Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

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Produccion de enzima amilasa microbiana m (2)

  1. 1. PRODUCCION DE ENZIMA AMILASA MICROBIANAMEDIANTE FERMENTACION EN SUSTRATO LÍQUIDOFACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA CENTRO DE INVESTIGACIONES MONTERIA – CORDOBA 2008 1
  2. 2. A. INFORMACION GENERALTítulo del proyecto Producción de enzimas amilasa microbiana, mediante fermentación en estado líquidoLíder principalresponsable del Eder Durango BallesterosproyectoMiembros e integrantes Alfonso Batista Jiménez Ibeth Cepeda Jiménez Héctor Alberto Tobón GuzmánUnidad académica Facultad de Ingeniería AgroindustrialEmpresa donde Universidad Pontificia Bolivarianarealizará el proyectoFecha de inicio Junio de 2008Fecha de finalización Junio de 2009Costo total del proyecto(incluyendo descargas – $ 21.826.281pago de personal -).Montos de contrapartida(Entidad o dependencia $ 9.427.881que cofinancia).Línea de trabajo o áreadel conocimiento en la Desarrollo de nuevos materiales y nuevascual se inscribe el aplicacionesproyecto. 2
  3. 3. B. RESUMENEl surgimiento de plantas de alcohol carburante de primera generación a partir dealmidón, en la región Caribe, implica la transformación de la materia prima porprocesos de hidrólisis mediante la acción de un complejo de amilasas capaces dedegradarlo en azucares. La implementación de hidrólisis enzimática conllevagenerar altos costos de producción, factor que genera una problemática en lasempresas de este género y a su vez en buscar soluciones para dicha temática.Este proyecto tiene el principio de desarrollar e implementar aplicacionesmicrobiológicas y biotecnológicas para la producción de un complejo de amilasamicrobial a partir de fermentación en un estado liquido, con el objeto de buscarsoluciones factibles en cuanto a la problemática planteada del proceso dehidrólisis del almidón.C. DESCRIPCION DEL PROYECTO:1. Planteamiento del problema:La tendencia actual y las altas exigencias ambientales han impulsado el desarrollode nuevas técnicas agroindustriales. Actualmente, en Colombia se plantea undéficit general en torno a la agroindustria enzimática a causa de la carencia deinvestigación, infraestructura y poca motivación para desarrollar empresas quebasen sus fundamentos en el progreso de este campo de la biotecnología. Sudesarrollo, así como el de otras áreas de la biotecnología, está afectado porproblemas como la creciente brecha científica y tecnológica con respecto a lospaíses industrializados. Según la firma internacional, Frost & Sullivan, analistasdedicados al estudio de mercados mundiales, el comercio de enzimas estaseccionado en distintos segmentos dependiendo la industria y la aplicabilidad deestas. Según el estudio, para el año 2003 se generó cerca de 142 millones dedólares solo en la industria alimenticia siendo el sector más innovador el de laingeniería genética a partir de organismos modificados, OGM. Con un 47.3%, las 3
  4. 4. enzimas destinadas al procesamiento del almidón (amilasas) y los azucarescomponen el sector mas amplio en la industria.1Esta crisis remarcada en el ficticio mercado enzimático colombiano afecta grandiversidad de industrias incluso las que están en vía de desarrollo como las dealcohol carburante de primera generación cuya materia prima para producción esel almidón, ya que para la transformación de ésta se hace necesario catalizar elpolisacárido por medio de un complejo de enzimas amilasas capaces de desdoblareste compuesto; el uso de este complejo representa el 12% del valor total deproducción de alcohol a base de esta materia prima. En la costa Caribe el empleode estas enzimas esta concretamente en el Ingenio Sicarare (Codazzi-Cesar) yen la planta piloto de CORPOICA-TURIPANA en Córdoba, lo que les incrementael valor por litro de producto dado la necesidad de importación de este complejo.Las plantas de alcohol carburante de primera generación con base en almidón seven obligadas a importar complejos de amilasas para la hidrólisis del polisacárido,lo que implica un aumento significativo en los costos de producción de lascompañías por el hecho de incurrir en gastos de importación, aranceles y demásimpuestos. Las enzimas a escala industrial, son importadas de diversos países deEuropa, Japón, Estados Unidos, Canadá y México. 2En conclusión, la creciente agroindustria de los biocombustibles de primerageneración a partir de almidón ha establecido un hecho que evidencia lanecesidad de producir complejos de amilasas para reducir costos de operación.Por lo que se plantea esta investigación para buscar alternativas de producción deenzimas amilolíticas y su aplicación en las plantas de alcohol carburante en basede almidón.1 Consultado en: < www.agrobio.org/bioboletines.php?id=34>. boletín 34 publicado en junio de 2004 [enlínea]; consultado el 09 de febrero de 2008.2 CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista debiotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 10. 4
  5. 5. 2. Impacto esperadoCon este proyecto se busca incorporar soluciones biotecnológicas para establecerun protocolo de producción de un complejo de enzimas amilasas para catálisis dealmidón. Bajo esta temática se permitirá lograr avances en términos deinvestigación en el área enzimática.La profundidad de esta investigación radica en buscar fuentes orgánicas capacesde producir complejos amilolíticos para hidrólisis del almidón con el fin de mejorarel desarrollo de este proceso.3. Marco teórico y estado del arte:3.1 AntecedentesMundialmente, la producción de enzimas esta desarrollándose aun más, bajo elprincipio de optimizar procesos y convertirlos en bioprocesos. La aplicación deesta industria gira en torno a países industrializados que tienen la capacidad deinvestigar y producir a gran escala estas proteínas, lo cual margina a paísesmenos desarrollados a causa de carencia de recursos, infraestructura y desarrolloen el campo biotecnológico. Sin embargo, esta afirmación no ha sido unimpedimento para que en diversos lugares del mundo se investigue en el área dela enzimología y el impacto que estas ocasionan en los procesos y reaccionesquímicas.Enzimas amilasas son las mas estudiantes en este campo debido a su influenciadirecta en la degradación del almidón, uno de los productos alimentarios masexplotados a nivel mundial.Obtención de amilasas fúngicas a partir de Aspergillus sp., aislado desemillas de lentejas3. Este proyecto se llevo a cabo en Bogotá - Colombia y su3 CASTRO C.; NAVAS C.; CARO O; PIÑEROS Y. Obtención de amilasas fúngicas a partir de Aspergillussp. aislado de semillas de lentejas. Consultado en pagina oficial de Universidad Jorge Tadeo Lozano, Bogotá 5
  6. 6. objetivo fue aislar microorganismos productores de amilasas para producirenzimas hidrolíticas del almidón. El agente productor detectado fue una cepa delgenero Aspergillus sp. Quien fue aislado de granos de lentejas. Estemicroorganismo fue llevado a medio de cultivo en agar YPD bajo parámetrosespecíficos de incubación. Luego de 18 días se realizo cambio de sustrato asalvado de trigo y se llevo a cabo pruebas de Lugol, medición de actividadenzimática y extracción del complejo enzimático. Los resultados indican que lasamilasas presentes en el complejo enzimático obtenido del cultivo de Aspergillussp., sobre salvado de trigo, fueron activas en el desdoblamiento de la molécula dealmidón a pH 5.0 y temperatura de 37ºC demostrando su carácter débilmenteácido y su proveniencia mesófila. El equivalente de dextrosa como medidacuantitativa de la hidrólisis del polisacárido fue de 6.5, evidenciando la capacidadenzimática amilolítica del complejo enzimático obtenido. En este trabajo seconfirmó teoría antes mencionada y la capacidad de hongos del géneroAspergillus sp., para la producción de amilasas.Producción de amilasas por medio de Aspergillus niger sumergidos encultivos de aguas de lavado de dos empresas alimentarias 4. El objeto de esteproyecto fue de analizar la producción de enzimas amilasas por cepas deAspergillus niger en aguas de lavado de industrias cerveceras y cárnicas paradeterminar la capacidad de producción de proteasas, amilasa y de depuración demedio donde crecen. La metodología aplicada se baso en la creación de un mediode cultivo de aguas de lavado con aplicación de nutrientes que mejoren laadaptación del agente. Se implementó pruebas de azucares, niveles de nitrógenoy fosforo y demanda química de oxigeno (DQO). Se analizaron los parámetros deproducción de enzima, pH, temperatura y concentración de iones. Los resultaronindican que los niveles de amilasa y proteasa obtenidos son marcadamente– Colombia. www.utadeo.edu.co. Fecha de consulta:02 de marzo de 2008.4 SALAS H, Mabel; RODRIGUEZ R, Marilu; PEREZ G., Manuel; PEREZ R, Renato. Amylase production byAspergillus niger in submerged cultivation on two wastes from food industries. 05 de marzo de 2005. Journalof Food Engineering. 6
