Presentación genómica clart papillomavirus 2 y cervista™ hpv hr

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Presentación genómica clart papillomavirus 2 y cervista™ hpv hr

  1. 1. Estudio comparativo de dostécnicas para la detección y tipificación del Virus del Papiloma HumanoGenómica Clart Papillomavirus 2 y Cervista™ HPV HR
  2. 2. EL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (HPV)De la família de los Papovirus: virus pequeños de 55nm de diámetro,sin envoltura de DNA y con una cápside icosaédrica compuesta de 72capsómeros que envuelven el genoma. Poseen doble cadena circularque puede integrarse en el material genético de las células a las queinfecta.
  3. 3. La infección por HPV puede NO SER FORMAR CONDUCIR A EVIDENTE CONDILOMAS NEOPLASIASLa infección por El cáncer de cuelloHPV no ocasiona Los HPV tipos 6 y 11 uterino está provocadoninguna reacción producen un intenso por una infeccióncelular inflamatoria ensanchamiento de la persistente del HPV deen la citología, pero zona de cornificaciónes posible que exista alto riesgo, superficial que no tienenuna reacción especialmente de los ningún potencialsimultánea de este tipos 16 y 18. precanceroso.tipo por otrasrazones.
  4. 4. Carcinogénesis controlada
  5. 5. Carcinogénesis descontrolada
  6. 6. Tipos de virus
  7. 7. Tipos de virus- La actual clasificación se basa en la comparación de lasecuencia de ADN de E6, E7 y L1 con la misma de todos losVPH conocidos. Una homología inferior al 90% supone un nuevotipo, mientras que una superior al 90%, un subtipo del tipoanteriormente descrito.
  8. 8. CAMBIOS CITOLÓGICOS ASOCIADOSLa infección por el HPV suele asociarse a los cambios oanomalías de las células escamosas de bajo grado (L-SIL): - Células escamosas maduras con forma poligonal - Núcleos aumentados 3-4 veces el tamaño del núcleo de una célula intermedia con ligera variación en tamaño y forma. - Una interpretación de LSIL/HPV requiere cavitaciones citoplasmáticas acompañadas de la morfología atípica descrita anteriormente.
  9. 9. Las células basales infectadas maduran durante su migración transepidérmica hasta formar células superficiales.En el estadio de células intermedias y superficiales son segregados fuera del núcleo productos metabólicos viralesque dañan el citoplasma, por lo que se forman halos perinucleares irregulares.
  10. 10. Protocolo de cribaje del HPVLas directrices para el diagnóstico precoz del cáncer de cuellouterino recomiendan analizar la presencia de tipos HPV de altoriesgo junto con la citología.Las recomendaciones principales de las directrices de prácticaprofesional incluyen:1) el diagnóstico precoz de mujeres de más de 30 años2) tratamiento de mujeres de más de 20 años con ASC-US.
  11. 11. CERVISTA HPV HREl Cervista TM HPV HR es una prueba de diagnóstico cualitativo in vitro para la detección de ADN de los 14 tipos de HPV de alto riesgo basada en la amplificación de señal.
  12. 12. Finalidad de la prueba1. Guiar el tratamiento de la paciente junto con la citología cervical en mujeres mayoresde 30 años.2. Determinar la necesidad de realizar una colposcopia en pacientes cuyos resultados dela prueba de Papanicolaou son células escamosas atípicas de significado indeterminado(ASC-US).
  13. 13. Principios del protocoloCervista TM HPV HR es una prueba de diagnóstico cualitativo invitro para la detección de ADN de los 14 tipos de HPV de altoriesgo, entre los que se encuentran los siguientes: 16, 18, 31, 33,35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68.La prueba utiliza la química Invader, un método de amplificaciónde señal para la detección de secuencias de ácido nucleicoespecíficas. El método usa dos reacciones isotérmicas: unareacción primaria que se realiza en la secuencia de ADN diana yuna reacción secundaria que produce una señal fluorescente.
  14. 14. Tipos de muestra La técnica de Cervista se realiza con las muestras cervicouterinas que se recogen en el vial con la solución PreservCyt, el sistema de conservación de ThinPrep para pruebas de Papanicolaou.
  15. 15. Materiales
  16. 16. Reactivos no suministrados
  17. 17. Equipos
  18. 18. Equipos
  19. 19. Equipos
  20. 20. Equipos
  21. 21. PROTOCOLO Extracción de DNA
  22. 22. Reactivos del kit Genfind
  23. 23. PROTOCOLO Reacción invader
  24. 24. Reactivos para la reacción invader
