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1.
STEM CELLS AND
DEVELOPMENT 15:118–123 (2006) © Mary Ann Liebert, Inc. Des nutraceutiques améliorent de manière synergique la prolifération des cellules souches humaines Paula C Bickford,1,2 Jun Tan,1 R. Douglas Shytle,1 Cyndy D. Sanberg,3 Nagwa El-Badri,1 and Paul R. Sanberg1 RESUME Une alternative viable à la transplantation de cellules souches est d’élaborer des approches qui stimulent les cellules souches endogènes pour favoriser la guérison et la médecine régénérative. Il a été montré que beaucoup de composants naturels améliorent la guérison ; cependant, les effets de ces composants sur les cellules souches n’ont pas été étudiés. Nous rapportons ici les effets de plusieurs composants naturels sur la prolifération de cellules souches de moelle osseuse humaines et de cellules CD34+ et CD133+ humaines. La formule à base de myrtille, de thé vert, de catéchine, de carnosine et de vitamine D3 a un effet, dépendant de la quantité de chaque ingrédient, sur la prolifération de cellules souches de moelle osseuse humaines par rapport au Facteur de stimulation des colonies de granulocytes et de macrophages humaines (hGM-CSF). Nous montrons ensuite que certaines combinaisons de ces nutriments produisent un effet synergique pour développer la prolifération de cellules progénitrices hématopoïétiques humaines. Ceci démontre que des nutriments peuvent agir pour encourager la guérison par une stimulation des populations de cellules souches. INTRODUCTION cellules progénitrices engagées dans le remplacement continu des cellules sanguines matures.1-3 In vitro, il a été montré que diverses L es cellules souches sont présentes dans plusieurs organes du corps humain, y compris la moelle osseuse, le sang périphérique, le sang de combinaisons de cytokines incluant les interleukine-1 (IL-1), IL-3, IL-6, des facteurs de cordon ombilical, la rate, les gencives et le cellules souches (SCF) et l’érythropoïétine (EPO) cerveau. Ces cellules progénitrices ont été étudiées supportent la croissance de cellules souches pour leur utilisation potentielle en tant que tissus progénitrices multi-potentes.4,5 Individuellement, le transplantés dans le traitement de maladies telles facteur de croissance des granulocytes (G-CSF) et que les cancers (leucémies), le diabète, les AVC, l’EPO sont des facteurs de croissance pour les les scléroses latérales amyotrophiques (SLA) et la progéniteurs dédiés respectivement aux 6 maladie de Parkinson. Cependant, peu d’efforts ont myéloblastes et aux érythroblastes. Cliniquement été directement dirigés pour considérer le G-CSF et l’EPO fournissent des traitements l’amélioration endogène de la prolifération des efficaces contre la neutropénie et l’anémie7,8 et sont cellules souches chez l’animal comme un moyen utilisés pour améliorer les progéniteurs du sang potentiel de soutien de la guérison. périphérique en tant qu’alternative à la greffe de Les cellules souches hématopoïétiques ont moelle osseuse pour des patients atteints de été étudiées pendant de nombreuses années pour cancers (leucémies). Cependant, ces traitements leur utilité dans les traitements contre certains sont coûteux et non sans risque. cancers (leucémie). Des études expérimentales Bien que des traitements potentiellement portant sur l’hématopoïèse et les approches meilleurs soient en cours de développement, peu cliniques qui pourraient corriger ses déficiences se d’études se sont penchées sur les effets de produits sont focalisées sur l’activité des cytokines. Les naturels, vitamines et autres nutriments qui cytokines modulent l’hématopoïèse en maintenant pourraient moduler l’auto-renouvellement des l’auto-renouvellement des cellules souches et en cellules souches. Cependant, ces dernières années, stimulant la prolifération et la maturation des il y a eu une recrudescence dans l’intérêt pour les 1 Center of Excellence for Aging and Brain Repair, University of South Florida College of Medicine, Tampa, FL 33612. 2 James A. Haley Veterans Administration Hospital, Tampa, FL 33612. 3 Natura Therapeutics, Inc., Tampa, FL 33618. 1
2.