  7. 7. dependientes de la concentración inicial de almidón en el medio de cultivo. Lasfuentes de nitrógeno (peptona, aminoácidos y extracto de levadura) fuerontotalmente influyentes en la producción de enzimas. El pH óptimo encontrado fuede 4.95 en las amilasas y la temperatura fue de 50ºC.Producción de amilasas de levaduras floculantes 5. Este proyecto desarrolladoen Pakistán se destino en la consecución de seis especies de levadurasproductoras de amilasas. Para analizar sus niveles de producción bajo el medio decultivo agar almidón y como fuente de carbono se agrego extracto de levadura,almidón y una muestra se suplemento con amilasa salival. El medio estuvocontenido de los nutrientes ideales para el crecimiento y adaptación delmicroorganismo incubado a una temperatura de 25ºC., se realizaron pruebas deproducción de enzima, degradación de sustrato, turbidimetría y velocidad decrecimiento. Del la metodología ejecutada se aislaron 3 cepas de levaduracorrectamente. El mejor resultado se obtuvo en la cepa que trabajó con salivahumana, produciendo 28 U/ml, la cual presentó una estabilidad en el rango de 25-60ºC. Los niveles de las demás cepas fueron muy inferiores al registradoanteriormente.Detergente con formulación enzimática de amilasa obtenida de Aspergillusniger. Un estudio comparativo en detergentes comerciales 6. El proyectomanifiesta una problemática de la necesidad de compuestos naturales y eficacespara la industria de detergentes. El presente articulo describe la producción,purificación y parcial caracterización de un complejo de amilasa producido por A.niger y uso potencial en formulación de detergentes. Se diseño un cultivo condistintos microorganismos a la espera de conocer el agente que mejor resultadosotorgará en cuanto a producción de amilasa se refiere. Se trabajo con medio APM5 NAHVI, Iraj; EMTIAZI, Giti . Production of " Amylase by Flocculant Yeast. Pakistan Journal of BiologicalSciences. 20036 MITIDIERI, Sydnei; SOUZA, Anne; SCHRANK, Augusto, HENNING, Marilene. Enzymatic detergentformulation containing amylase from Aspergillus niger: A comparative study with commercial detergentformulations. Bioresource technology. 19 de agosto de 2005. 7
  8. 8. usando residuos industriales de proteína de soy y almidón como fuente decarbono además de minerales. Se realizaron ensayos analíticos con pruebas deDNS, iodometría y control de los parámetros de pH y temperatura. El extractoobtenido del complejo enzimático fue comparado en tres formulacionescomerciales de detergentes para determinar su actividad de limpieza en equiposde hospitales, cirugía y endoscopia. Los resultados indicaron que elmicroorganismos con mejor performance en la producción de amilasa fue elAspergillus niger con una producción de 3.9 U/ml en medio sumergido y unaactividad excelente de degradación de en el rango de 50-55ºC y un pH de 4.0.3.2 Enzima amilasa: Acción y clasificaciónLas amilasas son enzimas las cuales hidrolizan moléculas de almidón dando comoproductos dextrinas y polímeros compuestos progresivamente por unidades deglucosa7 Esta familia de enzimas hidrolíticas esta compuesta por a proteínascatalíticas: alfa-amilasa, beta-amilasa; glucoamilasa; isoamilasa. Se encuentranampliamente distribuidas en tejidos vegetales, donde juegan un rol muyimportante en la degradación del almidón en la germinación de las semillas; entejidos animales, cumpliendo una misión digestiva; y en diversas especies demicroorganismos como hongos y bacterias8.7 ASGHER M.; JAVAID M.; RAHMAN S.U; LEGGE R.L.; A thermostable a-amylase from a moderatelythermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. 29 de marzo de 2006. Journal of Food Enginnering.P 9508 TRIPATHI Pallavi; LEGGIO, Leila; MANSFELD, Johanna; ULBRICH-HOFMANN, Renate; Kayastha, Arvind.apha- amylase of mung bean (vigna radiata) correlation of biochemical properties and terciary structurebyhomology modelling. 23 de mayo de 2007. Phytochemistry. p. 1623. 8
  9. 9. Como bien es conocido las cadenas de almidón están compuestas por dosgrandes sub-cadenas, amilosa y amilopectina. La alfa-amilasa se caracteriza poratacar los enlaces 1,4-alfa-glicosídicos en el centro de la cadena de lospolisacáridos, por lo que se la conoce como endoamilasa, produciendo glucosa,maltosa y oligosacáridos.La enzima alfa-amilasa en su accionar degrada la amilosa en maltosa ypequeños compuestos de glucosa. Sin embargo, esta enzima solo es capaz dedegradar parcialmente la amilopectina y el glucógeno debido a que no es capaz dedesdoblar los enlaces glicosidicos1-6 encontrados en los puntos de ramificaciónde la cadena del polisacárido. Por otro lado, La beta-amilasa, presente en plantasy bacterias, también cumple la función de degradar los enlaces 1,4-a-glucosídicospero comienza su acción por el extremo libre no reductor del almidón, liberandomaltosa al igual que la enzima alfa-amilasa. La hidrólisis se detiene en los puntosde ramificación de la amilopectina y el residuo se conoce como dextrina límite. Lapululanasa o isoamilasa, también perteneciente a la esta familia, hidroliza losenlaces 1,6-alfa-glicosídicos quitando las ramas de la amilopectina o las dextrinas.Si existe un acompañamiento general del complejo de las amilasas se puede 9lograr efectiva una degradación total del almidón.En cuanto a la nomenclatura de las enzimas de la familia amilasa, mundialmentese reconoce a la comisión enzimologica (E.C.) quien es el encargado de identificara todas y cada una de las enzimas existentes. Este instituto reconoce la enzimaalfa-Amilasa como E.C. 3.2.1.1. Su nombre sistemático es alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolasa. Otros nombres comunes en el comercio y el ámbito científicoson glucogenasa y endoamilasa. Estas se caracterizan en llevar a cabo la reacciónde endohidrólisis que se sitúa de los enlaces 1,4-alfa-D-glucosidicos enpolisacáridos que contienen 3 o más enlaces 1,4-alfa-D-glucosidicos. Los gruposreducidos son liberados en una configuración alfa. Este termino alfa, esta9 CARRILLO Leonor. Microbiología Agrícola. 2003.Universidad Nacional de Salta. ISBN 987-9381-16-5 9
  10. 10. relacionado con la configuración anomérica inicial de los grupos de azucaresliberados10.α-amilasa bacteriana (EC 3.2.1.1). La α-amilasa hidroliza el enlace glucosídicosinterno dando lugar a productos de bajo peso molecular, solubles y menosviscosos, cuya ruptura está limitada por la presencia de los enlaces glucosídicosa-1-6 en los puntos de ramificación de la molécula del almidón nativo(amilopectina). Los productos de hidrólisis tienen configuración a en la glucosa delextremo reductor. Se piensa que la enzima actúa por la acción combinada de losgrupos carboxilo e histidina del centro activo. Las a-amilasas obtenidas de Bacillussubtilis var amyioliqítedaciens tienen un ion calcio fuertemente ligado pormolécula, que es necesario para la actividad de! enzima y que lo estabiliza en granmedida frente a! calentamiento. Se utiliza como enzima soluble en tratamientos dedos horas a 85 °C y pH 5,5-7 como una alternativa a la utilización de ácidoclorhídrico que produce excesivos compuestos coloreados y la formación deproductos de reversión. Debido a que los almidones de patata y de cerealescerosos no pueden tratarse por gelatinización, se les somete a un proceso en dosetapas, en el que se añade una segunda dosis de enzima y se continúa ettratamiento hasta lograr el contenido deseado de glucosa 11.La enzima Beta-amilasa es reconocida en la comisión enzimológica como E.C.3.2.1.2., su nombre sistemático corresponde al de 1,4-alfa-D-glucanmaltohidrolasa. Su función es actuar en la reacción de hidrólisis de los enlacesalfa-1,4-glucosidicos del almidón con inversión en la configuración del carbono 1pasándolo de la configuración alfa a la beta; así como de remover las unidades demaltosa continuas presentes en los terminales no-reductores de la cadenapolisacárida. Los grupos sulfihidrilos son esenciales para la actividad, por lo que la10 IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en línea]. <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>.[consultado el 10 de febrero de 2008]11 WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - España. 1985. p.319 10