  25. 25. HPV Oligo MixTres mezclas de oligonucleótidos, que detectan los 14 tipos deHPV agrupados según tipos víricos con secuencias de ADNsemejantes concretamente en las regiones L1, E5 y E6. - HPV Oligo Mix 1: Oligonucleótidos con afinidad por los tipos HPV 51, 56 y 66 - HPV Oligo Mix 2 : Oligonucleótidos con afinidad por los tipos HPV 18, 39, 45,59 y 68 -HPV Oligo Mix 3 : Oligonucleótidos con afinidad por los tipos HPV 16, 31, 33,35, 52 y 58
  26. 26. Control interno y control negativo- Los controles internos son oligonucleótidos que se unen al genhistona humano 2 (H2be, HIST2H2BE) y producen una señalsemicualitativa del ADN genómico presente en la muestra.-El control sin molde o control negativo está compuesto portRNA de levadura.
  27. 27. Colocación de los controles positivos y negativos, y de lasmuestras, en una placa de 96 pocillos.
  28. 28. RESULTADOS Lectura de la placa
  29. 29. GENÓMICA CLART PAPILOMAVIRUS 2El kit está basado en la amplificación de fragmentos específicos del genomavírico y su posterior hibridación con sondas específicas para cada tipo de HPV.
  30. 30. Principios del protocolo- Detecta la presencia de 35 virus de HPV (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43,44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 68, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, 85 y 89)- Amplificación de un fragmento de unos 450 pb dentro de la región L1 del virus portratarse de una secuencia que está altamente conservada entre los distintos tipos deHPV- Visualización del producto amplificado por PCR mediante microarrays de bajadensidad
  31. 31. Tipos de muestra - Torundas o cepillos - Suspensiones celulares en viales de ThinPrep - Tejido fijado en formol e incluido en parafina.
  32. 32. Materiales
  33. 33. Equipos
  34. 34. Equipos
  35. 35. Equipos
  36. 36. PROTOCOLO Pretratamiento
  37. 37. Pretratamiento
  38. 38. PROTOCOLOExtracción, purificación y amplificación
  39. 39. Reactivos
  40. 40. PROTOCOLO Visualización
  41. 41. Reactivos
  42. 42. Hibridación y conjugado
  43. 43. Revelado
  44. 44. Resultados- El análisis de los microarrays se realiza de forma automatizada con SAICLART, elsoftware de procesamiento de microarrays de GENOMICA.- Se detectan e interpretan automáticamente los genotipos presentes en la imagen.- Los resultados del análisis son procesados por un lector con un software específicoque automáticamente detecta e interpreta los genotipos presentes, obteniendo uninforme de cada una de las pruebas.
  45. 45. Controles de calidadIntroducción de dos controles internos en el mismo tubo de reacción donde se analiza la muestra para eliminarfalsos negativos: - Oligos que amplifican un fragmento del gen CFTR como control del ADN de la muestra . - Oligos que amplifican un plásmido modificado como control de la reacción de amplificación.Los dos controles internos se amplifican simultáneamente junto con el HPV en un único tubo de reacción. - Oligos específicos de HPV como control de calidad de la extracción. Se añade a cada experimento uncontrol externo. La muestra debe haber sido testada anteriormente para controlar la calidad del DNA genómico,pero no necesariamente debe ser HPV positiva.
  46. 46. CASOS REALESComparación entre las dos técnicas
  47. 47. Caso 1
  48. 48. Caso 2
  49. 49. VENTAJAS EINCONVENIENTES Cervista vs. Genómica
  50. 50. CERVISTA GENÓMICA VENTAJAS - ELEVADA SENSIBILIDAD (L1, - ALTA ESPECIFICIDAD E5,E6) - DETECTA HPV DE ALTO - VALOR PREDICTICO Y BAJO RIESGO NEGATIVO 99% - PUEDE HACERSE CON - NO REACTIVIDAD CRUZADA BIOPSIAS, CON HPV BAJO RIESGO SUSPENSIONES - CONTROL HISTONA HUMANA CELULARES, TORUNDAS 2 O CEPILLOS - ALTA REPRODUCTIBILIDAD -RÁPIDAINCONVENIENTES - NO DETECTA HPV BAJO - BAJA SENSIBILIDAD RIESGO - FALSOS NEGATIVOS - REACTIVIDAD CRUZADA CON HPV RIESGO DESCONOCIDO - FALSOS NEGATIVOS POR NIVELES BAJOS DE INFECCIÓN - CASOS "BORDERLINE" - SOLO MUESTRAS THINPREP
  51. 51. CERVISTA GENÓMICA EXTRACCIÓN PERLAS MAGNÉTICAS COLUMNAMARCAJE DEL DNA REACCIÓN DE AMPLIFICACIÓN PCR QUE MARCA ELVÍRICO QUE MARCA EL DNA VÍRICO DNA VÍRICO CON CON MOLÉCULAS BIOTINA FLUORESCENTES VISUALIZACIÓN LECTOR DE FLUORESCENCIA TUBOS DE ARRAY CON SONDAS
  52. 52. OTRAS TÉCNICAS DEDETECCIÓN DEL HPV
  53. 53. -Pruebas de HPV (captura de híbridos II, PCR de consenso,Amplicor Human Papillomavirus Test)-Genotipado de HPV (genotipado con PCR de consenso,microarrays, PCR específica, genotipado con captura híbrida)- PCR a tiempo real- Transcripción de ARNm-Determinación de oncoproteínas por IHQ-Determinación de p16INK4a-Cribado con citología-Cribado con prueba de HPV
  54. 54. CONCLUSIÓN

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