fiebre. Según Mills (1976)

En 1983, Zohrinerg y Col, descifraron la estructura complementa del lípido A de E. coli.
Simultáneamente un grupo de investigadores de la universidad de Wisconsin determinaron la
organización estructural del lípido A en la Salmonella typhimurium resultando ser idéntico al de la E.
coli. Kusumoto y Col en 1984 sintetizaron químicamente el lípido A de E. coli, demostrando poseer
las mismas propiedades del lípido A natural.

2.4.2 Estructura

Las endotoxinas tienen un peso molecular aproximado de 200.000 a 1’000.000 daltons y son
termoestables. La estructura característica tiene tres distintas regiones. Lipido A, una unidad de
glucosamina que contiene ácidos grasos, con una longitud de cadena de 10 a 20 átomos de
carbono, un oligosacarido conocido como core, el cual contiene heptosas inusuales y un único
azúcar, conocido como el 3-deoxi-D-octulosonato (KDO) y por ultimo el Antigeno O, un oligosacarido
repetido, una molécula extraordinariamente variable que comúnmente contiene galactosa, glucosa,
Ramnosa y manosa, generalmente esta formada por uno o dos azucares dideoxi raros como
PRIMAS

abecuosa, colitosa, paratosa o tivelosa, estos azucares están conectados en secuencias de cuatro a
cinco azucares (frecuentemente ramificados) que se repiten para formar la molécula completa.
Según Prior (1990) y Agudelo (1999)

El oligosacárido repetido, cubiertas (core) y el disacárido del lípido A son hidrofílicos; los ácidos
grasos confieren el carácter hidrofóbico de la terminación del lípido A. Ver Anexo 1.

La purificación de las fracciones del LPS ha demostrado que es un complejo del lípido A, el
responsable de la toxicidad y que la acción principal del polisacárido es hacer el lípido hidrosoluble.
Sin embargo, los estudios en animales han demostrado que para lograr una respuesta, se necesita
el complejo endotóxico que contiene a la vez el polisacárido y el lípido. Según Sweadner et al (1977).

La actividad biológica de las endotoxinas se asocia a la estructura del lipopolisacárido (LPS). La
toxicidad se asocia al componente del polisacárido. Los antígenos de la pared de la célula (Antígeno
O) de bacterias Gram negativas son componentes de LPS. Los lipopolisacáridos generan gran
variedad de respuestas inflamatorias en un animal, porque activan el complemento por un vía
alterna, la cual a menudo hace parte de la patología de infecciones bacterianas gramnegativas. Dada
en la Universidad de Kenneth Todar del departamento de Wisconsin-Madison de bacteriología
(www.bact.wisc.edu/bact330/lectureendo)

La relación de endotoxinas a la superficie bacteriana de la célula se ilustra en la figura 3.

PRIMAS


Figura 3. Membrana celular de Bacterias Gram Negativas
Foto tomada de: www.ahu.es/biomoleculas/hc/sugar35B.htm

Las bacterias in vivo, Gram negativas lanzan probablemente cantidades minuciosas de endotoxinas
mientras que crecen. Se sabe, que esas pequeñas cantidades de endotoxinas pueden ser lanzadas
en forma soluble, especialmente por los cultivos jóvenes. Sin embargo, las endotoxinas siguen
siendo asociadas con la pared de las células hasta la desintegración de las bacterias, mediada por el
complemento, la lisozima, y de la fagocitosis de células bacterianas.

La función de la membrana externa de bacterias gramnegativas es actuar como barrera de la
permeabilidad. La membrana externa es impermeable a las moléculas grandes y a los compuestos
hidrofóbicos del ambiente. La Endotoxina (LPS) esta situada en la cara externa de la membrana,
donde media el contacto con el ambiente. Los LPS son esenciales para la función de la membrana
externa, y como componente estructural de la célula, pueden desempeñar varios papeles en la
patogenicidad de infecciones bacterianas Gram negativas. Primero, es una barrera que es
permeable solamente al peso molecular bajo, moléculas hidrofilicas de la permeabilidad. En la E. coli
los poros ompF y del ompC excluyen el paso de todas las moléculas hidrofóbicas y de cualquier
PRIMAS

molécula hidrofilica mayores de un peso molecular de cerca de 700 daltons. Esto previene la
penetración de las bacterias por las sales de la bilis y otras moléculas tóxicas. Es también una
barrera a muchos agentes antimicrobianos. En segundo lugar, impide la destrucción de las células
bacterianas por los componentes del suero y las células fagocitarias. Tercero, los LPS desempeñan
un papel importante como estructura superficial en la interacción del patógeno con su anfitrión. Por
ejemplo, los LPS se pueden implicar en la adherencia (colonización), o la resistencia a la fagocitosis,
o a los cambios antigénicos que determinan el curso y el resultado de una infección.

2.4.2.1 Naturaleza química de las endotoxinas

La mayoría del trabajo sobre la estructura química de la Endotoxina se ha hecho con la especie
Salmonella y E. coli. Los LPS se pueden extraer de las células enteras por el tratamiento con fenol
al 45% a 90°C: los LPS son moléculas anfipáticas complejas cuyo peso varía extensamente con la
composición química entre especies bacterianas, la arquitectura general de LPS se demuestra en al
figura 4. La estructura general de los LPS de las Salmonellas se demuestra en la figura 5 y la
estructura completa del lípido A de las Salmonellas se ilustra en la figura 6.

Figura 4. Arquitectura general de Lipopolisacáridos
Foto tomada de: www.ahu.es/biomoleculas/hc/sugar35B.htm

PRIMAS


Figura 5. Estructura general de los LPS de las Salmonellas
Foto tomada de: www.arches.uga.edu/ ~kristenc/cellwall.html

Figura 6. Estructura completa del lípido A de las Salmonellas
Foto tomada de www.arches.uga.edu/ ~kristenc/cellwall.html

Los LPS consisten en tres componentes o regiones, el lípido A, un polisacárido de R (core o núcleo)
y un polisacárido de O (Antigeno O).

La región I Lípido A es el componente de lípido de LPS. Contiene el anclaje hidrofóbico de la
membrana a la región de LPS. Lipido A consiste en un dimero fosforilado de N-acetilglucosamina
(DFN) con 6 a 7 ácidos grasos (AG) unidos. Se encuentran generalmente 6 AG todo el AG en el
lípido A se satura. Algún AG se une directamente al dimero de DFN y otros se esterifican a los
ácidos grasos 3-hidroxi presentes. La estructura del lípido A se conserva considerablemente en las
bacterias gramnegativas.

PRIMAS

El Antigeno de la base de la región II. ® o el polisacárido de R se une a la posición 6 de una DFN. El
Antigeno de R consiste en una cadena corta de azúcares. Por ejemplo: KDO-hep—Glu-Galón Hep-
Glu-GluNac-.

Dos azucares inusuales están presentes, heptosa y el ácido-3dioxi-D-Octulosonato (KDO), en el
polisacárido de la base: el KDO presente en LPS ha sido un indicador de los análisis para los LPS
(Endotoxina).