  11. 11. 12enzima se inactiva por oxidación, por los metales pesados y sus sales. . Suproducto es beta-maltosa.Beta-amilasa ha sido descrita como una proteína abundante la cual se puedeencontrar en grandes cantidades tanto en tejidos de almacenamiento de almidón yórganos de plantas13. Muchos Cereales contienen también la enzima beta-amilasay alfa-amilasa aunque esta ultima en concentraciones menores, tan solo ocupaaproximadamente 30% de contenido total de proteínas sintetizadas durante lagerminación. Estas dos amilasas pueden ser distinguidas una de otra, mediante elpunto de inactivación que presentan a un pH determinado. La enzima alfa-amilasaes inactivada a un pH en el rango de 4.8 - 5.0. Mientras que a este mismo rango labeta-amilasa es estable. La enzima E.C. 3.2.1.2., es inactivada en un pH alrededorde 6.0-7.0, y en caso reciproco las alfa-amilasa son estables bajo estascondiciones14.Otra enzima perteneciente a esta peculiar familia es la Glucoamilasa tambiénreconocida como amiloglucosidasa. En la nomenclatura internacional estaidentificada como E.C.3.2.1.3., y su nombre sistemático es 1,4-alfa-D-glucanoglucohidrolasa. Su función es actuar en la reacción de hidrólisis en cadenas depolisacáridos operando en los enlaces 1,4-alfa-D-glucosa que están de maneraresidual después de haberse expuesto la cadena a la acción de alfa y betaamilasa15. El principal producto final de la acción de la glucoamilasa sobre el12 CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista debiotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 11.13 OLIVEIRA Joao R; VIEIRA Adair; ZACZUK B. Priscila; CORDENUNSI Beatriz; MAINARDI Jana´ına A.;PURGATTO Eduardo; LAJOLO Franco. Beta-amylase expression and starch degradation during bananaripening. 10 de noviembre de 2005. Posthaverst Biology and Technology. p 4114 OLUSANJO A. Isaac; NGACHI A. Edith; IHUOMA O. Florence. Comparative studies on a-amylases frommalted maize (Zea mays),millet (Eleusine coracana) and Sorghum (Sorghum. 5 de mayo de 2006.Carbohyfrates Polymers. P 72.15 IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en línea]. <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>.[consultado el 10 de febrero de 2008] 11
  12. 12. almidón es glucosa, lo que la diferencia claramente de la alfa y beta amilasas. Laenzima también produce pequeñas cantidades de oligosacáridos. La sacarificacióndel almidón puede alcanzar hasta 96% de dextrosa. La acción de la enzima causainversión de la configuración, produciendo beta-glucosa. Las glucoamilasas soninactivas sobre almidón nativo. Su actividad es máxima entre pH 4 y 5.5, ytemperatura alrededor de 55-65 0C. La rata de reacción cae rápidamente amedida que disminuye el tamaño de la molécula de sustrato, siendo máxima sobrealmidones previamente sometidos a licuefacción 16.Amiloglucosidasa (EC 3.2.1.3). Las amiloglucosidasas (glucoamilasa, a-amilasa oa-1-4 glucohidrolasa) catalizan la etapa de hidrólisis de los enlaces α-1-4 delalmidón y los oligosacáridos, liberando moléculas de β-glucosa a partir delextremo no reductor de la cadena. Los enlaces ramificados α-1-4 también sehidrolizan, pero mucho mas lentamente, formándose un jarabe de glucosa, uncontenido de glucosa del 95 al 97 % en peso y de un 30 a un 5 % de oligosacá-ridos grandes. El enzima es capaz de hidrolizar también, aunque lentamente, losenlaces a-1-3. La glucosa formada se utiliza como jarabe o se cristaliza paraobtener glucosa pura sólida. La amiloglucosidasa se usa a gran escala en la in-dustria de procesado del almidón en tanques discontinuos a 55-60 °C y pH de 4,5y con períodos de incubación de 48-92 horas, para transformar las dextrinasformadas por la a-amilasa en glucosa. El calcio la estabiliza frente a la desna-turalización por el calor o los álcalis, y la hidrólisis puede llevarse a cabo fácil-mente añadiendo el enzima soluble al almidón una vez que la a-amilasa ha rea-lizado del 15 al 30 % de la hidrólisis posible 17.Una ventaja particular en el uso de enzimas en lugar de HCl para la hidrólisis delalmidón es que puede utilizarse una materia prima menos pura, ya que las16 CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista debiotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 1117 WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - España. 1985. p.320 12
  13. 13. proteínas contaminantes no se hidrolizan hasta aminoácidos, que podrían darlugar a reacciones de pardeamiento. Después de la sacarificación conamiloglucosidasa, el jarabe resultante se filtra para eliminar proteínas y grasas yse purifica con columnas de carbón activo seguido de otras con resinas deintercambio iónico.La glucoamilasa es un enzima extracelular producido por diversas especies deAspergillus o Rhizopus. La amilogluosidasa de Rhizopus puede separarse enisoenzimas con propiedades semejantes a los isoenzimas de A. niger. El enzimaes una glicoproteína que contiene mañosa, glucosa, galactosa y ácido urónico, ytiene un pH óptimo de 4,3-4,5. Una de sus desventajas es su relativa falta deactividad frente a los enlaces α-1-6, lo que hace necesario el uso de grandes dosiso de grandes períodos de incubación para lograr el grado de hidrólisis deseado.Por tanto, se ha propuesto el uso combinado de amiloglucosidasa y la enzimadesramificante pululanasa, logrando aumentos del contenido de dextrosa del 1 al 2%, a pesar de llevar a cabo la reacción a pH 5,5-6,0, en el que la amiloglucosidasaes menos activa18.El resto de la cadena del polisacárido es atacado por la enzima isoamilasa opululasa, reconocida oficialmente como E.C. 3.2.1.68. Participa en la reacción dehidrólisis de polisacáridos específicamente en los enlaces 1,6-alfa-D-glucosidicos;su nombre sistemático es glucógeno alfa-1,6-glucoanohidrolasa. Su actuar esdirectamente sobre la amilopectina, glucógeno y dextrinas, pero es incapaz dehidrolizar el pululano y las alfa-dextrinas limite. Su misión en participar en lareacción de hidrólisis de ramificación que contengan enlaces 1,6-alfa-glucosidicospor lo que también se le conoce como enzimas desramificadora. Su nombresistemático es glucógeno 1,6-alfa-D-glucanohidrolasa 19. El único producto de18 WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - España. 1985. p.32019 IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en línea]. <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>.[consultado el 10 de febrero de 2008] 13
  14. 14. reacción es maltosa. La temperatura óptima está alrededor de 45 0C y el pH entre4y53.3 Usos y aplicación de las enzimasLas enzimas vuelven los procesos eficientes y menos costosos, en muchos casos,a que tienen un alto grado de especificidad y adaptabilidad (suaves condiciones detrabajo). Además, lograr más material procesado con el mismo equipo y menosconsumo de energía también ahorra costos. Al utilizar enzimas en la industriaalimentaria nos ofrece la ventaja de: • Reducir viscosidad (hidrólisis). • Mejorar extracciones (degradación de pectina). • Hacer bioconversiones (glucosa a fructosa). • Causar separaciones (separación del suero en queso). • Sustitución de ingredientes y coadyuvantes en procesos. • Ahorro con procesos más eficientes obteniendo menos subproductos indeseados y mayor capacidad de planta con un incremento de rendimiento de producto. • Ganancia: mejora propiedades deseables obteniendo un producto único (jarabe de alta concentración de fructosa).20Las enzimas amilasas por su capacidad hidrolítica han tenido gran significancia enlas últimas décadas en diversas industrias que han visto una mejor manera deoptimizar sus procesos aplicando técnicas biotecnológica extensivas basadas enenzimas. Industrias como la panadería, repostería, alimentaria, textilera,cervecera, papel, azucarera entre muchas más han visto en estas proteínas unagran oportunidad de comercio. Las amilasas ocupan cerca de un 25% en el20 MUNDO ALIMENTARIO. Aplicación de las enzimas en la producción industrial. Consultado en:http://www.alimentariaonline.com/apadmin/img/upload/MA002_enzimas4WSF.pdf. [consultado:10 de febrerode 2008] 14