STEM CELLS AND
DEVELOPMENT 15:118–123 (2006) © Mary Ann Liebert, Inc. effets de diverses déficiences alimentaires sur la d’Asie, cuites à la vapeur puis séchées. Depuis au réactivité hématopoïétique et immunitaire. L’acide moins 3000 ans, le thé vert est largement folique, la vitamine B12 et le fer ont un rôle crucial consommé au Japon, en Chine et dans d’autres dans l’érythropoïèse. Les érythroblastes requièrent pays asiatiques pour maintenir une bonne santé. de l’acide folique et de la vitamine B12 pour Récemment, les scientifiques ont commencé à proliférer durant leur différenciation. Une carence étudier ses effets bénéfiques sur la santé à travers en acide folique ou vitamine B12 inhibe les des études menées sur des animaux, en laboratoire, synthèses de la purine et de la thymidylate, ou par le biais d’observations sur l’homme. Bien détériore la synthèse de l’ADN et provoque une qu’il ait été montré que les composants actifs du apoptose des érythroblastes ; il en résulte une thé vert inhibent la croissance de lignées cellulaires anémie due à une érythropoïèse inefficace.9 tumorales, ils n’affectent pas la croissance des Récemment, d’autres études ont montré que cellules normales à des doses similaires21,22 et certains acides gras, en particulier l’acide oléique pourrait en réalité fournir une protection cellulaire et l’acide linoléique, favorisent la prolifération de contre l’âge.23 A la lumière de telles découvertes, il cellules souches hématopoïétiques10,11 et modulent semblerait que certains nutriments, vitamines et l’auto-renouvellement des cellules intestinales flavonoïdes aient un rôle important dans le épithéliales.12 maintien de l’auto-renouvellement des cellules La vitamine D a également reçu une souches et dans la stimulation de la prolifération et attention croissante ces dernières années, en partie de la différenciation de progéniteurs nécessaires au parce que de récentes études ont suggéré que près remplacement continuel de cellules matures dans le de la moitié de la population américaine souffrirait sang, le cerveau ainsi que d’autres tissus. De plus, de carences en vitamine D13. De récentes études en il serait possible d’utiliser certains produits laboratoire ont montré que la vitamine D3 a des naturels, soit seuls, soit en synergie, pour le effets impressionnant sur la prolifération de traitement de pathologies dans lesquelles un diverses formes de cellules progénitrices remplacement des cellules souches est justifié. multipotentes, et en particulier de celles jouant un Cependant, le propos de cette étude est rôle dans le système immunitaire.14 La recherche d’analyser les propriétés de divers composants sur la sénescence (la fin du cycle de la vie de naturels pour leurs capacités à stimuler la cellules qui se divisent) suggère que la carnosine, prolifération de CSH humaines. Nous avons étudié un nutriment diététique qui se trouve dans les les effets de composants naturels sur les cellules muscles et le cerveau des mammifères, aurait la souches de moelle osseuse, les CD34+ CSH et les remarquable capacité de régénérer les cellules cellules progénitrices CD133+ du sang proches de la sénescence, à restaurer une périphérique. Nous montrons pour la première fois apparence normale et à augmenter la durée de vie que certains composants naturels peuvent cellulaire.15,16 améliorer la prolifération de cellules souches D’autres études suggèrent encore qu’une hématopoïétiques, et plus spécifiquement qu’une complémentation alimentaire à base d’aliments combinaison d’extrait de myrtille, d’extrait de thé riches en antioxydants, comme les myrtilles, vert, de carnosine et de vitamine D3 montre une peuvent prévenir voire inverser les paramètres activité synergique. cellulaires et comportementaux qui déclinent avec l’âge.17,18 Par exemple, une complémentation MATERIEL ET METHODES alimentaire à base de 2 % d’extrait de myrtille produit à la fois des effets neuro-protecteur et Réactifs neuro-régénérateur chez les animaux âgés, peut- être comme résultat de la modulation des cascades Tous les composants ont été ajoutés à des de signalisation cellulaire.19 De plus, il a été montré cultures cellulaires comme cela est décrit dans la que l’extrait de myrtille améliore la neurogenèse section Résultats. Les sources des composants ont dans le cerveau de rats âgés. été comme suit : myrtille (poudre lyophilisée, Van Le thé vert est une boisson faite à partir de Drunen Farms, Momence, IL), extrait de thé vert feuilles de Camellia sinensis, un arbuste natif (Rexall), carnosine (Sigma), catechine (Sigma) et 2
3.