Con variaciones de menor importancia, el polisacárido de la base es común a todos los miembros de
un genero bacteriano (e.j. Salmonella), pero es estructuralmente distinto en otros géneros de
bacterias gramnegativas. Salmonella, Shigella y Escherichia tienen núcleos similares pero no
idénticos.
El Antigeno somático de la región III. (O) o el polisacárido de O se une al polisacárido de la base.
Consiste en subunidades repetitivas del oligosacárido compuestas de 3-5 azucares. Las cadenas
individuales varían en la longitud que se extienden hasta 40 unidades. El polisacárido de O es mucho
más largo que el polisacárido de la base, y mantiene el dominio hidrofílico de la molécula de los LPS.
Un determinante antigénico importante de la pared de células gramnegativas reside en el
polisacárido de O. Según Prior (1990)

La gran variación ocurre en la composición de los azucares en la cadenas lateral de O entre la
especie e incluso las tensiones de bacterias gramnegativas. Las variaciones en el contenido del
azúcar del polisacáridos O contribuyen a la amplia variedad de tipos antigénicos de Salmonella y de
E. coli y probablemente a otras tensiones de especies gramnegativas. Los azucares particulares en
la estructura, especialmente las terminales, confieren especificidad inmunológica del Antigeno de O,
además de determinar la estructura del lipopolisacárido, liso o rugoso.

La biosíntesis de LPS es terminantemente secuencial. Los azucares de la base son agregados
secuencialmente al lípido A por las adiciones sucesivas, y la cadena lateral de O se agrega por
ultimo, una subunidad a la vez. Las características de los mutantes que producen las moléculas
incompletas de los LPS sugieren la naturaleza y las funciones biológicas realizadas por varias partes
de la molécula de los LPS.
PRIMAS


La perdida del Antigeno O da lugar a la perdida de la virulencia que sugiere que esta porción es
importante durante una interacción del anfitrión-parasito.
Se sabe que tales mutantes “rugosos” son más susceptibles a la fagocitosis y a las reacciones
bactericidas.

La región interior de LPS, del lípido que contiene en A y de tres residuos de KDO, parece ser
esencial para la viabilidad, probablemente para montar la membrana externa.
www.bact.wisc.edu/bact330/lectureendo
2.4.3 Mecanismo de acción

Una vez las endotoxinas se encuentran libres para actuar, no inducen la reacción febril por unión a
las células de los centros cerebrales reguladores de la temperatura. Sucede una activación de
determinadas células del huésped, macrófagos, que las instan a segregar moléculas que hacen el
papel de mediadores. Estos mediadores actúan localmente y/o viajan por la sangre desencadenando
una respuesta.

Mergenhagen y col, propusieron tres posibles mecanismos seguidos por las endotoxinas en la
activación de los macrófagos, así:

En la sangre la Endotoxina se une a una molécula circulante, proteína ligadora de lipopolisacáridos
(PLL) que se une, en una superficie de los macrófagos, a un receptor conocido, como CD14. Este
hallazgo convierte a las endotoxinas en las únicas sustancias que interaccionan con un receptor
después de formar primero un complejo con una proteína circulante. Según Agudelo (1999)

Particularmente para el primer mecanismo, el complejo activa al receptor para la emisión de un
mensaje estimulador que desencadena como respuesta, la producción de mediadores que se
encargan de la sintomatología. En esta emisión productora de mediadores de acuerdo con el
segundo mecanismo propuesto, es posible también que el CD14 no emita ningún mensaje
estimulador, pero en cambio capacite al LPS para activar un segundo receptor ubicado también en la
superficie del macrófago.
PRIMAS


Por ultimo el tercer mecanismo propone que el LPS activa directamente ciertos receptores sin la
ayuda de la PLL o del CD14. Según Rietschel & Brade (1992)

Los mediadores producidos por la activación de los macrófagos se clasifican en tres grupos:
 Proteínas
 Radicales libres de Oxigeno
 Lípidos

Estos mediadores pueden actuar independientemente, de manera conjunta o de manera secuencial
provocando diversos efectos, según la cantidad de mediadores producidos.

Bajos niveles de mediadores traen consigo efectos beneficiosos que se traducen en fiebre
moderada, estimulación generalizada del sistema inmunitario y destrucción de bacterias. Por el
contrario, una producción excesiva de mediadores trae como consecuencia efectos dañinos como
fiebre alta, hipotensión, coagulación diseminada de la sangre y shock letal. Según Agudelo (1999).

2.5 PRUEBA DEL LISADO DE LIMULUS AMEBOCITO
2.5.1 Reseña Histórica

En 1964, Levin J y Bang F.B, reportaron que las preparaciones de Endotoxina termoestable
aisladas de Escherichia coli y Vibrio marino, inducía la coagulación extracelular de la hemolinfa del
Limulus polyphemus, conocido como cangrejo de herradura. Este efecto había sido reportado por
Loeb L. en 1909 en los cangrejos, pero sin definir la causa que lo inducía.
www.mbl.edu/animals/limulus/blood/bang.html

Los estudios de Levin y Bang, les permitió discernir lo siguiente. Los Amebocitos, las células
constituyentes de la hemolinfa del cangrejo eran requeridas para la coagulación, la ruptura de los
Amebocitos desencadenaba igualmente la reacción y cantidades de Endotoxina eran inactivadas por
la reacción de coagulación; posteriormente se encontró que la inactivación era debida a un proceso
de detoxificacion normal por parte del cangrejo, mediante la acción de un lipoproteína y un sistema
PRIMAS

de complemento de la hemolinfa del Limulus, la eliminación de las proteínas descritas por la técnica
de extracción con cloroformo, permitió establecer que la reacción de gelificación era debida a una
reacción enzimática que requería de las proteínas coagulantes que se encontraban en los
Amebocitos Según Sullivan & Watson (1974)

En estudios posteriores se desarrollo un ensayo sensible para determinar endotoxinas en plasma
humanos usando el material de lisado de Amebocitos de Limulus, detectando cantidades de
0.0005µg de Endotoxina por mL y encontraron que la reacción era dependiente de la concentración
de Endotoxina usada. Yin Et y colaboradores en 1972 refinaron el ensayo de Endotoxina de Levin
para detectar picogramos de Endotoxina y demostraron que la porción del lípido A del
lipopolisacárido era responsable de la gelificación del lisado. Según Levin y Tomasulo (1970)

El reactivo celular q ue resulto fue llamado Lisado de Amebocitos de Limulus. El nombre LAL es
extremadamente descriptivo: Limulus, es le nombre genérico para los cangrejos de herradura:
Amebocitos, son las células sanguíneas que contienen los componentes activos de reacción; y
Lisado, describe el proceso original usado por Levin y Bang para obtener estos componentes. En el
proceso Levin y Bang, los Amebocitos, después de ser separados del plasma (hemolinfa), son
suspendidos en agua destilada en donde son lisados (rotos) debido a la alta concentración de sal
que contiene los Amebocitos vs la ausencia de sal en el agua destilada. Este proceso con algunas
modificaciones mínimas es usado todavía para producir LAL. Según Prior (1990)

La observación de la coagulación intravascular ocurrida en el cangrejo tras la inyección de bacterias
gramnegativas vivas o muertas por calor, permitieron el desarrollo del test LAL como una prueba útil
en farmacología y en medicina. En 1964, Levin y Bang fueron los primeros en observar la reacción
de gelificación in vitro entre la Endotoxina y el lisado hecho de Amebocitos, las únicas células
circulantes en la sangre de los cangrejos de herradura. Esta reacción de gelificación por regla se
caracteriza como una reacción de coagulación de la sangre en animales superiores. Mas tarde, el
test LAL fue usado como alternativa de la prueba en conejos para detectar contaminantes
(pirógenos) en preparaciones farmacéuticas. Según Morrison (1992)
2.5.2 Preparación del Lisado

PRIMAS

Los cangrejos son recolectados y sangrados bajo condiciones asépticas y regresados a su hábitat
sin sufrir ningún daño.