  15. 15. mercado enzimático llegando a sustituir completamente procesos de hidrolisisquímica en la industria del almidón. Esto se debe a una característica esencialdentro de esta familia de proteínas. La termoestabilidad de esta enzima,industrialmente, ha hecho que las amilasas tengan gran aplicabilidad en diversosprocesos.213.4 Procesos industriales que aplican enzimas223.4.1 Industria del almidón y del azúcar. Dependiendo de las enzimasutilizadas, a partir del almidón se pueden obtener jarabes de diferente composicióny propiedades físicas. Los jarabes se utilizan en una variedad de alimentos talescomo gaseosas, dulces, productos horneados, helados, salsas, alimentos parabebés, frutas enlatadas, conservas. Hay tres etapas básicas en la conversiónenzimática del almidón: licuefacción, sacarificación e isomerización.3.4.2 Productos Lácteos. La aplicación de enzimas en el procesamiento deleche está bien establecida, por el uso del cuajo (quimosina) en la producción dequeso, que tal vez representa el empleo más antiguo de enzimas en alimentos.Otras enzimas que participan en la producción de quesos son las lipasaspresentes en la leche, las cuales hidrolizan el componente graso, proporcionandocambios característicos en el sabor. Para algunos quesos se pueden aumentar laslipasas naturales, añadiendo enzima extra. Por otra parte, también se recomiendaagregar enzimas exógenas de tipo proteolítico para acelerar el proceso demaduración de algunos quesos.3.4.3 Molineros y Panadería. El uso de enzimas en estas industrias se debeprincipalmente a la deficiencia en el trigo y en la harina, de las enzimasnaturalmente presentes. El contenido de a amilasa de la harina depende de las21 ASGHER M.; JAVAID M.; RAHMAN S.U; LEGGE R.L.; A thermostable a-amylase from a moderatelythermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. 29 de marzo de 2006. Journal of Food Enginnering.P 950.22 CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista debiotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 13 15
  16. 16. condiciones de crecimiento y de cosecha. En climas húmedos la tendencia será atener alta actividad de a amilasa debido a germinación de los granos, en tanto queen climas secos el nivel de a amilasa será bajo debido a escasa germinación. Estoconlleva a grandes diferencias en el contenido de amilasa de diferentes lotes deharina.3.4.4 Transformación del almidón.23Los procesos encaminados a la producciónde edulcorantes están basados en la degradación del almidón y han sidoempleados durante muchos años, aunque originalmente se llevaba a cabomediante hidrólisis catalizada por ácidos. Durante el curso del desarrollo y laexpansión de la transformación industrial del almidón, se ha producido un cambiode la catálisis acida por el uso de enzimas. La elevada especificidad de estasreacciones enzimáticas, acopladas con la gran actividad de las preparacionesdisponibles, ha permitido directamente el que pueda ser incrementada y ademásla formación de derivados indeseables se ha minimizado.De todas las aplicaciones a escala industrial, la más afortunada es la producciónde jarabe de maíz con fructosa elevada (HFCS). El propósito de este proceso esobtener un material de poder edulcorante semejante a la sacarosa a partir de unamateria prima de bajo precio (almidón de maíz). Esta conversión requiere el usosecuencial de tres enzimas. En primer lugar, el almidón (un polímero de la D-glucosa) se degrada parcialmente, empleando alfa-amilasa microbial. Estematerial es degradado posteriormente para rendir una solución donde elcarbohidrato presente está en forma de D-glucosa en una concentración del 94-96%. La glucosa tiene algunas aplicaciones en las industrias de alimentación yfarmacéuticas, pero su uso está restringido debido a su solubilidad limitada aconcentraciones elevadas y a su bajo poder edulcorante comparado al de lasacarosa. Por estas razones, la glucosa total obtenida se transforma en una23 GACESA, Peter; HUBBLE, John. Tecnologia de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza-España. 1990. p.111 16
  17. 17. mezcla de glucosa y fructosa mediante el empleo de la enzima glucosaisómerasasa.3.4.5 Productoras de Jugos de Frutas.24 Las primeras enzimas empleadas enlas industrias de jugos de frutas fueron las enzimas pécticas para la clarificacióndel jugo de manzana. Actualmente las enzimas pécticas se usan en elprocesamiento de muchas otras frutas, junto con amilasas y celulasas. Durante elprocesamiento de los jugos cuando se desintegran los tejidos vegetales, parte dela pectina, que es un componente estructural de las frutas, pasa a la solución,parte se satura con el jugo y parte permanece en las paredes celulares. Lasenzimas pécticas se usan para facilitar el prensado, la extracción del jugo y laclarificación ayudando a la separación del precipitado floculante.3.4.6 Fermentación Alcohólica25 El almidón proveniente de maíz, patatas,cebada, yuca y otras fuentes debe someterse a un tratamiento previo conhidrolasas, con objeto de producir su licuación y sacarificación, antes de hacerlofermentar mediante levaduras u otros organismos para obtener alcohol utilizable.Estas enzimas son α y β amilasas y amiloglucosidasas, que pueden agregarse enforma de malta (cebada germinada), aunque este proceso es caro. La malla nosólo contiene α y β amilasas sino también enzimas que degradan los enlaces α-1-6 de las dextrinas limite. Recientemente se han añadido enzimas bacterianas parasuplementar las enzimas endógenas asociadas con el almidón. Por ejemplo, enlos procesos discontinuos americanos para la producción de alcohol para bebidas,la adición de a-amilasa bacteriana durante la cocción para hidrolizar parcialmenteel almidón gelatinizado representa una ventaja, puesto que reduce la viscosidadde la mezcla facilitando su agitación y mezclado. Posteriormente, la mezcla seenfría y después se añade a-amilasa bacteriana para continuar la hidrólisis, que se24 CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista debiotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 1425 WISEMAN, John. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza – España. 1985. p.335. 17
  18. 18. completa mediante la adición de amiloglucosidasa. Después se inoculan en lamezcla levaduras, de forma que continúe la sacarificación y fermentaciónsimultáneamente hasta el agotamiento de la dextrosa, y se destila el alcohol. Laproducción comercial de alcohol industrial, destinado a usarse como carburante enmotores de combustión interna se ha incrementado rápidamente en las últimasdécadas, particularmente en Brasil, que lo obtiene de la fermentación de !a cañade azúcar o de la yuca. También se ha propuesto el empleo de célulasinmovilizadas. Se ha obtenido etanol a partir de melazas de caña diluidas, noestériles, durante medio año.3.4.7 Industria Cervecera. La cebada se utiliza tradicionalmente para lafabricación de bebidas alcohólicas como la cerveza. En su producción se debenconsiderar dos operaciones distintas: la maltería y la cervecería. La preparaciónde la malta se logra por germinación de la cebada, durante la cual se incrementael contenido de alfa-amilasa. Las enzimas alfa y beta amilasas naturalmentepresentes en el grano actúan sobre el almidón produciendo dextrinas y maltosa,que sirven como sustratos para la fermentación posterior. La sacarosa eshidrolizada por al enzima invertasa la cual queda divida en una molécula deglucosa y una molécula de fructosa, ambas podrían ser asimiladas de formaglucolitica. También las enzimas cumplen la función de transportar la maltosa y lamaltotriosa a las células de las levaduras para posteriormente ser convertidas englucosa por la maltasa26.Otra aplicación patentada recientemente en industrias inglesas consiste en el usode la enzima α-acetolactato descarboxilasa, aislada de Enterobacter aerogenes.Esta proteína es capaza de desintegrar o eliminar el α-acetolactato y α-acetohidroxibutirato de la cerveza recién fermentada en 24 horas a 10 °C para deeste modo conseguir niveles de Diacetilo y 2,3-Pentanodiona por debajo de los26 CAMPBELL Sarah L.; The continuous brewering of beer [en línea] dsiponible en www.revistavirtualpro.com.consultado 05 de noviembre de 2007. 18