STEM CELLS AND
DEVELOPMENT 15:118–123 (2006) © Mary Ann Liebert, Inc. une forme active de vitamine D3 (25-hydroxy- d’aliments tels que la myrtille, le thé vert et des cholecalciferol ; Sigma). composants spécifiques incluant de la catéchine, de la carnosine et de la vitamine D3 améliore la Cultures cellulaires et test MTT prolifération de cellules souches de moelle osseuse en fonction de la dose administrée (Fig. 1). La Pour analyser la prolifération de cellules, prolifération de cellule déterminée par le test MTT des cellules souches de moelle osseuse, des est présentée comme le pourcentage de cellules CD34+ ou des cellules CD33+ prolifération des cellules pendant le contrôle, par (BioWhittaker, Inc.) ont été mises en culture sur rapport à des cellules cultivées dans les mêmes des plaques microtitres de 96 puits (5*104/puit) conditions, sans que l’on ait ajouté quelque extrait contenant 100 µl de milieu complet consistant en ou composant. Le contrôle positif effectué grâce au un milieu de RPMI-1640 complété avec 5 % de Facteur de stimulation des colonies de serum de veau foetal (SVF). Ces cellules ont été granulocytes et de macrophages humaines (hGM- traitées pendant 72h avec divers extraits dans une CSF ; Fig. 1A) a produit une prolifération de 44.5 large gamme de doses (de 8 ng/ml à 500 ng/ml) ou ± 8.1 % avec la dose la plus élevée, i.e. 100 ng/ml. avec des composants moléculaires (de 0.3125 µM La myrtille et la catéchine ont montré une à 20 µM). Cinq heures avant la fin du traitement, augmentation de la prolifération de respectivement 20 µl d’une solution MTT (MTT kit, Sigma) ont 34.5 ± 6.7 et 34.8 ± 5.2 % pour des doses de 500 été ajouté à chaque puis. Ces plaques ont ensuite ng/ml et 20 µM (Fig. 1B, C). La carnosine affiche été incubées dans un incubateur à CO2 à 37°C une augmentation de la prolifération de 26.6 ± 6.0 pendant 5h et les milieux en culture ont été % pour une dose de 20 µM (Fig. 1D) et la vitamine prélevés avec une aiguille et une seringue. Un total D3 affiche un pourcentage de prolifération plus de 200 µl de Diméthylsulfoxyde (DMSO) a été faible 14.8 ± 3.3 % à 5 µM (Fig. 1F). Le thé vert ajouté à chaque puit, en aspirant puis refoulant à produit une prolifération similaire à celle de la l’aide d’une pipette pour dissoudre les cristaux. myrtille et de la catéchine de 35.6 ± 9.2 % a 500 Ces plaques ont ensuite été remises dans ng/ml (Fig. 1E). l’incubateur à 37°C pendant 5min, puis transférées dans un lecteur de plaques. On a ensuite mesuré L’effet synergique et stimulant des extraits et des leur absorbance à 550 nM. Les données ont été composants sur la prolifération représentées comme étant le pourcentage relatif de prolifération moyenne, définie comme le nombre Pour déterminer si les extraits et les lu de cellules traitées normalisées pour contrôler composants font preuve d’un effet synergique sur les cellules (en l’absence de traitement). la prolifération des cellules, nous avons mis en culture des cellules de moelle osseuse avec RESULTATS différentes combinaisons d’extraits et de composants. Nous avons également mis en culture Stimulation de la prolifération de cellules souches des cellules de moelle osseuse avec un seul de ces de moelle osseuse en fonction de la dose extraits ou composants à la dose la plus élevée, permettant d’atteindre le plus haut taux de Plusieurs extraits d’aliments, extraits prolifération, ce qui a été représenté par les figures d’herbes et composants spécifiques ont été dépistés 1A-F. Le contrôle positif hGM-CSF affichait une individuellement pour leur activité de prolifération prolifération de 48.3 ± 7.4 %, alors que seuls, la sur les cellules souches de moelle osseuse myrtille, la catéchine, la carnosine, le thé vert et la humaines en culture. Les épinards, la spiruline, vitamine D3 n’entrainent pas une prolifération l’épigallocatéchine gallate (EGCG), l’épicatéchine, significativement différente, comme le démontre la la Withania Somnifera, le carao, le Rehmannia Fig. 1 (Fig. 2A). Cependant, il résulte de la glutinosa et l’Astragalus Membranaceus n’ont pas combinaison d’extraits et de composants un bien montré une activité élevée sur les cellules souches meilleur pourcentage d’augmentation de la de moelle osseuse en culture et n’ont pas été testés prolifération par rapport aux extraits ou par la suite. Il a été montré que certains extraits composants observés individuellement. Par 3
4.
