Lerat h parthogénèse 2014

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  • 1. PATHOGENÈSE DES LÉSIONS HÉPATIQUES DU VHC : Mécanismes moléculaires Dr. Hervé LERAT, PhD. INSERM U955 Département de Virologie Moléculaire et Immunologie Physiopathologie et Thérapeutique des Hépatites Virales Chroniques (Pr. Pawlotsky) Hôpital Henri Mondor, Créteil, France.
  • 2. Pathogenèse associée au VHC Chronic viral infection Liver Tumor Host & Environmental factors Fibrosis Steatosis Diabetes Cirrhosis Viral Proteins
  • 3. Hépatocarcinomes viro-induits : rôle direct et/ou indirect des protéines virales? Infection VHC Réponse immunitaire de l’hôte Protéines virales Lésions hépatiques Cirrhose ? CANCER
  • 4. Pathologies viro-induites: contribution du virus? Contexte d’un organe entier dans un animal vivant. Nécessité de développement de modèles animaux
  • 5. Modèles animaux pour l’étude des pathologies induites par le VHC Modèles d’infection  Primates non-humains   Chimpanzé Ouistiti  Problème de disponibilité et de coût.
  • 6. core E1 E2 NS2 NS3 NS4a Promoteur Albumine p7 Modèle in vivo de souris transgéniques pour le VHC (FL-N/35) NS4b NS5a NS5b SV40 PolyA Génotype 1b micro-injections C57Bl6J x C3H/HeJ FOIE ADN HCV + X C57BL6J ou C3H ARN VHC + Lerat et al., Gastroenterology 2002 FL-N/35 FL-N
  • 7. core E1 E2 NS2 NS3 NS4a Promoteur Albumine p7 Modèle in vivo de souris transgéniques pour le VHC (FL-N/35) NS4b NS5a NS5b FL-N SV40 PolyA Génotype 1b micro-injections C57Bl6J x C3H/HeJ CHC FOIE Stéatose ADN HCV + X C57BL6J ou C3H ARN VHC + +CCl4 fibrogenèse Lerat et al., Gastroenterology 2002
  • 8. CHC induit par le VHC: Mécanismes Moléculaires? Rôle direct des protéines virales?
  • 9. Hepatocellular Carcinomas 1 cm FL-N/35-171UNC 1 cm FL-N/35-170UNC 1 cm FL-N/35-102CERFE A Lerat et al., Gastroenterology 2002.
  • 10. Inhibition de la voie apoptotique FAS dans le foie des souris VHC FasL Membrane cellulaire Fas VHC (NS5A) calpaïne mitochondrie caspase 8 Bid cytochrome C caspase 3 Etape vers le cancer APOPTOSE caspase 9 CIDE-B fragmentation ADN VHC (NS2)
  • 11. Lésions de l’ADN – La famille GADD GADD34 GADD153 GADD45a GADD45g GADD45b Senseurs de stress G0 M CyclinB1 Lésions de l’ADN GADD45β G1 G2 Cdc2 S Q VHC Histone H3 Histone H1 Lamine P P P Arrêt du cycle cellulaire (G2/M) Les protéines du VHC induisent la méthylation du promoteur de GADD45β: inhibition de sa transcription : évasion du point de contrôle.
  • 12. Effects of c-Myc over-expression G0 M Abnormal G1-S progression ROS production (reactive oxygen species) VHC G1 S c-Myc c-Myc c-Myc c-Myc Genomic instability DNA damage SSB G2 DSB Normal Cancer
  • 13.  Signalling events activating Akt – Downstream effects Human hepatoma cells Mice wt p=0.02 300 FL-N/35 p=0.02 250 Relative Akt activity (%) Relative Akt acitvity (%) 250 200 150 100 50 200 150 100 50 Hepatic lysates Primary cells p = 0,006 200 p = 0.003 100 0 0 0 300 p = 0.01 P-AKT/total AKT (EtOH = 100%) 300 Human liver 400 Huh7 Huh7 + SGR EtOH HBV + HCV + Non-tumoral tissue AKT is activated in the context of HCV infection and HCV protein expression. Higgs et al. Oncogene, 2013
  • 14. HCV infection Viral protein expression Non structural proteins NS5A GADD45b promoter Pi3K/P-AKT CH3 CH3 Bid b-catenin b-catenin Mitochondrial dysfunction Metabolic syndrome (IR,steatosis) Oxidative Stress DNA damage c-Myc promoter c-Myc c-Myc c-Myc c-Myc Defective DNA repair Gadd45b Cell cycle Blockade Stem cell recruitment Diminished apoptosis Genomic instability Evènements pro-carcinogènes Abnormal cell-cycle checkpoints Gastro 2002, 2004, 2006, 2008 JBC 2003 JBC 2009 Hepato 2009 Cancer Res 2010 J Hepatol 2012 Oncogene 2013
  • 15. Stéatose induite par le VHC: Mécanismes Moléculaires? Rôle direct des protéines virales?