  19. 19. umbrales permitidos para productos de este tipo. Se consigue con ello grandesahorros.27Hay muchas enzimas disponibles comercialmente para el proceso cervecero, perotodas ellas caen en tres categorías: proteasas, amilasas y glucanasas. La acciónde estas enzimas durante las primeras etapas consiste en mejorar la licuefaccióndel almidón, regular el contenido de azúcar y nitrógeno, mejorar la extracción,facilitar la filtración y controlar la turbidez. En la filtración del mosto reducción delas gomas y de la viscosidad. En la ebullición, control de la turbidez, eliminaciónfinal del almidón. En esta etapa se inactivan las enzimas. Durante la fermentacióny maduración la adición de enzimas sirve para controlar la turbidez.3.4.8 Procesamiento de Carne. Las enzimas importantes para ablandar carneson proteasas de origen vegetal o de microorganismos (Bacillus subtilis yAspergillus oryzae). Las enzimas se inyectan antes del sacrificio al animal o setrata la carne con las enzimas antes de cocerla, con lo que se logra un francoablandamiento sin provocar una proteólisis importante.3.4.9 Industrias de Grasas y Aceites. 28 El uso de enzimas en las industrias deaceites y grasas es muy bajo, aunque se encuentran disponibles enzimas quepueden resolver algunos problemas, por ejemplo minimizar los subproductosindeseables. Las enzimas también se pueden usar para producir aceites y grasasnovedosas. Lipasas específicas, pueden seleccionar los ácidos grasos de algunasposiciones del triglicérido, para incorporar determinados ácidos grasos, sincambiar los de otras posiciones. De tal manera que es posible modificar porinteresterificación el contenido de ácidos grasos, o por transesterificación lograr elreordenamiento de algunos de ellos. Por ejemplo la mantequilla de cacao se27 CASTAÑE,F.X.; DAMM, S.A.. Los tanques cilindro.-conicos y el tiempo de guarda de la cervzeza. Industriacervecera. [en linea]. Disponible en www.revistavirtualpro.com. Consultado el 7 de agosto de 2007.28 CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista debiotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. p 14 19
  20. 20. requiere en la producción de chocolate y con frecuencia la disponibilidad y el costofluctúan ampliamente. Sin embargo, aceites como el de palma son baratos y seencuentra buen abastecimiento. Lo que se plantea es modificar el aceite de palmapor reacción con ácido esteárico mediante interesterificación enzimática. La grasaresultante tiene propiedades similares a la mantequilla de cacao .3.5 Producción y sustratoFuentes de enzimas. Las células microbianas son la fuente usual de enzimaspara uso industrial excepto para algunos enzimas provenientes de animales yplantas utilizados tradicionalmente como las proteasas de la papaína, ficina ybromelaina, que se utilizan para el ablandamiento de la carne, y la quimosina,empleada en la manufactura del queso. La inmensa mayoría de los enzimasmicrobianos se producen a partir de aproximadamente 25 organismos, incluyendouna docena de hongos, pero se ha calculado que sólo aproximadamente el 2 ^ode los microorganismos existentes en el mundo han sido estudiados como fuentede enzimas29.Tradicionalmente se han obtenido pocas enzimas de origen animal (lipasapancreática y tripsina) debido a que éstas pueden ser reemplazadas por otrassimilares derivadas de microorganismos. Sin embargo, los sustitutos microbianos,aunque catalíticamente eficaces, presentan sutiles diferencias en sus propiedadesque pueden ser cruciales en el proceso de su aplicación. Los recientes avances eneste campo han permitido la adaptación de las técnicas del ADN recombinantepara posibilitar que ciertos genes de mamíferos sean clonados en las bacterias olevaduras idóneas, facilitando así la producción de enzimas originariamente deanimales por medio de la tecnología convencional de la fermentación.29 WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - España. 1985.p.281 20
  21. 21. Las plantas también han sido fuente tradicional de un cierto número de enzimas. Apartir del látex producido por la papaya, higuera, piña y, en menor grado, otrasespecies se ha aislado sobre todo, cistein-proteinasas. Estas plantas tienen laventaja de que su látex es fácil de obtener, principalmente a partir de los frutos yutilizando mano de obra no cualificada.Las enzimas microbianas son más útiles que los derivados de las plantas oanimales por la gran variedad de actividades catalíticas de que disponen, y porqueusualmente pueden obtenerse en cantidades abundantes, baratos, de formaregular y de calidad uniforme, ocasionalmente mediante cultivo de superficie ousualmente mediante técnicas de fermentación aeróbica de cultivos profundos,técnica muy utilizada en la producción de antibióticos. Además los enzimasmicrobianos son en general más estables que los homólogos de las plantas oanimales, y su proceso de producción es más fácil y seguro que el seguido conplantas y animales. La manipulación genética y ambiental para incrementar elrendimiento, o la actividad enzimática de las células haciendo a éste de interésconstitutivo30. Estas técnicas son especialmente importantes en el caso de laactividad o estabilidad del enzima que sea la etapa limitante en conversionesmultienzimas, cuando haya que eliminar los controles de regulación normales enla síntesis de la enzima deseada, cuando se desea reducir o eliminar la inhibiciónpor el substrato o el producto, mecanismo este último para prevenir lasobreproducción del producto de una vía metabólica, o para obtener algunas otrascaracterísticas favorables31.Generalmente el objetivo es maximizar la velocidad de formación del enzima y laconcentración de enzima en las células o en el caldo de fermentación paraminimizar los costos de producción de la enzima. El ideal es combinar de formaóptima la cepa seleccionada de microorganismo, las condiciones de recuperación30 GACESA, Peter; HUBBLE, John; Tecnología de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza – España. 1990. p.16.31 WISEMAN, Alan; Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza – España. p.281 21
  22. 22. y fermentación y el equipo más apropiado en buenas condiciones de trabajo.Usualmente, las células crecen sumergidas, en fermentadores bien agitados yaireados, aunque un número significativo de enzimas importantes industrialmentese obtienen en fermentadores sólidos o semisólidos, entre los que se incluyen lalactasa, la a-amilasa y una proteasa de A. oryzae, la pectinasa, una proteasa deA. niger, la a-amilasa de Rhizopus, y el cuajo de Mucor pusiüus32.Las plantas superiores no son generalmente fuentes satisfactorias de enzimaspara usos clínicos e industriales, y acumulan productos de desecho en lasvacuolas. Estos compuestos son frecuentemente inhibidores enzimáticos y/o to-xinas, particularmente cuando se oxidan al contacto con el aire. Estos desechos,muchos de los cuales son fenoles, se liberan al romperse la célula, contaminandoy frecuentemente inactivando cualquier enzima extraído.Las hidrolasas son ampliamente utilizadas en los procesos industriales. Dentro deellas podemos encontrar las enzimas alfa-amilasa, beta-amilasa como las máscomunes para las síntesis del almidón produciendo productos de bajo pesomolécula. Estas enzimas son producidas, especialmente alfa-amilasa, por grandiversidad de microorganismos, Producen amilasas muchos hongos del suelo asícomo bacterias de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces entre otras.El principal genero que esta siendo tratado para la producción de dicha enzima esel bacillus. Las especies registradas como productoras de enzima en este generoson el Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, y Bacillusamyloliquefacien quienes son aplicados en procesos industriales para alimentos,textiles, fermentación, papelería entre otros 33.32 WISEMAN, John. Manual de biotecnologia de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza – España. 1985. p.28233 ZOE K, Maria. Coproduction of Alfa- amylase and beta-galatosidase by bacillus subtitulis in complex organicsubstrates.20 de diciembre de 2005. Bioresource Technology..p 150. 22