STEM CELLS AND
DEVELOPMENT 15:118–123 (2006) © Mary Ann Liebert, Inc. exemple, myrtille/vitamine D3 montre une puisque la prolifération augmente de 83 % (Fig. augmentation de 62 % dans la prolifération, 2A). Myrtille/thé vert, myrtille/vitamine D3/thé myrtille/carnosine une augmentation de 70 % et vert et myrtille/vitamine D3/thé vert/carnosine myrtille/carnosine a le plus grand affect synergique montrent également des augmentations Fig. 1. Extraits de végétaux ou composants aux vertus nutritionnelles améliorant la prolifération de cellules de moelle osseuse en fonction de la dose. Des cellules de moelle osseuse humaines ont été mises en culture sur des plaques microtitres de 96 puits destinés à mettre en culture des tissus (5*104/puit) et traitées avec un hGM-CSF humain (A), de l’extrait de myrtille (B), de la catéchine (C), de la carnosine (D), de l’extrait de thé vert (E) et de la vitamine D3 (F) administré à différentes doses pendant 72h. Après le traitement, ces cellules ont été préparées pour une analyse MTT de prolifération de cellule comme décrit dans Matériel et Méthodes. Les données ont été représentées comme le pourcentage d’augmentation par rapport au témoin (sans aucun traitement, dans les mêmes conditions de cultures). De A à F, une analyse de variance (ANOVA) et un test post hoc montrent des différences significatives de pourcentage par rapport au témoin (±SD avec n = 3 expériences) entre des doses élevées et des doses faibles (p < 0.005). 4
5.
STEM CELLS AND
DEVELOPMENT 15:118–123 (2006) 15:118 © Mary Ann Liebert, Inc. significatives de la prolifération de respectivement 7.4 % pour le hGM-CSF, ce qui correspond à une , 56 %, 72 % et 70 % (Fig. 2A). augmentation de 5 % environ par rapport à l’effet du hGM-CSF sur les cellules souches de moelle CSF Amélioration de la prolifération des cellules osseuse (Fig. 2B). Cependant, individuellement, la individuellement CD34+ et les propriétés synergiques des extraits et myrtille, la catéchine, la carnosine, le thé vert et la des composants vitamine D3 montrent respectivement une augmentation de la prolifération de 20.9 ± 3.0, 24.8 Pour déterminer si ces extraits et ces composants ± 5.0, 11.05 ± 2.1, 14.0 ± 3.7 et 6.9 ± 2.6 %, ce qui améliorent la prolifération d’autres cellules est bien plus bas que ce qui a été observé pour les progénitrices, nous avons mis en culture des cellules de moelle osseuse (Fig. 2B). Toutefois, cellules souches hématopoïétiques humaine CD34+ lorsqu’on combine myrtille/vitamine D3, dans les mêmes conditions que les cellules de myrtille/catéchine, myrtille/carnosine, myrtille/thé moelle osseuse et en utilisant différentes vert et myrtille/vitamine D3/thé vert montre une combinaisons d’extraits et de composants, et avec augmentation de la prolifération de respectivement les plus forte doses déterminées pour une 39.3 ± 2.0, 57.3 ± 10.4, 30.9 ± 3.4, 27.9 ± 10.0 et , augmentation maximale de la prolifération des 49.9 ± 13.1 %, ce qui est au moins additif et dans cellules, comme le montre la figure 1A-F. Les certains cas, plus qu’additif par rapport aux extraits résultats ont montrés une augmentation de 48.3 ± et composants pris individuellement (Fig. 2B). Il est intéressant de remarquer que la combinaison de myrtille/vitamine D3/thé vert/carnosine montre une augmentation de 67.6 ± 11.9 % lorsqu’un simple effet additif aurait indiqué une augmentation de 52 % : il y a donc bien un effet synergique lié à cette combinaison (Fig. 2B). Amélioration de la prolifération de CD133+ et propriétés synergiques des extraits et composants