  • 16. Microvesicular steatosis Non TG HCV TG HCV TG HCV TG Lerat et al., Gastroenterology 2002.
  • 17. Stéatose micro-vésiculaire coloration Oil Red O p<0.001 25 % de l’aire total 20 n=12 12.5 ± 0.4 15 10 n=10 n=12 14.4 ± 0.8 13 ± 0.8 5 M 0 n=7 14.1 ± 0.3 HCV TG NON TGM analyse in silico F
  • 18. Résumé SREBP1c SREBP1c = Domaine de transactivation (Noyau) Précurseur (RE puis Golgi) Citrate ATP-CL Stress RE Lipogenèse Acetyl-CoA ACC RE = PERK ATF6 IRE-1 Malonyl-CoA P-eiF2α Epissage ARNm XBP1 FAS Arrêt traduction Dégradation protéique Acyl-CoAs SCD1 TG Accumulation TG intracellulaires ApoB MTP VLDL Exportation TG STEATOSE HEPATIQUE
  • 19. Potential mechanisms of HCV-induced steatosis Lerat et al., Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 5(3):341-52, (2011)
  • 20. Fibrose induite par le VHC: Mécanismes Moléculaires? Rôle direct des protéines virales?
  • 21. Fibrosis is enhanced in CCl4-treated FL-N/35 mice WT FL-N/35 p<0.005* Area of fibers (%) 3.0 - CCl4 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 + CCl4 WT n FL-N/35 WT FL-N/35 5 5 13 17 - CCl4 + CCl4 *Mann-Whitney test Scale bars : 100µm.
  • 22. Fibrogenèse Lésion hépatique chronique Altération de la prolifération hépatocytaire HPC Fibrogenèse périportale Réaction Ductulaire Chouteau et al. J Hepatol. (2012)
  • 23.  HCV, liver fibrosis and regeneration: CCl4 injection (IP, 795mg/kg) FL-N/35 WT Sacrifice, liver sections, BrdU staining 0h Quiescent liver 24h / 40h Liver damage / 48h 72h 120h 60h Hepatocyte proliferation / Liver repair 0h p<0.0001 250 BrdU + hepatocytes / µm2 24h + CCl4 40h 48h 200 wt 150 FL-N35 p<0.0001 100 50 0 0h n= 60h 24h 40h 48h 60h 4/4 4/4 8/8 4/4 4/4 - CCl4 wt + CCl4 FL-N/35 The hepatocyte cell cycle is deregulated in HCV mice during liver repair.
  • 24.  HCV, liver fibrosis and regeneration: HCV infection HCV protein expression Hepatocyte cell cycle perturbation ? DNA damage Higgs et al. Cancer Research, 2010 Chouteau et al. J Hepatol 2012 Higgs et al. Oncogene, 2013
  • 25.  HCV, liver fibrosis and regeneration: HCV ROS ATM P p53 Chk 2 ATR Chk 2 P Chk 1 Chk 1 Degradation P p21 p53 cdc25a cdc25a Ub Ub Ub P Cyclin E Rb Cdk2 Rb E2F E2F S phase genes (Cyclin A) Delayed The modulation of the oxidative stress-DNA damage-cell cycle axis by HCV protein expression results in a delayed G1/S phase.
  • 26. Conclusions  Modèle reproduisant les principales pathologies induites par le VHC   Niveau d’expression similaire à l’infection chronique chez l’homme Absence de réponse immunitaire (pas d’inflammation ni de cirrhose)  La cirrhose n’est pas un pré requis au développement de CHC : en accord avec données cliniques (méta-analyse, Maisonneuve 2009)  Démonstration d’effets cytopathiques directs des protéines virales en absence de cirrhose.        Inhibition de l’apoptose (voie FAS) Inhibition de l’expression du suppresseur de tumeur GADD45β Stimulation de l’expression de l’oncogène c-myc Activation de la kinase AKT Inhibition de la sécretion des VLDL (MTP) Stimulation de la lipogenèse Fibrogenèse associée à une réaction ductulaire due à une inhibition de la prolifération hépatocytaire (ROS, lésion de l’ADN)
  • 27.  PERSPECTIVES: Co-morbidity (non-viral) factors in virally-induced HCC • Main objective: To induce liver inflammation in HCV mice. HCC incidence? MCD or DIO FLN/35 or HLE mice HCC incidence and mechanisms Mdr2 KO FLN/35 or HLE mice