  23. 23. También otros géneros han sido reportados en proyectos de investigación. Laespecie Aspergillus produce una amplia variedad de enzimas extracelulares entrelas cuales además de estar las amilasas se puede identificar las proteasas.Aspergillus rizhopus esta identificado como un gran productor de enzimas 34.La inducción de amilasa tipo alfa requiere un sustrato que contenga enlaces alfa-1,4 glucosídicos, además de maltosa, dextrina y almidón. La Glucosa, así como esel producto final de la hidrolisis, tiene la posibilidad de reprimir la síntesis deenzima como un mecanismo conocido como represión catabolitica. Sin embargo,se ha encontrado que algunos microorganismos en distintos sustratos que tienencomo fuente de carbono a los carbohidratos no inducen la producción deamilasas35. Este hecho contrasta con los registrados en artículos de investigacióny compañías dedicadas a la producción de enzimas donde la fuente de producciónde las proteínas son microorganismos.La producción industrial ha desarrollado técnicas de aprovechamiento de recursoso residuos de producción de diversas industrias con el objeto de adquirir enzimasutilizando sustratos de bajo costo, así como los desechos agrícolas. En añosrecientes, se ha presentado un incremento en el esfuerzo y la aplicación eficientedel bagazo de caña de azúcar como medio de producción. Este es un subproductoagroindustrial de extensa cadenas celulósicas. Esta es una importante fuente decarbono que ha sido empleada en los últimos años para la producción de enzimasy a su ves la fermentación de azucares para la elaboración de etanol. Se haidentificado que el microorganismo optimo para reproducirse en este medio ysintetizar alfa-amilasa es el Bacillus subtilis36.34 SALAS H, Mabel; RODRIGUEZ R, Marilu; PEREZ G., Manuel; PEREZ R, Renato. Amylase production byAspergillus niger in submerged cultivation on two wastes from food industries. 05 de marzo de 2005. Journalof Food Engineering. p 94.35 NAHAS Ely, WALDEMARIN Mirela M.; Control of amylase production and growth characteristics ofAspergillus ochraceus . revista latinoamericana de microbiologia. Vol #1. Enero de 2002. p.536 RAJAGOPALAN Gobinath, KRISHNAN Chandraraj; a-Amylase production from catabolite derepressedBacillus subtilis KCC103 utilizing sugarcane bagasse hydrolysate 01 de junio de 2007. Bioresource 23
  24. 24. Los medios de cultivo han facilitado para los microorganismos el desarrollo deenzimas con propiedades físico-químicas muy deseables. La producción de alfa-amilasa puede darse en medio sumergido o en estado solido o por procedimientosde fermentación. La concentración de metabolitos para el crecimiento de losagentes microbiales es importante. Influye directamente la composición del medioasí como las fuentes de carbono, de nitrógeno y el contenido de salesinorgánicas37.En cuanto a términos de aplicabilidad industrial, es necesario estudiar laproducción de enzimas y analizar el factor de termoestabilidad, ya que se hademostrado que la temperatura esta ligada directamente a la velocidad dereacción de la enzima, menor viscosidad en el sustrato y disminución de lacontaminación microbiana. Los microorganismos apropiados para la producción deenzimas deben tener ciertas propiedades como rapidez de crecimiento,adaptación a nutrientes relativamente baratos y sin necesidad de inductores.Además, se debe obtener un alto rendimiento de enzima, de forma que sea fácilaislarlo, purificarlo y concentrarlo sin que se produzca la formación concomitantede metabolitos tóxicos o inmunogénicos38.También puede ser una estrategia útil la de seleccionar cepas que hiperproduzcanenzimas a partir de organismos genéticamente modificados OMG que no tengannecesidad de inductores debido a que sus centros represores están inactivos, aque tienen una baja represión por los catabolitos, a que sufren retroinhibición o aque tienen enzimas relativamente resistentes a la inhibición por el producto final.Techonology. p.237 DJEKRIF-DAKHMOUCHE S.; GHERIBI-AOULMI Z; MERAIHI Z. BENNAMOUN L..Application of astatistical design to the optimization of culture medium for a-amylase production by Aspergillus niger ATCC16404 grown on orange waste power. 11 de marzo de 2005. Journal of Food Engineering. p 19138 WISEMAN, Alan; Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia S.A. Zaragoza- España. 1985.P.271 24
  25. 25. De hecho, a pesar de los enormes avances obtenidos recientemente en el campode la ingeniería genética, las técnicas clásicas de selección de enzimas sontodavía muy productivas, particularmente cuando se estudian ambientes nuevosy/o exóticos, para buscar células microbianas que desarrollen enzimas conpropiedades exepcionales. Entre ellos destacan los enzimas clorantes obtenidos apartir de microorganismos marinos, y un enzima que produce un nuevo azúcar, laisomatulosa, de forma muy productiva a partir de una bacteria patógena delruibarbo. Muy recientemente se han hecho descubrimientos más excepcionales sicabe, por ejemplo, los microorganismos que crecen a unos 250 ºC en fuentesvolcánicas en aguas marinas profundas que poseen enzimas extremadamenteestables al calor, o un microorganismo del intestino de un gusano que perfora lamadera, que es capaz de degradar la celulosa y de fijar el nitrógeno 39.En resumen, la mayoría de los enzimas empleados comúnmente en la industriason de origen microbiano y se producen por fermentación sumergida aerobiaconvencional, que permite un mayor control de las condiciones de crecimiento quela fermentación en estado sólido. Se sabe mucho acerca de la selección de cepasde organismos y condiciones de cultivo, aunque menos sobre la regulación de lasíntesis, degradación y secreción de la enzima por el organismo productor. Estasenzimas son con frecuencia extracelulares, lo que facilita su aislamiento ypurificación.4. Objetivos4.1 General39 WISEMAN, Alan; Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia S.A. Zaragoza- España. 1985.P.272 25
  26. 26. Obtener amilasa microbiana por fermentación líquido para aplicación en procesosagroindustriales de alcohol carburante a base de almidones.4.2 Específicos• Identificar microorganismos productores de enzimas amilasa mediante técnicas de aislamiento microbiológicas• Determinar la cinética del crecimiento de los microorganismos aislados mediante fermentación en estado líquido.• Comparar la actividad del complejo enzimático obtenido con respecto a la actividad de una enzima comercial STARGEN 001.5. Metodología Propuesta:5.1 Aislamiento e identificación de los microorganismosLos microorganismos serán obtenidos de chips de yuca expuestos a la intemperiea contaminación ambiental, por un tiempo de entre 10 a 15 días. Para ello serealizaran chip con grosores comprendido entre 1 y 15 mm. Y se dispondrán enbandejas. Una vez obtenido el o los microorganismos que estén ejerciendo unproceso degradativo de los chips, se pasaran a una solución con 10% de harinade yuca, con agitación constante a 120 rpm, durante 5 días, al cabo del cual serealizaran pruebas de azucares reductores, para determinar el o losmicroorganismos con mayor capacidad de degradación, y se sembraran en mediosolido de YPS, para su purificación e identificación. 26