Certains des composants et des combinaisons possédant le plus fort potentiel Fig. 2. L’extrait de myrtille affecte de manière synergique la prolifération des cellules dans le cas de co-traitement avec D3, CH, co D3/GT ou D3/GT/Ca. (A) Les cellules de moelle osseuse humaines ont été mises en culture sur des plaques microtitres de 96 puits destinés à mettre en culture des tissus (5*104/puit) et ont été traitées avec de l’extrait de myrtille (500 ng/ml) en présence de D3 (5 µM), CH (20 µM), Ca (20 µM), GT (500 ng/ml), D3(5 µM)/GT (500 M), ng/ml), ou D3 (5 µm)/GT (500 ng/ml)/Ca (20 µM) pendant 72h. m)/GT (B) Cellules CD34+ humaines dérivées de moelle osseuse (5*104/puit) traitées comme indiqué ci-dessus (A). Pour le test MTT, ci ces cellules ont été préparées pour l’analyse de la prolifération cellulaire. Les données ont également été représentées comme le pourcentage d’augmentation par rapport au témoin. Une ANOVA et des tests post hoc ont montré des différences significatives de différ pourcentage par rapport au témoin (±SD avec n = 3 expériences) entre les traitements individuels et certaines combinaisons, pour A, le traitement combiné BB/D3 par rapport à BB ou CH (p < 0.005), BB/CA comparé à BB ou Ca (p < 0.001), BB/D3/GT par rapport à 0.001) BB, D3 ou GT, BB/D3/GT/Ca par rapport à BB, D3, GT ou Ca ; B, le traitement combiné BB/CH par rapport à BB ou CH en traitement individuel (p < 0.005), BB/D3/GT/Ca par rapport à BB, D3, GT ou Ca (p < 0.001). 5
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DEVELOPMENT 15:118–123 (2006) © Mary Ann Liebert, Inc. d’augmentation de la prolifération sur les cellules trois types de cellules, les cellules CD133+ étant les CD34+ dérivées de la moelle osseuse ont ensuite plus sensibles puisque la réponse proliférative est été utilisés pour traiter les CD133+ (cellules deux fois plus élevées qu’avec le hGM-CSF. De progénitrices) collectées dans le sang périphérique tous les composants testés, l’extrait de myrtille est et cultivées dans les mêmes conditions que celles celui qui constamment produit la prolifération la citées précédemment. La prolifération des cellules plus significative lorsqu’il est combiné avec a été déterminée grâce à un test MTT (voir d’autres composants. Matériel et Méthodes) et est exposée comme le Il y a plusieurs mises en garde concernant pourcentage de prolifération cellulaire supérieur au l’interprétation et la portée de nos découvertes. témoin. Les résultats ont révélé une augmentation Premièrement, notre test pour la prolifération était de 21.11 ± 2.9 % après le traitement à base de seulement basé sur le test MTT, ce qui reflète hGM-CFS (Fig. 2C). Individuellement, la myrtille, l’activité de la chaine respiratoire mitochondriale. la carnosine, le thé vert et la vitamine D3 ont Bien que le test MTT soit une méthode de pointe montré respectivement une augmentation de 11.9 ± très précise pour mesurer la viabilité cellulaire in 3.1, 16.9 ± 3.3, 13.57 ± 3.0 et 7.6 ± 1.39 % de la vitro, ses résultats peuvent avoir d’autres prolifération (Fig. 2C). Lorsqu’on les combine, interprétations. myrtille/vitamine D3/thé vert et myrtille/vitamine Deuxièmement, ces découvertes ont besoin D3/thé ert/carnosine montrent respectivement une d’être répliquées in vivo avant que l’on ne puisse augmentation de 29.2 ± 3.6 et 42.5 ± 5.9 % de la faire des déclarations concernant les applications prolifération (Fig. 2C.), ce qui indique que l’effet de nos découvertes. Par exemple, nos études ont sur les CD133+ résultant de la combinaison de ces été menées in vitro