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Técnicas de laboratorio

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Oscar Nieto Oscar Nieto Presentation Transcript

  • I. EL PROBLEMA ANALÍTICO
    • Extracción de información para la toma de decisiones de manera fundamentada, eficaz y a tiempo.
  • No hay que pensar en muestras y analitos sino en el problema analítico en sí: - Aceptación/Rechazo de una partida de fábrica. - Decisión sobre la calidad de materias primas. - Decisión sobre una denominación de origen. - Asignación del precio final del producto. - Contaminación del entorno - Diagnóstico clínico, veterinario, etc. - ... RESULTADOS CLAROS Y CONTUNDENTES: Un buen resultado a tiempo vale más que un resultado perfecto fuera de plazo.
  • I.1. RELACIÓN “CLIENTE”-QUÍMICO ANALÍTICO Mayor independencia en la relación cliente  químico analítico  Mayor objetividad y coherencia en el planteamiento del problema
  • I.2. ETAPAS EN LA RESOLUCIÓN DE UN PROBLEMA ANALÍTICO
  • I.2.a. Identificación y confirmación de la información requerida. Relación Cliente  Químico Analítico I.2.b. Concreción de la información requerida. Exigencias en la calidad de la información: - Representatividad (exactitud, precisión,...) - Productividad (costes, rapidez, personal,...) La información analítica no es la única que resuelve el problema; ésta debe ser contrastada con fuentes procedentes de otros sectores.
    • I.2.c. Planificación de la estrategia analítica.
    • - Características de la información requerida
    • - Características del objeto o muestra y los mesurandos (analitos).
    • - Medios materiales, instrumentales y humanos.
    • Precio que está dispuesto a pagar el cliente.
    • Condicionantes:
    • - Dotación del laboratorio
    • - Información rápida o detallada, necesita tiempo para obtenerse.
    • Tratamiento de la muestra
    • - Información global o discriminada.
    • - Limitación en el precio del análisis.
    • - Estabilidad de las muestras y fácil manejo.
    • Muestras asequibles.
    • El trabajo dentro y fuera del laboratorio debe conllevar sistemas de calidad (control y evaluación).
    • I.2.d. Monitorización de los resultados generados.
    • - Evaluación de la calidad interna, validación de las propiedades analíticas y sus compromisos.
    • Validación demandada por el cliente y los datos de otros profesionales.
    • I.2.e. Acciones correctoras.
    • Pequeñas modificaciones en el procedimiento:
    • - Separación de una interferencia.
    • - Nuevos patrones de calibración.
    • - ...
    • COHERENCIA ENTRE LA INFORMACIÓN SUMINISTRADA Y LA REQUERIDA.
  • I.3. COSTE DEL ANÁLISIS No es lo mismo estimar los costes para una sola muestra que para un número determinado de ellas. La variación del coste del análisis con el número de muestras puede variar de muchas maneras.
  • I.4. EL PROCESO ANALÍTICO Etapas a seguir en el procedimiento analítico.
  • Operaciones previas a la medida del analito.
  • I.4.a. ANÁLISIS INSTRUMENTAL
  •  
  • I.4.b. AJUSTE DE LA ECUACIÓN DE LA RECTA POR EL MÉTODO DE LOS MÍNIMOS CUADRADOS. (SUMA DE LOS CUADRADOS DE LOS RESIDUOS) (I/C) (I)
  • COEFICIENTE DE CORRELACIÓN r Indica el grado de concordancia entre las variables. Pearson (calculadoras) r 2 = 0,999 hay un muy buen grado de concordancia entre las variables
  • I.4.c. ESTÁNDARES (PATRONES) EN QUÍMICA ANALÍTICA PRIMARIOS Sustancias estables, homogéneas y de gran pureza. Las disoluciones se preparan a partir de la pesada de ésta en la balanza y dilución hasta un volumen determinado. SECUNDARIOS Se utilizan porque un patrón primario de esa sustancia es inasequible o caro. Se valora frente a un patrón primario (normalización). MATERIALES DE REFERENCIA (CERTIFICADOS) Tienen una o varias de sus propiedades bien homogéneas y establecidas. Utilizadas para calibrar un instrumento o evaluar un método analítico. Pueden ser sustancias sintéticas. También existen sustancias y dispositivos que permiten la calibración de las propiedades de un instrumento (filtros para espectroscopía, circuito electrónico para voltamperometría, etc.)