  27. 27. 5.2.1 Medio Sólido de YPS (Yeast Peptone Soluble starch) . 40. De acuerdo condistintos microorganismos presentes en la solución de yuca, se aislarán cada unode ellos de manera independiente y se colocaran en cajas de petri esterilizadassobre las que se servirá medio microbiológico YPS. Para descartar contaminaciónambiental, se sembraran 2 blancos con 1 ml de agua destilada estéril sobre medioel mismo cultivo.5.2.2 Medio para fermentación. Se preparan 700 ml, en un erlenmeyer de 1Litro, de medio de cultivo YPS líquido. Conteniendo en (g/l): 0.5 de extracto delevadura; KH2PO4, 10; (NH4)2SO4, 10.5; MgSO4 7H2O, 0.3; CaCl2, 0.5; FeSO47H2O, 0.013; MnSO4 7H2O, 0.004; ZnSO4 H2O, 0.004, CoCl 6H2O, 0.0067 yharina de yuca al 1 10% como fuente de carbono, se Esterilizarán a 110°C durante15 minutos y se colocarán en agitación orbital a 120 r.p.m por un periodo de 5días.El medio de cultivo para fomentación será inoculado con un complejo de dosmicroorganismos aislados, utilizando 5 ml de solución del complejo microbial.5.2.3 Cuantificación de Biomasa del complejo 41. Se hará determinación por elmétodo de peso seco y el método de proteínas.  Peso Seco. Se tomaran una muestra de 3 ml cada 3 horas durante 5 días. Las muestra de llevaran hasta peso seco constante en una estufa a 105 grados.40 ABU ,E.A. 1. ADO, S.A. JAMES, D. B.; Raw starch degrading amylase production by mixed culture ofAspergillus niger and Saccharomyces cerevisae grown on sorghum pomace. En: African Journal ofBiotechnology. Vol. 4 (8), pp. 785-790, August 2005.41 KONSOULA Zoe, LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES Maria. Co-production of a-amylase and b-galactosidase byBacillus subtilis in complex organic substrates. Bioresource Technology. 20 de diciembre de 2005. p. 152 27
  28. 28.  Determinación de proteínas42. Se tomara 3 ml de medio cada 3 horas. El proceso se llevará a cabo realizando choque térmico y centrifugado de las muestras durante 10 minutos a 5000 rpm. El sobrenadante obtenido se le determinara proteínas totales por el método de Biuret. Las muestras se leerán a una longitud de onda de 550 nm. Los datos obtenidos se compararan con una curva patrón de BSA, para determinar la concentración de proteínas presentes en la muestra.5.2.4 Medición de producto43. Se tomarán 3 ml del medio de cultivo, cada 3horas durante 5 días y se realizará prueba de azucares reductores con 3,5 acidodinitrosalicílico, las lecturas se harán a 540 nm, para glucosa y a 520 nm paramaltosa, los datos obtenidos se comparan con curvas patrones de glucosa ymaltosa respectivamente.5.2.5 Medición de sustrato44. Se tomaran 3 ml de muestra de la fermentacióncada 3 horas, a las cuales se le se agregan del reactivo yoduro-yodato y serealizaran lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 620 nm. Los datosse compararan con la curva estándar preparada con harina de yuca paradeterminar la concentración presente de sustrato en la muestra.5.2.6 Curva de Calibración para proteína. Se harán determinaciones deproteínas partiendo de una proteína conocida (Albúmina del suero Bovino o BSAde Sigma). Para ello se preparara una solución estándar de BSA al 0,5 % y sediluirán como se muestra en la Tabla 3.42 SHEWALE Satish D.; PANDIT Aniruddha B. Hydrolysis of soluble starch using Bacillus licheniformis a-amylase immobilized on superporous CELBEADS. 28 de febrero de 2007. p. 99843 ASGHER M., JAVAID M. A thermostable a-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strainfor starch processing. Jornal Of Food Engineering. 29 de marzo de 2006. p.95144 CHERRY H.M.; HOSSAIN Towhid; ANWAR M.N. Extracellular Glucoamylase from the Isolate Aspergillus fumigates.Pakistan Journal of Biological Sciences. 2004. p. 1989. 28
  29. 29. Tabla 3. Diluciones para la construcción de la curva de calibración para Biuret. Tubos 1 2 3 4 5 6 Solución (ml) Biuret 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 Solución Estándar BSA 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 H2O 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0Se mezcla bien, y se deja reposar por 30 minutos, para leer en el a una λ. = 550nm5.2.7 Curva de Calibración para Maltosa y Glucosa. Se establecerá una curvacon D-Maltosa y otra con D-glucosa, para convertir las lecturas de absorbancia delas muestras de fermentación a unidades de actividad enzimática de la amilasa,es decir, la liberación de un micromoles de azúcar reductor, calculado comomaltosa o glucosa por minuto bajo las condiciones del ensayo (ver Tabla 4).Tabla 4. Diluciones para la construcción de la curva de calibración para Maltosa. Tubos 1 2 3 4 5 6 Solución (ml) DNS 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Solución Estándar Maltosa o Glucosa al 0,5% 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 H2O 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0A las solución de D-maltosa y D-glucosa se les adicionara DNS y se pondrán enagua hirviendo por 5 minutos, se deja reposar, y se le agrega agua hastacompletar 10 ml según la tabla, las lecturas se realizaran a λ = 520 nm paramaltosa y a 540 nm para glucosaEl complejo enzimáticos obtenido en cada muestra en los diferentes días, seleerán a la misma longitud de onda que las curvas de calibración. Para ello serealizaran 3 repeticiones para cada muestra, tanto para determinar maltosas,glucosas y proteínas. 29
  30. 30. 5.2.8 Cinética del complejo enzimático. El comportamiento enzimático delcomplejo obtenido por la fermentación líquida se comparara con el complejocomercial de amilasa (stargen 001), determinando los factores que afectan laacción catalítica del complejo de amilasas, analizándolos bajo un modelosuperficie de respuesta, con diseño compuesto central: 2^3 + principal, deacuerdo con los niveles y factores mostrados en la tabla 5. Los datos obtenidos seanalizaran con el software estadístico Statgraphics versión 5.1Tabla 5. Factores y niveles para evaluar la actividad enzimática Niveles Factores Unidades Inferior Superior Dosis ml de caldo enzimático/g de pulpa base seca 0.5 1.0 pH Adimensional 4 5.5 Temperatura ºC 30.0 506. Resultados EsperadosLa base del estudio, análisis, desarrollo y aplicación de este proyecto es producirun complejo de enzimas amilasas a partir de hongos, con el objeto de determinarla aplicabilidad de dichas proteínas en los procesos agroindustriales deldepartamento. Este complejo servirá como base para la planeación de muchosprocedimientos industriales como la hidrólisis del almidón, el cual presentaelevados costos en las empresas del departamento de Córdoba, especialmenteplantas de biocarburantes.7. Estrategia Comunicación: 30
  31. 31. Los resultados de este proyecto serán editados mediante formatos de informes otrabajos de investigación en revistas y ponencias en encuentros de investigacion.Además,8. Estrategias con el medioA través de conferencias, foros y/o ponencias institucionales internas y/o externas,es un medio apto para la promulgación del objeto, método, resultados y alcancedel estudio de este proyecto. Bajo este concepto, se desea divulgar el propósito dellevar a cabo este proyecto y a su vez demostrar la realidad de los efectos quetraería consigo aplicarlo en escala industrial.9. Cronograma de actividades Tiempo MesesActividad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12Recopilación de bibliografíaTajado de chips de yuca y selecciónde lugar para contaminaciónmicrobialAislamiento e Identificación demicroorganismosPreparación de los medios decultivo solido y liquidoMuestreo y análisis del medioEstudio de la cinéticaComparación de cinética conSTARGEN 001Interpretación de los resultadosPublicación de informe final 31