et par conséquent, la composants est additif. complexité associée à la pharmacocinétique de ces divers composants pris oralement n’est pas prise en DISCUSSION compte. Troisièmement, de futures études devraient déterminer si la prolifération engendrée Dans cette étude, nous avons démontré par ces substances et leurs combinaisons augmente pour la première fois que divers composants le risque de genèse de tumeurs. Parce qu’il a été naturels et leurs combinaisons améliorent la montré que la plupart de ces composants soit (1) prolifération des cellules de moelle osseuse, des inhibe la croissance de lignées cellulaires cellules CD34+ dérivées de la moelle osseuse et tumorales, soit (2) entraine une différenciation des des cellules CD133+ dérivées du sang périphérique. cellules tumorales, soit (3) n’affecte pas ou Lorsqu’on les teste individuellement, ces augmente la croissance de cellules normales,22,24-26 composants sont plus efficaces pour améliorer la nos hypothèses de travail reposent sur le fait que prolifération des cellules de moelle osseuse et cette association encourage la croissance de moins efficaces pour traiter les populations cellules normales et réduit également la progénitrices. Ces découvertes peuvent renvoyer tumorgénicité genèse de tumeurs potentielles. au fait que ces composants, pris individuellement, Finalement, bien que cette étude démontre une ont un effet sur les populations de cellules matures amélioration de la prolifération, nous ne savons pas que l’on retrouve également dans les cellules de quel sera le phénotype de ces cellules après le moelle osseuse mises en culture. Lorsque l’activité traitement. Un des buts d’études futures sera de de ces composants est étudiée en combinaisons, les déterminer si nous pouvons identifier des effets additifs et synergiques étaient plus marqués composants naturels qui ne se contenteraient pas pour les cellules progénitrices CD34+ et CD133+. Il d’améliorer la prolifération de cellules souches est surprenant de remarquer que, de certaines de normales, mais également de les pousser ver les ces combinaisons, résulte une prolifération qui phénotypes désirés et spécifiques à certains excède celle produite par le contrôle positif au troubles. hGM-CSF. Par exemple, une combinaison à base En conclusion, nous avons démontré pour d’extrait de myrtille, d’extrait de thé vert, de la première fois que certains composants naturels carnosine et de vitamine D3 produit une meilleure peuvent stimuler la prolifération de cellules prolifération que celle induite par le hGM-CSF des souches hématopoïétique in vitro, et plus 6
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DEVELOPMENT 15:118–123 (2006) 15:118 © Mary Ann Liebert, Inc. 12 précisément qu’une combinaison d’extrait de Holehouse EL, ML Liu and GW Aponte. (1998). Oleic acid myrtille, d’extrait de thé vert, de carnosine, et , distribution in small intestinal epithelial cells expressing intestinal-fatty acid binding protein. Biochim Biophys Acta fatty Biochi vitamine D3 affichent une activité synergique au 1390:52-64. cours de ces tests. De futures études examineront 13 Meyer C. (2004). Scientists probe role of vitamin D: les effets de ces composants sur des cellules deficiency a significant problem, experts say. J Am Med Assn dérivées non-hématopoïétiques. 292:1416-1418. 14 Mathieu C, EE van, B Decallonne, A Guilietti, C Gysemans, R Bouillon and L Overbergh. (2004). Vitamin D and 1.25- Vi dihydroxyvitamin D3 as modulators in the immune system. 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