La sangre es centrifugada para sedimentar los Amebocitos y el plasma es removido. Los amebocitos
son luego lisados por una variedad de diferentes métodos y tratados de acuerdo a los productores.
Se ha reportado variaciones significativas en la actividad de los pools del Lisado de Limulus atribuido
a las diferencias estacionales. Las empresas manufactureras mejoran su sensitividad y eliminan las
variabilidades estacionales, extrayendo el lisado con cloroformo, sin embargo se puede utilizar otros
métodos; la sensibilidad de los lisados varían por los diferentes métodos utilizados por los
productores. Según Jorgensen & Smith (1973) y Tsuji & Steindler (1983).

El líquido lisado es dispensado en viales multi test o en viales para un solo test y luego es liofilizado.
Aunque los viales de un solo test son más costosos que los multi test son más convenientes y
manejables para la aplicación clínica especialmente en donde hay pocas facilidades de laboratorio.
Aunque se recomienda guardar los viales de LAL a 4°C, se ha visto que los liofilizados de Limulus
son estables a temperatura ambiente (25°C) hasta por un año. Según Sullivan y Watson (1974)

Cada lote de Limulus producido por cada manufacturero licenciado es aprobado por el centro para la
evaluación e investigación de Biológicos, Administración de Drogas y Alimentos de los Estados
Unidos (FDA) contra un reference standard de Endotoxina y la sensitividad es expresada en
unidades de Endotoxina (EU/mL). Según www.criver.com/endosafe/techdocs/laltiems0599.html
2.5.3 Bioquímica del test LAL

La proteína responsable de la coagulación ha sido llamada coagulógeno que en mamíferos
correspondía al fibrinógeno. En cascada el producto llega hasta la coagulina que en mamíferos es
equivalente a la fibrina. Es aquí donde la similitud entre la sangre del cangrejo y de los mamíferos
terminan en coagulación, a menos que la coagulina no forme uniones covalentes entre las moléculas
cuando el coagulo es formado. Esto significa que el coagulo del cangrejo de herradura es
físicamente frágil y se desintegra muy fácilmente, este hecho probablemente contribuye a la
habilidad de los cangrejos para sobrevivir a al coagulación de su sistema circulatorio. Según Prior
(1990) y Roth & Tobias (1993).
PRIMAS


Levin y Bang observaron que la coagulación en el cangrejo de herradura se debía a una cascada de
actividad enzimática por lo que propusieron un modelo simple que muestra las proteínas que
interviene en el fenómeno. En este modelo, la Endotoxina inicia la reacción con un número
desconocido de pasos que al final resultan en la actividad de la “enzima de coagulación”. Una vez
activada la enzima de coagulación, esta se une a la proteína sustrato, coagulógeno, liberando el
fragmento coagulina. Las moléculas de coagulina, se unen por interacción iónica dentro de la matriz
de un gel. Cuando esta reacción ocurre in vitro, se tiene el test LAL “gel-clot”. Ver figura 7.

Endotoxina

Enzima de coagulación Enzima de coagulación
inactiva activa

Coagulogeno Coagulina

Figura 7. Primer concepto de la reacción de coagulación del LAL
En 1985, el modelo anterior fue modificado por Iwanaga, quien ilustra los pasos intermedios en la
activación de la cascada asignando los nombres a las enzimas. Las enzimas en la cascada de
coagulación son serin proteasas. Estas enzimas requieren cationes divalentes para su activación. La
reacción entre la enzima de coagulación activada y el coagulógeno es extremadamente específica.
Solo se conoce otra serin Proteasa que es capaz de unirse al coagulógeno en el mismo sitio como la
proteína de activación de coagulación y liberar la coagulina para formar el coagulo. Esta enzima es la
tripsina. La tripsina es capaz, además, de causar un falso positivo en el test LAL, siendo la
responsable de causar el coagulo en ausencia de Endotoxina. Iwanaga (1985)
El test, es extremadamente sensible a la Endotoxina, debido a la cascada de activación enzimática.
Una molécula de Endotoxina activa la molécula conocida como factor C, este a su vez, activa las
PRIMAS

moléculas de factor B que entran en contacto con el. A medida que el factor B es activado, activa
moléculas de enzimas de coagulación que se encontraban inactivas; estas mismas enzimas ya
activadas cortan el sustrato coagulógeno tan rápido como se acumulen las mismas activadas.
Aunque esto parece una simplificación de la bioquímica entre mayor cantidad de pasos haya en la
cascada de activación mayor será la magnitud de la respuesta final. El efecto de una molécula de
Endotoxina ha sido magnificado por órdenes de magnitudes. Ver figura 8.

Endotoxina

Factor C Factor C activo Β-Glucano

Factor B Factor B/G Factor G

Enzima coagulante inactiva Enzima coagulante activa

Coagulogeno Coagulina

Figura 8. Esquema de cascada de coagulación del LAL.
Iwanaga (1985)

Levin y Bang, también mostraron que la turbidez de la reacción in vitro del LAL aumenta con el
tiempo después de la adición de Endotoxina. La turbidez es causada y se vuelve visible antes de que
PRIMAS

la mezcla de la reacción gelifique completamente. Estos investigadores mostraron que la tasa de
incremento de turbidez era una función de la concentración de Endotoxina. La turbidez se vuelve
entonces una alternativa como indicador de la reacción LAL y los protocolos del test clasificados
como test turbidimetricos.

En 1977 Nakamura, mostró que la enzima de coagulación activa puede romper el mismo sustrato
sintético como el activado factor X, una de las enzimas de la sangre humana que participan en la
cascada de coagulación. El péptido sintético puede ser usado para medir la cantidad de enzima de
coagulación activada, en la misma manera que es usado para medir la cantidad de factor X activado.
El sustrato tiene un cromógeno llamado paranitroanalida (pNA) unido a un aminoácido homologo del
sitio de ruptura. En su forma unida el pNA tiene color, cuando es separado por acción de las enzimas
activadas se vuelve amarillo. La tasa de incremento de rupturas se revela por la intensidad del color
amarillo y esta función de la tasa de activación de las proteasas en la cascada y así mismo también
depende directamente de la concentración de Endotoxina presente. Un test LAL cromogénico es
aquel que utiliza la hidrólisis de los sustratos sintéticos como un indicador del aumento de la enzima
de coagulación activada y de la presencia de Endotoxina. Nakumura (1977)