  •  
    • Los espectros de masas se obtienen por conversión de los componentes de una muestra en iones gaseosos que se mueven rápidamente y se separan en función de su relación masa-carga.
    • La espectrometría de masas suministra la siguiente información:
    • - Composición cualitativa y cuantitativa de muestras complejas
    • - La estructura de una amplia variedad de especies moleculares complejas
    • - Relación isotópica de los átomos en las muestras
    • - Estructura y composición de superficies sólidas
    II ESPECTROMETRÍA DE MASAS
    • Se introduce una pequeña cantidad de muestra, del orden de 1 µmol. El sistema suele contener un medio para la volatilización de muestras sólidas o líquidas. Normalmente los sistemas de introducción de la muestra están acoplados a la salida de una columna de cromatografía de líquidos o gases.
    II.1. DESCRIPCIÓN DEL INSTRUMENTO
    • II.2.a. Fuentes de fase gaseosa
    • - Impacto de electrones
    • Un filamento caliente de W o Re emite los electrones que son acelerados por un ánodo con una diferencia de potencial de 70 V. Los electrones colisionan con las moléculas que se mueven en dirección perpendicular se produce la ionización (con carga positiva).
    II.2. FUENTES DE IONES El espectro de masas que se obtenga va a depender, fundamentalmente del método utilizado para la formación de los iones. - Ionización química El dispositivo es similar al anterior, pero la región de ionización contiene un reactivo gaseoso (metano) que colisionan con los electrones y se producen iones positivos que interaccionan con las moléculas a analizar.
    • II.2.b. Fuentes de desorción
    • Láser
    • - Bombardeo de átomos rápidos (FAB)
    • Muy adecuado para compuestos de elevado peso molecular. Las moléculas se ionizan con átomos de Xe o Ar con elevada energía (keV). Los iones positivos y negativos generados se desorben rápidamente de la muestra y ésta se calienta rápidamente, lo que reduce su fragmentación. Las partículas sólidas se encuentran en una matriz líquida (glicerol) que ayuda a reducir la energía reticular de las partículas, favoreciendo la desorción.
    • Iones Secundarios
    • Es la técnica más sensible para análisis de superficies. Se puede analizar a nivel submonocapa, en función de la profundidad, y resolución espacial. Los tres métodos están basados en el mismo principio, donde la superficie de la muestra es sometida a un bombardeo de iones de alta energía (fundamentalmente Ar + y en otras ocasiones Ga + ), lo que genera la expulsión de partículas positivas (que son las que normalmente se analizan), negativas y neutras.
    • II.2.c. Plasma acoplado inductivamente (ICP)
    • Flujo de Ar de 1 a 17 L/min.
    • Tres tubos concéntricos de cuarzo: el interior aspira la muestra, el intermedio genera el plasma y por el más exterior fluye el Ar de forma tangencial para enfriar y estabilizar el plasma.
    • Bobina de inducción de Cu (2 - 3 kW; 27,1 MHz). Genera un campo magnético.
    • Una chispa genera electrones que interaccionan, así como también lo hace el Ar, con el campo magnético. Sus colisiones son las que producen el plasma (10.000 K)
    • II.3. ANALIZADORES DE MASA
    • II.3.a. Sector magnético (enfoque simple) y de doble enfoque
    • Se basan en la utilización de un electroimán para que el haz de iones se mueva en una trayectoria circular de 180, 90 ó 60 grados.
    • El analizador de doble enfoque lleva acoplado, además, un analizador electrostático que corrige las divergencias de la dirección en las partículas generadas en la etapa de ionización.
    • II.3.b. Filtros de masa de cuadrupolo
    • Son los de uso más frecuente. Cuatro barras cilíndricas a modo de electrodos están conectados paralelamente a los polos positivo y negativo de una corriente continua. A cada par de barras se les aplica una corriente alterna de radiofrecuencia con un desfase de 180 grados. Esto hace que se alterne un campo eléctrico positivo y uno negativo durante la trayectoria de la partícula. Si la partícula choca contra la barra negativa, se neutraliza y se elimina por la cámara de vacío. Según la intensidad del campo eléctrico, sólo unas partículas con una relación masa/carga y velocidad determinadas llegarán al detector.