  32. 32. 10. Bibliografía• ABU, E.A. 1. ADO, S.A. JAMES, D. B.; Raw starch degrading amylase production by mixed culture of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae grown on sorghum pomace. En: African Journal of Biotechnology. Vol. 4 (8), pp. 785-790, August 2005• ASGHER M.; JAVAID M.; RAHMAN S.U; LEGGE R.L.; A thermostable a- amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. 29 de marzo de 2006. Journal of Food Engineering.• CAMPBELL Sarah L.; The continuous brewering of beer [en línea] dsiponible en www.revistavirtualpro.com. consultado 05 de noviembre de 2007.• CARRERA, Jorge; producción y aplicación de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial.• CASTAÑE,F.X.; DAMM, S.A. Los tanques cilindro-cónicos y el tiempo de guarda de la cerveza. Industria cervecera. [en linea]. Disponible en www.revistavirtualpro.com. Consultado el 7 de agosto de 2007.• CASTRO C.; NAVAS C.; CARO O; PIÑEROS Y. Obtención de amilasas fúngicas a partir de Aspergillus sp. aislado de semillas de lentejas. Consultado en pagina oficial de Universidad Jorge Tadeo Lozano, Bogotá – Colombia. www.utadeo.edu.co. Fecha de consulta:02 de marzo de 2008.• CHERRY H.M.; HOSSAIN, Towhid; ANWAR M.N. Extracellular Glucoamylase from the Isolate Aspergillus fumigates. Pakistan Journal of Biological Sciences. 2004. p. 1989• DJEKRIF-DAKHMOUCHE S.; GHERIBI-AOULMI Z; MERAIHI Z. BENNAMOUN L. Application of a statistical design to the optimization of culture medium for a-amylase production by Aspergillus niger ATCC 16404 grown on orange waste power. 11 de marzo de 2005. Journal of Food Engineering. 32
  33. 33. • NAHVI, Iraj; EMTIAZI, Giti . Production of " Amylase by Flocculant Yeast. Pakistan Journal of Biological Sciences. 2003• IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en línea]. <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>. [consultado el 10 de febrero de 2008]• MISKEVICH F.; Cochran, B.; Lunday, D. Quantitative Analysis of Amylase Enzyme Kinetics. Consultado en < http://www.tamu- commerce.edu/faculty/fmiskevich/>. [consultado:01 de marzo de 2008].• MITIDIERI, Sydnei; SOUZA, Anne; SCHRANK, Augusto, HENNING, Marilene. Enzymatic detergent formulation containing amylase from Aspergillus niger: A comparative study with commercial detergent formulations. Bioresource technology. 19 de agosto de 2005.• MUNDO ALIMENTARIO. Aplicación de las enzimas en la producción industrial. Consultado en: http://www.alimentariaonline.com/apadmin/img/upload/MA002_enzimas4WSF. pdf. [consultado:10 de febrero de 2008]• OLIVEIRA Joao R; VIEIRA Adair; ZACZUK B. Priscila; CORDENUNSI Beatriz; MAINARDI Janaına A.; PURGATTO Eduardo; LAJOLO Franco. Beta-amylase expression and starch degradation during banana ripening. 10 de noviembre de 2005. Posthaverst Biology and Technology• OLUSANJO A. Isaac; NGACHI A. Edith; IHUOMA O. Florence. Comparative studies on a-amylases from malted maize (Zea mays),millet (Eleusine coracana) and Sorghum (Sorghum. 5 de mayo de 2006. Carbohyfrates Polymers• RAJAGOPALAN Gobinath, KRISHNAN Chandraraj; a-Amylase production from catabolite derepressed Bacillus subtilis KCC103 utilizing sugarcane bagasse hydrolysate 01 de junio de 2007. Bioresource Techonology.• RAMACHANDRAN Sumitra; PATEL Anil, MADHAVAN Kesavan; CHANDRAN Sandhya. Alpha Amylase from a Fungal Culture Grown on Oil Cakes and Its Properties. Brazilian archives of biology and techonology. Junio de 2004.• SALAS H, Mabel; RODRIGUEZ R, Marilu; PEREZ G., Manuel; PEREZ R, Renato. Amylase production by Aspergillus niger in submerged cultivation on 33
  34. 34. two wastes from food industries. 05 de marzo de 2005. Journal of Food Engineering.• SHEWALE Satish D.; PANDIT Aniruddha B. Hydrolysis of soluble starch using Bacillus licheniformis a-amylase immobilized on superporous CELBEADS. 28 de febrero de 2007• TRIPATHI Pallavi; LEGGIO, Leila; MANSFELD, Johanna; ULBRICH- HOFMANN, Renate; Kayastha, Arvind. Alpha- amylase of mung bean (vigna radiata) correlation of biochemical properties and terciary structureby homology modelling. 23 de mayo de 2007. Phytochemistry• WISEMAN, Alan; Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia S.A. Zaragoza- España. 1985.• ZOE K, Maria. Coproduction of Alfa- amylase and beta-galatosidase by bacillus subtitulis in complex organic substrates.20 de diciembre de 2005. Bioresource Technology11. Usuarios Directos e IndirectosEntre los interesados en los resultados de este proyecto se encuentran: • Plantas de alcohol carburante • Grupos y centros de investigaciones12. Posibles Pares Evaluadores Nombres y Cargo Institución Teléfono Apellidos 34
  35. 35. D. PresupuestoTabla 1. PRESUPUESTO GLOBAL DE LA PROPUESTA POR FUENTES DE FINANCIACION FUENTES RUBROS Facultad de Ingeniería Patrocinador TOTAL AgroindustrialPERSONAL $ 12.398.400 $ 12.398.400EQUIPO $ 1.480.000 $ 30.864.040 $ 32.344.040MATERIALES $ 2.453.841 $ 2.453.841VIAJESBIBLIOGRAFIA *SOFTWAREPUBLICACIONES*SERVICIOS TECNICOSCONSTRUCCIONESMANTENIMIENTOADMINISTRACIONOTROS*TOTAL $ 47.196.281Tabla 2. PRESUPUESTO GLOBAL DE LA PROPUESTA POR VIGENCIAS RUBROS AÑO 1 AÑO 2 AÑO 3 TOTALPERSONAL $ 12.398.400 $ 12.398.400EQUIPO $ 32.344.040 $ 32.344.040MATERIALES $ 2.453.841 $ 2.453.841VIAJESBIBLIOGRAFIASOFTWAREPUBLICACIONESSERVICIOS TECNICOSCONSTRUCCIONESMANTENIMIENTOADMINISTRACIONOTROSTOTAL $ 47.196.281 35
  36. 36. Tabla 3. DESCRIPCION DE LOS GASTOS DE PERSONAL Participante DEDICACION DEDICACION RECURSOS(en pesos colombianos) FORMACION FUNCION TOTAL Nombre HORAS No. MESES FUENTE 1 Eder Durango Ballesteros MsC. Biotecnología Investigador Principal 4. 12 Fac.de Ing. Agroindustrial $ 4.665.600 Alfonso Bautista Jiménez MsC. Microbiología Coinvestigador 2. 5 Fac. de Ing. Agroindustrial $ 972.000 Esp, Ing. DeIbeth Cepeda Jiménez alimentos. Coinvestigador 2. 5 Fac. de Ing. Agroindustrial $ 972.000Héctor Tobón Guzmán Ing. Agroindustrial Auxiliar 6. 12 Fac. de Ing. Agroindustrial $ 5.788.800TOTAL $ 12.398.400 Tabla 4. DESCRIPCION DE LOS EQUIPOS QUE PLANEA ADQUIRIR RECURSOS EQUIPO JUSTIFICACION TOTAL PatrocinadorPlancha de calentamiento marca schott - modelo slk2- con X Preparación de muestras y pruebas de análisisplaca en cerámica $ 620.000Termómetro digital Censar temperatura de las muestras X $ 863.040Espectrofotómetro Análisis y determinación de compuestos en muestra X $ 25.000.000Nevera-congelador de 9 pies Conservación de muestras X $ 700.000Cronometro digital. Cassio modelo hs-3 Control de tiempo en las pruebas X $ 81.000Agitador magnetico Homogenización y preparación de medios X $ 2.100.000Refractómetro digital portátil Medición de alcohol X $ 1.500.000TOTAL $ 30.864.040 Tabla 5. DESCRIPCION DE LOS EQUIPOS QUE PLANEA UTILIZAR UNIDAD(ES) A LA Horas de Valor EQUIPO JUSTIFICACION CUAL PERTENECE asignación al Valor total hora EL EQUIPO proyectoAgitador orbital Agitación de los medios de cultivo Lab. De biotecnología 8 $ 800.000Centrífuga eba20 Separación de sólidos Lab. De biotecnología 2 $ 280.000pHmetro Medición de ph de las muestras y soluciones Lab. De biotecnología 1 $ 150.000Balanza analitica Pesaje de reactivos para soluciones Lab. De biotecnología 2 $ 250.000TOTAL $ 1.480.000 Tabla 6. DESCRIPCIONDE LOS MATERIALES A UTILIZAR 36
  37. 37. RECURSOS TOTAL MATERIAL JUSTIFICACION Unidades Patrocinador AcadémicasErlenmeyer 250 ml Recipiente para cultivos $ 2.900,00 $ 2.900,00Erlenmeyer 600 ml Recipiente para cultivos $ 4.060,00 $ 4.060,00Erlenmeyer 1000 ml Recipiente para cultivos $ 348,00 $ 348,00Transferpipetas de 100 a 1000 Control de muestras tomadas $ 2.320,00 $ 2.320,00 Preparación de estándares para curvas $ 389.760 $ 389.760glucosa anhidra (500g) de calibración Preparación de estándares para curvas $ 121.800 $ 121.800maltosa (100g) de calibración Preparación de estándares para curvas $ 136.787 $ 136.787BSA (500G) de calibración Multiplicación y aislamiento de $ 206.480 $ 206.480agar pda microorganismosextracto de levadura (500g) Suplemento para el medio de cultivo $ 215.667 $ 215.667sulfato acido de potasio(250g) Suplemento para el medio de cultivo $ 275.500 $ 275.500sulfato de magnesio heptahidratado(500g) Suplemento para el medio de cultivo $ 313.200 $ 313.200sulfato de manganeso tetrahidratado(100g) Suplemento para el medio de cultivo $ 53.522 $ 53.522sulfato de zinc monohidratado(500g) Suplemento para el medio de cultivo $ 266.800 $ 266.800sulfato de hierro heptahidratado(500g) Suplemento para el medio de cultivo $ 232.000 $ 232.000cloruro de cobalto hexahidratado(125g) Suplemento para el medio de cultivo $ 143.376 $ 143.376sulfato de amonio(1kg) Suplemento para el medio de cultivo $ 89.320 $ 89.320TOTAL $ 2.453.841 37

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