Varios sustratos patentados son mejores indicadores de la activación de la enzima de coagulación y
están disponibles y en uso en formulaciones cromogénicas hoy en día. Estos sustratos han sido
diseñados para ser más parecidos a la secuencia de aminoácidos presentes en el coagulógeno. No
importa cuan parecidos sean, los sustratos sintéticos no son específicos para la enzima de
coagulación activada como ocurre naturalmente con el coagulógeno. Otras serin Proteasa en adición
a tripsina son capaces de romper los sustratos sintéticos y de causar falsos positivos.
2.5.4 Interferencias en el ensayo LAL
La reacción LAL se ve interferida frecuentemente por la muestra que esta siendo ensayada y puede
ser causada por diferentes factores. (tabla 2)
Hay tres clases de interferencia:
2.5.4.1 Inhibición: es el tipo de interferencia más común y se reconoce por una disminución de la
sensibilidad del LAL.
Todo producto debe ser ensayado previamente para verificar la ausencia de inhibición, ya que esta
puede llevar a resultados falsos positivos.
PRIMAS


La inhibición se presenta cuando las muestras a ensayar interfieren con la reacción de LAL. La
interferencia puede ser causada por varios factores:

 El pH de la dilución debe estar entre 6 y 8, y el del LAL debe estar entre 5.5 y 8.5. Aunque el
reactivo de LAL posee cierta capacidad bufferizante, la mezcla del producto- reactivo puede
resultar crítico. Según Werner (1998) y Cooper (1998)

 Las proteínas que tengan la capacidad de unirse a la Endotoxina. Las proteasas pueden
desnaturalizar las proteínas de la cascada enzimática. El calentamiento puede desnaturalizar
las proteínas por lo que si este es adecuado puede permitir que las endotoxinas sean
detectadas.
 Los agentes Quelantes que desnaturalizan las proteínas como alcoholes y fenoles, los cuales
pueden ser eliminados por evaporación o calentamiento adecuado. Estos no deben ser
eliminados a sequedad porque pueden afectar a las endotoxinas Los agentes Quelantes
como la EDTA, enlazan los cationes divalentes causando inhibición.

 Las sustancias inmisibles con el reactivo LAL también puede ser otra causa de inhibición. Los
cationes divalentes pueden causar inhibición, pues neutralizan carga negativa de Endotoxina,
incrementan agregación disminuyendo actividad/potencia. Sal excesiva puede inhibir la
reacción. Los tubos con restos de NaOH causan interferencia y como resultado una inhibición
en la formación del gel. Según Prior (1990)

2.5.4.2 Potenciación: es un incremento en la sensibilidad del reactivo LAL, por tanto detecta más
Endotoxina de la presente en la muestra. Es fácil confundir una potenciación con la presencia de
endotoxinas en la muestra. Una forma de conocerla, es colocando una cantidad de control de
Endotoxina estándar (CSE) a una muestra libre de endotoxinas y determinando con el ensayo LAL la
cantidad de endotoxinas presentes. Según Cooper (1998)

Si la cuantificación de las endotoxinas resulta mayor que la cantidad conocida adicionada se habla
del fenómeno de potenciación.
PRIMAS


2.5.4.3 Falsos positivos: Resultados falsos se obtienen por la presencia de sustancias que activan
el LAL y son diferentes a las endotoxinas. Sugiere que las endotoxinas están presentes cuando en
realidad no es así.

Para reconocer un resultado falso positivo debe conocerse la naturaleza del producto y el proceso de
fabricación. Según Devleeschouwer et al (1984).

Estos casos son muy raros, se sabe que sustancias como la tripsina y glucanos son causantes de
resultados falsos positivos. Según Werner (1988), Zhang et al. (1994)

FACTORES QUE INTERFIEREN EN EL ENSAYO DEL LAL

FISICOS
Temperatura 32 a 4°C (USP requiere 37°C)
Viscosidad <1.4centipoises a 35°C
Vibración Mínima para formación del gel
QUIMICOS
pH 6.0-7.5
Alcohol <0.5 % P/V
Agentes quelantes <0.01M de iones divalentes
Urea <1M
Osmolaridad <300 miliosmoles/Litro

Tabla 2. Factores Físicos y químicos que causan interferencia en la prueba
2.5.4 Regulación para la prueba del LAL

La oficina de la FDA de Biológicos, reconoció la detección de Endotoxina por técnica del extracto de
Limulus Amebocito (LAL), para productos farmacéuticos y aparatos médicos de uso humano, al igual
que se estableció un Estándar de referencia de endotoxina, para ser usado por los manufactureros
del LAL y probar la potencia de cada lote de lisado. En 1977, la oficina introdujo un Estándar de
Referencia para el lisado, con el objeto de establecer la sensitividad de cada lote de lisado comercial,

PRIMAS

publicando guías detalladas de los procedimientos del laboratorio para comparar cada lote del lisado
al estándar. Otras guías detallaron igualmente la sensitividad promedio del rotulo del titulo para cada
lote del LAL y Estándares del LAL para farmacéuticos; posteriormente la Asociación de Drogas
Parenterales propuso un limite de endotoxina alternativo basado en la dosis máxima en conejos y
humanos que la FDA aceptó y comenzó a formar parte de la nueva guía para productos biológicos y
aparatos médicos; igualmente la descripción de la técnica del LAL para determinar endotoxinas
bacterianas se encuentra oficialmente en la USPXXVIII. Según USP XXVIII, Pearson et al. (1984).

2.5.6 Especificidad en la prueba de LAL

Hay estudios contradictorios sobre la especificidad del ensayo LAL, algunos reportes, exponen la
reactividad de la prueba con productos de la pared celular de hongos, bacterias gram positivas y poli
nucleótidos. En general, el LPS puede producir un ensayo de LAL positivo, en concentraciones tan
bajas como pico gramos por mililitro, a diferencia a las concentraciones requeridas reportadas para
péptido glucano o 1,3β glucanos, de 1000 a 400.000 veces más alta que la combinación requerida
de endotoxina. El LAL preparado de los cangrejos japoneses conocido como tal, es más reactivo que
el americano al 1,3 β glucanos, debido a la activación alterna del factor G en la cascada de reacción
del LAL. Según Obayashi et al (1985), Iwanaga et al (1985).

2.5.7 Sensitividad en la prueba del LAL
La sensitividad del LAL es definida como la más baja concentración de una endotoxina purificada
que puede producir un gel firme, el cual, puede permanecer intacto cuando es invertido 180° par el
método del gel clot, después de una hora de incubación a 37°C. Según Watson et al (1982).

Estudios realizados por Cooper J.F et al en 1971 demostraron que la prueba del LAL es cinco veces
más sensible a endotoxinas purificadas, que prueba en conejos y a medida que fue mejorando la
producción y la metodología de formulación del LAL, se incrementó de 10 a50 veces, para la toxina
purificada y la hallada en forma ambiental, llegando a detectar por parte del LAL de 0.01 a 0.1
nanogramos de endotoxina por mililitro de solución a diferencia de los conejos donde se detecto de 1
a 10 nanogramos de endotoxina enterobacteriana. Sullivan y Watson (1974) & Marcus et al (1977).

PRIMAS

2.5.8 Método de gelificación (gel-clot) para la detección de endotoxinas bacterianas en
productos parenterales humanos y veterinarios.