    • Al variar la intensidad de los campos eléctricos y la frecuencia de la corriente alterna, se consigue separar secuencialmente las partículas que van dirigidas al detector.
    • II.3.c. Analizadores de trampa de iones
    • Se confinan las partículas durante largos períodos de tiempo por la acción de campos eléctricos y/o magnéticos.
    • Consiste en un electrodo anular al que se le aplica un potencial de radiofrecuencia y un par de electrodos colectores. Al variar el potencial de radiofrecuencia se estabiliza la órbita de unas partículas y se desestabiliza la de otras, en función de su relación m/z.
    • Las partículas que colisionan con los electrodos anulares se neutralizan.
    • Las partículas son ionizadas mediante impacto de electrones o ionización química.
    • II.3.d. Tiempo de vuelo (TOF)
    • Los iones producidos son acelerados por un impulso de campo eléctrico de 103 a 104 V.
    • Las partículas a analizar pasan por un tubo que contiene un reflector y son desviadas hacia el detector de partículas.
    • Según la relación m/z de las partículas, estás serán aceleradas a distinta velocidad y el tiempo de recorrido por el tubo será distinto.
    • Llegarán las partículas al detector separadas según su relación m/z.
    • II.3.e. Espectrometría de masas en tandem (MS/MS)
    • Sistema QqQ. Se asemeja a un sistema de separación acoplado a un sistema de detección de espectrometría de masas.
    • Consta de tres cuadrupolos donde el primero ejerce la función de separar las masas, el segundo es realmente actúa como fuente de iones y el tercero vuelve a actuar como filtro de masas.
    • Podría acoplarse a continuación un sistema TOF para alcanzar una mayor resolución en la separación y el reconocimiento de moléculas.
    • II.3.a. Multiplicadores de electrones de dínodos.
    • Cada dínodo se mantiene a un potencial más alto que el anterior. El cátodo y los sucesivos dínodos tienen superficies de Cu/Be que emiten ráfagas de electrones al ser impactados por iones o electrones de alta energía.
    • El segundo detector de la figura es un dínodo continuo de vidrio dopado con grandes cantidades de Pb. Su funcionamiento es prácticamente idéntico al anterior.
    II.3. DETECTORES
  • II.4. ESPECTROS DE MASAS
    • El espectro que se obtiene depende fundamentalmente del sistema de ionización empleado, el cual puede fragmentar en mayor o menor medida la molécula a analizar
  • III APLICACIONES
    • III.1. DETERMINACIÓN DE METALES EN OTOLITOS DE PECES
    • - Limpieza de material
    • Lavado con ácido nítrico diluido. Se puede calentar hasta un tiempo de 24 horas.
    • Aclarados con agua ultrapura (18,2 M Ω)
    • Preparación de la muestra
    • Sumergir el otolito en agua ultrapura para reblandecer tejidos orgánicos.
    • Eliminar la mayor parte de dichos tejidos con pinzas y el resto agitando los otolitos en una disolución de H 2 O 2 al 3%.
    • Limpieza posterior con ácido nítrico para eliminar la contaminación exterior de la muestra.
    • Análisis por ICP/MS
    • Componentes mayoritarios (Ca, Sr) por calibración interna y elementos minoritarios (Zn, Co, Mn) por adición de estándar.
    • Materiales de referencia NIST 915a (calcium carbonate clinical standard)
  • III.2. DETERMINACIÓN DE ISÓTOPOS ESTABLES EN OTOLITOS
    • Consiste en un análisis de los isótopos de 13 C y 18 O así como la proporción de éstos con respecto a sus isótopos más estables.
    46 ppb 49 18 O 13 C 18 O 16.7 ppb 48 17 O 13 C 18 O 4.1 ppm 48 18 O 12 C 18 O 1.5 ppb 47 17 O 13 C 17 O 1.5 ppm 47 17 O 12 C 18 O 45 ppm 47 18 O 13 C 16 O 135 ppb 46 17 O 12 C 17 O 8.19 ppm 46 17 O 13 C 16 O 0.40% 46 18 O 12 C 16 O 730 ppm 45 17 O 12 C 16 O 1.10% 45 16 O 13 C 16 O 98.40% 44 16 O 12 C 16 O Isotopologue
  • III.3. DETERMINACIÓN DE LA DISTRIBUCIÓN DE ELEMENTOS QUÍMICOS EN ESTATOLITOS
    • El estatolito se pule en dirección en el plano sagital
    • Analyses were performed by using a 16-keV O– primary ion beam of about 10 pA, focused to a diameter of about 400 nm. This beam was rastered across a pre-sputtered area on the previously gold-coated sample. Secondary ions of 23Na+, 40Ca+ and 88Sr+ were collected simultaneously.