Su principio radica en el test original, la enzima coagulante activada por la endotoxina, cliva al
coagulógeno para formar el gel, la reacción depende de los siguientes parámetros en condiciones
estandarizadas: 37°C, pH entre 6 8 con un tiempo de incubación de 60 minutos. Según Prior (1990) y
Tsuji et al (1980).
Se fundamenta en la activación por parte de la endotoxina, de la enzima procoagulante que luego
reacciona con el coagulógeno para formar el gel (coagulo).
La proteína coagulable y el gel de proteínas fueron purificadas y caracterizadas por Solum (1973),
mientras que la enzima coagulable fue purificada y parcialmente caracterizada por Sullivan y Watson
en 1874. Según Pearson (1985)
Este método puede ser considerado como semicuantitativo, puesto que el punto final real del ensayo
se halla entre la mayor dilución de la muestra que presente en gel firme (punto final determinado) y la
dilución inmediatamente anterior.

2.6 VALIDACION DE LA TÉCNICA DEL LAL

La validación es el soporte que nos permite establecer si los productos farmacéuticos inyectables
como Dipirona y Clindamicina son compatibles con el método del LAL, para ello la Farmacopea
USP, se basa en la publicación de la FDA interina, Guía de Validación del test del LAL como test de
producto final para Drogas Parenterales Humanas, animales y de productos biológicos, del año 1987
y una guía interina, la cual fue corregida en julio de 1991.
Para llevar a cabo la validación por el método del LAL se debe tener en cuenta lo siguiente:
2.6.1 Estándares de endotoxina para la prueba del LAL
La búsqueda de un Estándar, fue complicada debido a que la potencia de la endotoxina varia con el
método de purificación, el origen bacteriano y la formulación, igualmente la selección de la
preparación de la endotoxina, debe poseer ciertas características como son: libre de proteínas
activas biológicamente, actividad endotoxica, caracterización química y estable bajo liofilización, fue
así como se preparo un lote de referencia de lipopolisacárido (LPS) derivado de E. coli O113:H10:K(-

PRIMAS

), que reunió los criterios mencionados anteriormente y se conoce como Estandar de Endotoxina de
Referencia (RSE). www.cmcissues.com/methods/endotoxins_test.htm
La FDA tiene un sublote de la RSE, conocido como EC-6, que es usado por los distribuidores del
LAL, para realizar ensayos de sensitividad (una unidad endotoxina UE= Unidad Internacional UI),
sirve como estándar primario, para calibrar la potencia de un Control de Endotoxina Estándar (CSE-
es producido por los distribuidores del reactivo, para trabajo de rutina) con un lote especifico de LAL,
como lo requiere la USP. Según Weary (1997)
La RSE es costosa, de ahí que el CSE sirva como sustituto de la RSE durante las pruebas de
endotoxina de rutina y confirma la validez de recuperación de controles de productos positivos
verificando de la misma manera los parámetros de la prueba del LAL, sensitividad del LAL usado y
validación del analista: para el método del LAL (gel-clot) la potencia CSE es encontrada probando en
paralelo, una serie de diluciones dobles de RSE y CSE, el promedio geométrico del punto final de la
serie de RSE es dividido por el promedio geométrico del punto final de la serie de CSE en mg/mL
dando un promedio geométrico de calibración de UE/mg. El promedio de la EC-5 y EC-6 es de
10UE/mg, o 10.000 UE/mL. Según Hochstein et al (1994)

2.6.2 Validación del operario
Se recomienda para un operario o analista que va a comenzar a trabajar o realizar un análisis con el
reactivo del LAL, al igual que un producto, por normas de Buenas Prácticas de Laboratorio, se debe
realizar una validación al año.
Para llevar acabo la validación del operario, inicialmente se debe conocer el certificado de análisis
del CSE, el numero de lote del LAL y el numero de lote de endotoxina a trabajar: Se prepara una
serie de diluciones del CSE para obtener concentraciones de 4λ, 2λ, 1λ, 0.5λ, 0.25λ, donde lambda
(λ) es la sensibilidad marcada del reactivo LAL en unidades de endotoxina por mililitro (EU/mL), por
ejemplo el uso del LAL de 0.25UEU/mL. Se realiza la validación con las concentraciones del CSE
cuatro veces por dilución. La FDA y la USP con respecto al LAL, establecieron que la desviación
estandar, para las cuatro replicas, para un limite superior del 99%, es de 0.365, los resultados
hallados que sean inferiores a este limite de confianza estadístico, permiten considerar que la
variabilidad esta bajo control. Code of Fed Reg FDA (1994)

PRIMAS

Por ultimo determinar el promedio geométrico, el cual dará la concentración de punto final de la
sensitividad, aplicando la siguiente formula:
Concentración de punto final de la medios geométrica= Antilog Ee/f, donde Ee es la suma de las
concentraciones del punto final en Log, de la serie de diluciones usadas y f es el numero de replicas,
el valor de la sensitividad debe estar en el rango de 0.5 λ-2 λ, puesto que el error del método es de
+/- una dilución. Según Agudelo (1999)
En el método de gel-clot, el punto final es la más grande dilución en una serie geométrica, la cual
permite dar una reacción positiva después de una hora de incubación a 37°C. Un test es positivo,
cuando el tubo presenta un gel firme, el cual se obtiene a través de la inversión, un test negativo es
registrado cuando la mezcla del reactivo y la muestra permanece líquida. Ver figura 9

Figura 9. Formación del coagulo
Foto tomada de: www.criver.com/endosafe/techocs/whoweare.html

2.6.3 Validación de la Sensibilidad

PRIMAS

Para comprobar que no hay variabilidad en el reactivo del LAL, esta debe realizarse cada vez que se
trabaja con un lote nuevo del LAL, y se utiliza para confirmar el Rotulo del LAL. Para llevar acabo
esta validación se debe conocer el certificado de análisis del CSE, el número de lote del LAL y su
sensitividad a analizar: se prepara una serie de diluciones a partir del CSE para obtener
concentraciones finales de 2 λ, 1 λ, 0.5 λ, 0.25 λ donde lambda (λ) es la sensitividad marcada por el
reactivo LAL en UE/mL. Se adiciona el reactivo LAL a las concentraciones del CSE, cuatro veces por
dilución, cuando es iniciado un lote nuevo, o en el caso de trabajo de rutina dos veces por dilución.
Se determina la desviación estándar y el promedio geométrico, el cual nos dará el grado de
variabilidad y la concentración del punto final de la sensitividad, el cual debe estar en el rango de 0.5
λ-2 λ. Según Agudelo (1999)
2.6.4 Limites de endotoxina permitidos en la administración de drogas para la prueba del
LAL
Como resultados de los estudios y experiencias del centro de investigación de drogas de los Estados
Unidos, el máximo aumento de endotoxina que puede ser administrado por hora a un ser vivo, sin
causar una respuesta pirogénica es de 5 UE/Kg (unidades de Endotoxina por kilogramo de peso); el
limite de endotoxina para drogas parenterales es definido con base en la dosis de administración, al
igual a K/M es igual a 5 UE/Kg de peso corporal, y M es igual a la dosis de conejo o la máxima dosis
recomendada en una hora. Los cálculos de la dosis están basados en un promedio humano de
70Kg, dando una dosis de administración total de 350UE por hora, por consiguiente la cantidad de
endotoxina permisible en un producto dado (limite de endotoxina), depende de la cantidad de
producto administrado (dosis); con base en esto se sacó un tabla con el limite de endotoxina
permitido para las drogas y productos biológicos que va cambiando a medida de nuevos estudios.
Guidande for Human and Veterinary appendix E (1991). En donde se especifican la clase de
medicamentos, dividiéndolos de la siguiente manera:

 Medicamentos Oficiales en U.S.P: Los medicamentos oficiales en la Farmacopea
Americana (U.S.P.) incluyen el limite de Endotoxina bacterianas, por lo cual solo es necesario
multiplicar el limite reportado en unidades de Endotoxina por miligramo (UE/mg) por la
concentración del producto por mililitro (mg/ml o g/ml), para así obtener la unidad oficial del
limite de Endotoxina (UE/ml).

PRIMAS

 Medicamentos No oficiales U.S.P: La determinación del limite de Endotoxina en los
medicamentos no oficiales en la farmacopea americana (U.S.P), se basa en la guía de la
Food & Drug Administration (FDA) para la validación de la prueba de Limulus Amerbocyte
Lysate, como una prueba de Endotoxina para producto final de drogas parenterales humanas
y animales, productos biológicos y dispositivos médicos.

2.6.5 Máxima dilución valida (MDV)
Es la mayor dilución que se pueda hacer al producto y aun detectar el límite de endotoxina con el
método del LAL, por lo general, los productos son validados en diferentes diluciones inferiores a la
máxima dosis valida permitida (MDV), donde hay eliminación de componentes inhibitorios, cuando es
superior a las diluciones permitidas por MDV. Para realizar el cálculo de la Máxima Dilución Valida se
hace referencia al límite de endotoxina permitido por la USP del producto a analizar, se revisa la
presentación del producto y referencia el límite de sensitividad del LAL de trabajo. Se debe tener en
cuenta que si el limite se expresa en unidades de volumen, caso de la potencia dada en
concentración del producto, esta debe ser incluida en la ecuación, por lo tanto, se debe aplicar la
siguiente formula:
MDV= Limite de Endotoxina
Sensibilidad del LAL

Si no se encuentra referenciado el limite de endotoxina del producto a validar por el método de gel-
clot, en la guía de la USPXXVII, se emplea la formula K/M. Según Pharmacopoeia council of Europe
(1997)

2.6.6 Validación de la inhibición y desencadenamiento (realce) del producto al LAL
El objetivo es mostrar que la detección de la endotoxina no es afectada por el producto, para ello si
el producto lo amerita, se realiza los dos métodos que siguen:

2.6.6.1 Ensayos preliminares
Muchos productores interfieren con el ensayo del LAL, no obstante, el ensayo LAL es tan sensible
que detecta las cantidades de endotoxinas que son de interés. El producto puede ser diluido par
PRIMAS

eliminar la interferencia siempre y cuando aun permita que la concentración crítica de endotoxinas
sea detectada. Según Associates of Cape Cod Inc (1997) y Cooper (1998)

Hay obviamente un limite al cual cada producto puede ser diluido, y este limite es la Máxima Dilución
Valida (MDV). Otra forma de expresar el mismo principio es establecer que el producto no puede
diluirse más allá de una Mínima Concentración Valida (MCV), es decir aquella concentración mínima
de producto que puede ensayarse y aún detectar la endotoxina presente.

En este ensayo preliminar, se determina la dilución requerida de producto para superar las
interferencias.

Se realiza una serie de diluciones del producto, sin exceder la máxima dilución válida, cada dilución
será ensayada con endotoxina (Spike) y sin adición de endotoxina (Unspike), por cuadruplicado.
Según Agudelo (1999)

La concentración de Endotoxinas debe permanecer constante mientras que la concentración de
producto disminuye a medida que aumenta el factor de dilución.

La muestra Unspike no debe formar gel a menos que este contaminada de endotoxina el resultados
de la concentración sería reciproco del ultimo factor de dilución que dio positivo por la sensitividad
del LAL de trabajo (Ej: positivo1:8, 8x0.25UE/mL=2UE/mL). Por ultimo en la muestra Spike la
muestra debe gelificar, si no lo hace significa que hay inhibición. La concentración de endotoxina
agregada siempre debe ser la misma (2 λ) de la sensibilidad del LAL que se esta trabajando
(0.25UE/mL), pero la concentración del producto disminuirá con la serie de las diluciones.

El primer tubo de las diluciones en serie de producto más endotoxina que gelifique (Spike), es la
dilución requerida de producto que supera la inhibición. Según Cooper (1998)

2.6.6.2 Test de validación de inhibición y desencadenamiento (Realce)
Se realiza cuando algún tipo de inhibición o desencadenamiento químico o físico, altera la
recuperación de endotoxina en una muestra; este test se practica cuando se ha obtenido la dilución
PRIMAS

de trabajo del producto biológico que no excede le MDV, al igual que cuando se ha realizado
procesos de extracción o neutralización de los componentes que interfieren con la prueba.
Para ello se prepara un serie de diluciones del CSE par dar concentraciones finales de 4 λ, 2 λ, 1 λ,
0.5 λ, 0.25 λ en la muestra a examinar y se compara con una misma serie de concentraciones en
agua de grado reactivo, libre de endotoxinas. De acuerdo a la experiencia del analista del LAL y de
la documentación del producto, se inicia con una concentración de 4λ en la muestra a examinar, se
realiza igualmente el test con el CSE cuatro veces por dilución, determinando la desviación estándar
y el valor de la sensibilidad de trabajo, comparada con los parámetros establecidos. Según Agudelo
(1999).
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
3.1 Formulación del Problema

La necesidad de tener en el mercado productos inyectables libres de moléculas como endotoxinas
bacterianas que al ser inyectadas en el humano producen una reacción inmunitaria como lo es la
fiebre, hace que laboratorios de control de calidad como lo es QUASFAR M&F, brinden a sus
clientes técnicas rápidas y confiables para la detección de esta clase de moléculas ya que es de gran
relevancia evitar que productos farmacéuticos inyectables salgan al mercado sin cumplir con los
parámetros exigidos para este tipo de productos como en nuestro caso lo es la ausencia de
endotoxinas bacterianas.
3.2 Preguntas de Investigación
Para esta investigación se trabajo en dos productos inyectables específicos como lo son
Clindamicina 300mg/mL y Dipirona 2.5g/5mL, las preguntas que nos enfocaron hacia la indagación
fueron:
 ¿Cual es el límite de endotoxina que se establece para clindamicina y dipirona en la
reglamentación oficial?
 ¿Se puede verificar la potencia de la endotoxina que se encuentra en el certificado con ayuda
de la sensibilidad del reactivo LAL?
 ¿Cual es la máxima dilución valida (MDV) para Clindamicina y Dipirona que se pueda usar en
los ensayos preliminares?
 ¿Presentan contaminación bacteriana o agentes inhibidores los productos que se van a
validar?
PRIMAS

 ¿La dilución de Trabajo (DT) escogida para cada uno de los productos es apta para lograr la
detección de diferentes concentraciones de endotoxina?
 ¿Continua la reproducibilidad del método frente a diferentes sublotes de los productos?