  • III.4. DETERMINACIÓN DE LÍPIDOS Y ÁCIDOS GRASOS
    • El tejido del que se va a hacer el análisis de estos compuestos es congelado, liofilizado y triturado previamente a la etapa de extracción.
    • Se extrajeron los compuestos de todas las muestras de tejido animal siguiendo el método modificado de Bligh & Dyer (1959) durante toda la noche con una mezcla de los disolventes metanol:cloroformo:agua (2:1:0.8 v/v/v).
    • Las fases se separaron al día siguiente mediante la adición de cloformo y agua, con una proporción final de disolventes de metanol:cloformo:agua de 1:1:0.9 (v/v/v).
    • Los lípidos se recuperan de la fase orgánico inferior (diclorometano) y a continuación se elimina el disolvente mediante vacío (rotavapor), obteniendo el extracto total que es pesado para calcular el contenido lipídico del tejido analizado (porcentaje de masa húmeda). A continuación la muestra se eluye a un volumen dado de cloroformo y almacenada a–20°C.
    Bligh EG, Dyer WJ (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol 37:911–917
    • - A una alícuota se le añade una disolución polar de hexano:éter:ácido acético (60:17:0.1 v/v/v) permite la separación previa de los triacilgliceroles, ácidos grasos libres, esteroles y fosfolípidos.
    • A una segunda alícuota se le añade una disolución no polar de hexano:éter (96:4 v/v) permite la separación del diacilgliceril éter y de los éteres de ceras.
    • Otra tercera alícuota del extracto total es transmetilada con una mezcla de metanol:ácido clorhídrico:cloroformo (10:1:1 v/v/v mixture) a 80 ºC durante dos horas para producir los metil ésteres de los ácidos grasos. A continuación se separan con la adición de agua y se extraen con una mezcla de hexano:cloroformo 4:1 (v/v), y posteriormente son sililados en N,O-bis-(trimetilsilil)- trifluoracetamida a 60°C durante una noche. Se evapora el disolvente con una corriente de nitrógeno y se reemplaza por cloroformo; así los metil ésteres de los ácidos grasos son almacenados a -20ºC.
  • IV. CALIDAD EN LA MEDIDA ANALÍTICA. IV.1. DEFINICIÓN DE LA CALIDAD La totalidad de las características de una entidad que la capacitan para satisfacer necesidades especificadas o implícitas impuestas por el “cliente” o la legislación. Indicadores de calidad: cuantitativos (numéricos), cualitativos (ej, opiniones) e integrales (cuali y cuantitativos). No basta que un alimento cumpla las especificaciones reguladas (contenido en ácidos grasos, proteínas, ausencia de aditivos, etc.) sino que su calidad tiene un importante componente subjetivo: aspecto, color, olor, sabor y otras propiedades organolépticas.
    • IV.2. CALIDAD EN QUÍMICA ANALÍTICA (interna)
    • La misma muestra analizada en distintos laboratorios no genera el mismo resultado
    • - Armonizar los métodos de análisis.
    • Implantar sistemas de calidad.
    • Dos puntos de vista:
    • - Básico: calidad de la medida.
    • Aplicado: implantación de los sistemas de calidad en los laboratorios.
    • Contribuye a lograr la calidad externa a través de la información que genera.
    • Calidad y propiedades analíticas:
    • - rapidez, bajo coste, seguridad personal,...
    • - precisión, sensibilidad, selectividad, buen muestreo,...
    • Calidad y problema analítico: Satisfacción de la necesidad informativa del “cliente”
  • IV.2.a. SISTEMAS DE CALIDAD EN LOS LABORATORIOS ANALÍTICOS. El laboratorio recibe materias: muestras, reactivos, patrones,...  Y genera un producto: información El control de calidad implica fundamentalmente un examen tanto del laboratorio como de los resultados generados. La evaluación de la calidad implica, además, la relación de lo anterior con la resolución del problema analítico.