3.3 Justificación de la Investigación
La calidad total es una herramienta que puede aplicarse en toda circunstancia y para cualquier
actividad humana. Todas las empresas productoras y prestadoras de servicios se benefician con la
implementación de la calidad total en sus servicios.

Un negocio dedicado a proveer servicios debe tener dentro de su organización un departamento que
se encargue de asegurar la calidad de sus servicios; y esto lo hace realizando procesos operativos
en donde se demuestra la validación y estandarización de sus procesos; de esta manera el cliente
tendrá la seguridad de que un determinado servicio tendrá la misma calidad.
De acuerdo a lo anterior, se utilizó el método de LAL por gelificación que es un método de alta
confiabilidad, fácil de usar y además rápido comparado con otros métodos de identificación
(turbidimetricos y colorimétrico); siendo también un ensayo más económico debido a que al realizar
una validación se usa menos cantidad de reactivo que en otro tipo de ensayos.
Esta investigación se realizó con el fin de validar la prueba de endotoxinas bacterianas para los
productos inyectables: Clindamicina 300mg/mL y Dipirona 2.5g/5mL mediante el método de
gelificación Lisado de Amebocitos Limulus (LAL) optimizando las técnicas analíticas en el laboratorio
farmacéutico QUASFAR M&F para garantizar la calidad de los productos.

4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Implementar y valorar la prueba de Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL) para la detección de
endotoxinas bacterianas en los productos farmacéuticos inyectables: Clindamicina 300mg/mL y
Dipirona 2.5g/5mL mediante el método de gelificación en un laboratorio de control de calidad de
productos farmacéuticos.
4.2 Objetivos Específicos
 Comprobar la efectividad del ensayo de lisado de Amebocitos de Limulus (LAL) empleado como
técnica el método de gelificación.
PRIMAS

 Validar el procedimiento realizado por los operarios con el fin de disminuir el error humano, para
obtener resultados confiables.
 Validar la sensibilidad expresada en la etiqueta del vial del Lisado de Amebocitos Limulus (LAL).
 Realizar ensayos preliminares (Unspike y Spike) de los productos terminados para comprobar la
posibilidad de contaminación o presencia de inhibidores por parte del producto.
 Establecer la Dilución de Trabajo (DT) para las pruebas de rutina realizadas en el laboratorio.
 Realizar el ensayo de validación de los productos con la dilución de trabajo escogida en los
ensayos preliminares.
 Implementar los Procedimientos Operativos Estándar con el fin de soportar la validación de la
técnica en el laboratorio farmacéutico.

5. MATERIALES Y METODOS
5.1 Muestreo
Los productos farmacéuticos inyectables a ensayar son: Dipirona 2.5g/5mL y Clindamicina
300mg/mL, proporcionados por un laboratorio reconocido de análisis de control de calidad
farmacéutico nacional, Quasfar M&F.
Las muestras a ser analizadas se tomaran por muestreo al azar. El número de lotes por producto
empleados fueron 3, y se seleccionaron teniendo en cuenta diferentes días de producción de la
empresa maquiladora.
5.2 ENSAYO DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS
5.2.1 Reactivos
 Reactivo multi dosis de L.A.L Lisado de Amibocito de Limulus (sensibilidad 0.25UE/mL).
Viales de 5 mL. Lote: T4281L, marca Charles River
 Control de endotoxina Estándar (CSE) de E. coli O55:B5, con potencia certificada de 5000
UE/5mL. Lote: EM42332, marca Charles River
 Agua certificada libre de endotoxinas para reconstitución del LAL Viales de 30 mL. Lote:
B44070, marca Charles River
 Solución Apirógena de NaOH 0.1N.
 Agua de inyección libre de pirógenos
5.2.2 Equipos

PRIMAS

 Baño Serológico marca Memmert.
 Agitador Vortex marca Termolyne
 Horno de despirogenización marca Memmert.
 Potenciómetro marca Schott
 Cronómetro
5.2.3 Materiales
 Tubos de ensayo despirogenizados de 10x75mm.
 Tubos de ensayo de 16x150mm
 Micropipeta de 10µL-100µL
 Puntas de Micropipeta incoloras de rack amarillo de 100µL estériles.
 Pipetas de 1mL,2mL,5mL y 10mL
 Pipeteador
5.2.4 Muestras
 Dipirona 2.5g/5mL
 Clindamicina 300mg/mL

5.2.4.1 Realización del Ensayo
El ensayo LAL se realiza por la adición de 0.1mL de reactivo LAL (reconstituido según indicadores
del fabricante) a 0.1 mL de la muestra en análisis en un tubo de vidrio (10x75mm) despirogenizado.
El tubo es agitado suavemente, se incuba en un baño de agua no circulante a 37°C+/- 1°C por 60
min+/-2min. Al final de este periodo de incubación, el tubo se retira del baño y se invierte en un
ángulo de 180°.
Un resultado positivo es definido como la formación de un gel firme capaz de mantener su integridad
cuando el tubo es invertido.
Un resultado negativo se caracteriza por la ausencia total de un gel o la formación de un gel viscoso,
el cual no permite su integridad cuando es invertido.
La reacción de formación del gel es delicada y si se hace un manejo inadecuado se obtiene un
resultado negativo.
El uso de controles positivos y controles negativos en agua se realizan en cada serie de ensayos
manteniendo así un adecuado control sobre las posibles variables que los afecten. También se
incluyen controles positivos de la muestra, puesto que su función es detectar inhibición de ensayo
PRIMAS

para la formación del producto. El control negativo se compone de reactivo LAL y agua estéril
apirógena (empleada para las diluciones) en partes iguales, su resultado debe ser negativo.
El control positivo difiere del control positivo de un producto, que este ultimo además de reactivo
LAL y Control de Endotoxina Estándar (CSE) contiene la Dilución de Trabajo escogida del producto.
Según Cooper (1999)
La cantidad de endotoxina presente en los controles positivos siempre es el doble de la
concentración detectada por el reactivo. Se debe obtener siempre un resultado positivo.
La endotoxina patrón empleada se maneja de acuerdo a las indicaciones del fabricante. (Ver anexo
3); al igual que para el reactivo LAL (Ver anexo 4)
Comercialmente existen reactivos LAL de diferentes sensibilidades para el método de gelificación,
0.03, 0.06, 0.125, 0.25, 0.5 UE/mL. En consecuencia el reactivo LAL, se seleccionó de acuerdo al
límite de endotoxinas establecido por la USP para cada producto.
Así para los productos a estandarizar, el reactivo LAL a emplear y los limites de endotoxina se
presentan en al tabla 3.
ESTANDARIZACIÓN DE LOS PRODUCTOS A VALIDAR

Producto Limite de Sensibilidad del Máxima dilución
Endotoxina USP LAL empleado
Dipirona 2.5g/5mL No USP 0.25UE/mL 1:170

Clindamicina
300mg/mL 0.58 UE/mg 0.25UE/mL 1:690

Tabla 3. Generalidades de los productos a validar
5.2.4.1 Preparación de las muestras
 El material de vidrio debe ser apirógeno y la preparación de las muestras se hace
asépticamente para evitar contaminación. Las condiciones recomendadas para la des
pirogenización del material de vidrio con calor seco, son temperaturas a 250°C por 30min o
180° por 3 horas, tratamientos que reducen en 3 ciclos logarítmicos la carga de endotoxinas.
En nuestro ensayo, para garantizar una correcta des pirogenización, las condiciones fueron
controladas permanentemente a 180°C por 3 horas.

PRIMAS

 Se mide pH de las muestras, este debe estar en un rango de 6.0-8.0, si no es así se procede
a ajustarlo con solución estéril apirógena de NaOH 0.1N o HCL 0.1N. Inicialmente se ajusta el
pH a una muestra pequeña (20mL), el volumen requerido de NaOH o HCL se correlaciona al
volumen total de la muestra. Una vez adicionado se toma el valor real de pH a la muestra
ajustada.
5.2.5 Procedimiento de la validación
5.2.5.1 Validación del Operario
Se Preparan muestras que contengan concentraciones conocidas de endotoxinas, mediante
diluciones a partir de 10 UE/mL del CSE para que la concentración sea de 1.0, 0.5, 0.25, 0.125, 0.06
UE/mL, se adiciona el reactivo del L.A.L, se realiza el análisis por duplicado a cada dilución, se
coloca en baño de maría a 37°Cx1h, una vez se halla completado el tiempo se realizan las lecturas
estableciendo desviación estándar y promedio geométrico para cada analista. (Ver Anexo 5).
5.2.5.2 Validación de la Sensibilidad del LAL
Se Confirma la sensibilidad expresada en el rotulo de cada lote de LAL que se va utilizar, realizando
diluciones a partir de 10UE/mL del CSE para que la concentración sea 1.0, 0.5, 0.25, 0.125, 0.06
UE/mL, se adiciona el reactivo del LAL, se realiza el análisis por duplicado a cada dilución, se
coloca en baño de maría a 37°Cx1h, una vez se halla completado el tiempo se realizan las lectura
estableciendo desviación estándar y promedio geométrico. (Ver anexo 6)
5.2.5.3 Ensayos para estimar la máxima dilución valida
Se calcula la máxima dilución valida que puede ser aplicada a cada producto terminado utilizando la
fórmula dada por el Test Guideline 1987 del LAL apéndice D, para la máxima dilución válida.
MDV = Limite de endotoxina
Sensibilidad del LAL

En la ecuación el límite de endotoxina corresponde al límite permitido por la USP. La potencia, es en
particular para cada lote de producto.
A los medicamentos no oficiales en la USP se les determina el límite de endotoxina mediante la
siguiente fórmula, basada en la guía de la FDA para la validación de la prueba de LAL, como una
prueba de endotoxinas para producto final en drogas parenterales humanas y animales, productos
biológicos y dispositivos médicos. Según Agudelo (1999)
Limite de endotoxina = K
PRIMAS

M
K= 5UE/Kg (vía intramuscular o intravenosa)

M= Dosis máxima de producto por Kg de peso por hora

5.2.5.4 Ensayos Preliminares

Inicialmente se analiza el pH del producto para evitar interferencias en la prueba, ajustándolo entre
6-8 (si es necesario). Para la realización de los ensayos preliminares de los lotes de producto
terminado se realizan las diluciones de acuerdo al calculo de la MDV por cuadruplicado con el objeto
de comprobar si hasta la mayor dilución realizada, se detecta la presencia de endotoxina y se
determina si existe alguna inhibición en su detección, para ello se realizan los ensayos con
endotoxina (Spike) y sin endotoxina (Unspike). Simultáneamente en el ensayo Spike se escoge la
dilución de trabajo para la detección de endotoxina bacteriana en el producto. Según Werner (1998).
(Ver anexos 7 y 8).
5.2.5.5 Dilución de trabajo
La dilución de trabajo se selecciona después de los ensayos preliminares con el fin de determinar
una dilución óptima para los ensayos de rutina, esto teniendo en cuenta el límite de endotoxina y la
M.D.V., esta debe ser mínimo dos veces mayor que la primera dilución en la cual la interferencia no
es evidente y no debe sobrepasar la MDV. Una vez se tenga determinada la dilución de trabajo del
producto deseada, se procede a realizar por cuadruplicado la validación de la misma, en la cual se
varía la cantidad de endotoxina (0.5, 0.25, 0.125, 0.06) y la cantidad de producto es fija, esto con el
fin de verificar la sensibilidad de la dilución de trabajo ante determinada cantidad de endotoxina.
Según Cooper (1999). (Ver anexo 9).
5.2.5.6 Tratamiento Estadístico
Se llama punto final al último punto en el cual se lee un positivo. A este punto final se le calcula el
logaritmo. Ej:
Punto Final Log punto Final
0.25 -0.602
0.5 -0.3010

Una vez se tenga los resultados logarítmicos se halla la sumatoria (Σ) y luego el promedio (X).
Σ = -0.9030

PRIMAS

X =-0.4515

Con el valor del promedio se calcula el promedio geométrico (GM) de la siguiente forma:
GM = antilog X
GM = antilog (-0.4515)
GM = 0.35

El promedio debe encontrarse entre λ /2 y 2λ, para que los resultados sean válidos.

La desviación Estándar (σn-1), también debe calcularse con base en los datos obtenidos al calcular
el logaritmo del punto final.

σ n-1= Σ x2-( Σx2) /2
n -1
Donde; n = Número de datos
X = logaritmos punto final

Donde la desviación estándar debe ser <0.365 para que los resultados sean validos. Tanto el GM
como la desviación Estándar debe cumplir los respectivos límites; si alguno de los dos no cumple la
prueba no es valida y se debe repetir o examinar las diluciones realizadas previamente. Según
Agudelo (1999).

6. RESULTADOS
6.1 Información General de los Productos.
 Producto : Dipirona 2.5g
Lote N°
Sublote 1 : EL260024
Presentación : Solución Inyectable 5 mL
pH : 6.8
 Producto : Clindamicina 300mg
PRIMAS

Lote N°
Sublote 1 : LP2501
Sublote 2 : LP2502
Sublote 3 : LP2503
Presentación : Solución Inyectable 1 mL
pH : 6.7
6.1.2. Información general de los Reactivos
Reactivo LAL : Lote N°: T4281L
: Sensibilidad 0.25 UE/mL
: Expira: 8/2006

Endotoxina : Lote N° EM42332
: Potencia 5000UE/Vial
: Expira 8/2008
Agua reactivo libre de pirógenos : Lote N° B44070
: Expira 01/2006
: Vial de 30mL

6.2 Preparación de Muestras:
Antes de la realización del ensayo se procedió a medir el pH de las muestras. Obteniéndose para la
Dipirona inyectable un valor de 6.8 y para Clindamicina inyectable un valor a 6.7, lo que indico que
las muestras se encontraban dentro del rango optimo establecido. Para cada uno de los productos
por sub lote se realizo pools de las muestras.

6.3 Validación de la técnica por el método LAL
6.3.1. Validación de Operario
Esta validación se realizo por cuadruplicado, los resultados estuvieron en los parámetros
establecidos de 0.25UE/mL para la sensibilidad.
Validación del Operario

PRIMAS

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