  • Funciones del laboratorio: asegurar el cumplimiento de normas y legislación. Normas ISO (International Organization for Standarization) que elaboró la norma ISO-9000 y más específicamente para el laboratorio la Guía ISO-25 titulada “Requisitos generales para la competencia de laboratorios de calibración y ensayo”. Por otra parte, el CEN (Centro Europeo de Normalización) desarrolló para la implantación de la calidad en los laboratorios la norma EN-45000, basada en las dos anteriores. El organismo nacional de normalización en España es AENOR (Asociación Española para la Normalización) que ha traducido las normas anteriores (UNE-EN-ISO-25).
  • IV.2.b. BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO (GLP) Establecidas por la OCDE y Unión Europea, derivadas de la Guía ISO-25. Normas de obligado cumplimiento para laboratorios de análisis y evaluación de sustancias con repercusión social (alimentos). · Procedimientos Normalizadores del Trabajo (Standard Operational Procedures): descripción detallada de absolutamente todas las actividades en el laboratorio. Éstas se deben seguir al pie de la letra sin ninguna modificación. · Unidad de Garantía de Calidad: implanta la calidad, la controla y establece las acciones correctoras. Se trata de una auditoría externa que deberá ser independiente del laboratorio y responder ante el director o presidente del ente del que depende.
  • IV.2.c. METODOLOGÍAS ANALÍTICAS EN EL ÁMBITO DE LA CALIDAD PRIMARIO: Método de referencia validado internacionalmente por laboratorios de referencia o excelencia. ESTÁNDAR: Validado por organizaciones relacionadas con la normalización (ISO, CEN). OFICIAL: Publicado por agencias gubernamentales (Ministerios) con la intención de que sea el prescrito por la legislación para homologar los resultados obtenidos por los laboratorios. DE REFERENCIA: Permite contrastar la incertidumbre de otro método. Aplicable a controles de calidad. VALIDADO: Aquel que ha sido evaluado con respecto a su exactitud, precisión, sensibilidad,... así como su adecuación para su uso. La calidad de los resultados radica fundamentalmente en el calibrado riguroso y adecuado y el uso apropiado de materiales de referencia.
  • IV.3. TIPOS DE CONTROL DE CALIDAD EN QUÍMICA ANALÍTICA -Empleo de cartas de control utilizando materiales de referencia. Recomendable su empleo como “muestras ciegas” (el operador desconoce su origen). - Examen, mantenimiento y corrección de instrumentación y aparatos. - Examen de la pureza y calidad de los reactivos. - Examen del sistema de custodia de la muestra. - Examen de las condiciones ambientales del laboratorio que puedan alterar o contaminar la muestra. - Examen de los resultados al cambiar el personal o las herramientas.
    • III.4. EVALUACIÓN DE LA CALIDAD
    • Acreditación de laboratorios analíticos.
    • Reconocimiento formal y por escrito de la aptitud y competencia de un laboratorio para llevar a cabo un análisis determinado o un grupo de ellos.
    • Se realiza una auditoría externa que implica una inspección documental y visual (cualitativo). Si el informe es positivo, se emitirá el Certificado de Acreditación que pagará el laboratorio.
    • Implica un doble compromiso:
    • - Mantener los sistemas de calidad.
    • Permitir al grupo auditor realizar los controles períodicos.
    • La evaluación tiende a tener carácter integral cuando se realiza una evaluación de los resultados a través de pruebas de pericia.
  •  
  • V. BIBLIOGRAFÍA
    • Hoffmann E.C. y otros. Mass spectrometry: principles and applications. John Wiley & Sons. 2002
    • Herbert C.G., Johnstone R.A.W. Mass spectrometry basics CRC Press. 2003
    • Stoeppler M. (Ed.) Sampling and sample preparation : practical guide for analytical chemists. Springer. 1997
    • Valcárcel M. Principios de química analítica. Springer-Verlag Ibérica. 1999.
    • Book of ASTM Standards. American Chemical Society for Testing Materials. ASTM. PA. Publicación anual
    • Horwitz W. (Ed.) Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 18th. Ed. AOAC. 2006.