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  • 1. Proyecto para optar el titulo de Lic. en BiotecnologíaRECOLONIZACIÓN CON BACTERIAS ENDOFíTICAS FIJADORAS DENITRÓGENO EN CAÑA DE AZÚCAR Autora: Bravo Mariana Noelia Directora: Dra. Silvia Carrizo De Bellone UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN FACULTAD DE BIOQUÍMICA, QUÍMICA Y FARMACIA
  • 2. La caña de azúcarLa caña de azúcar (Sacharum sp.) (Sacharum sp.) Planta de gran interés, agrícola la mayor Planta de gran interés, agrícola la mayor parte de su cultivo se destina a la producción parte de su cultivo se destina a la producción azucarera. azucarera. Tucumán es un referente nacional en la Tucumán es un referente nacional en la producción de caña de azúcar, la producción de caña de azúcar, la superficie cultivada es de 217.000 hectarias. superficie cultivada es de 217.000 hectarias. El cultivo en Tucumán abarca 3 zonas: La El cultivo en Tucumán abarca 3 zonas: La Llanuar Chacopampeana , ,el Pedemonte y Llanuar Chacopampeana el Pedemonte y la Llanura Deprimida. la Llanura Deprimida.
  • 3. Las enfermedades de la caña, Las enfermedades de la caña, es uno de los principales es uno de los principales problemas para su producción. problemas para su producción. “El Raquitismo de la caña socas”, “El Raquitismo de la caña socas”, también llamado también llamado Achaparramiento o RSD. Achaparramiento o RSD. Causado por una bacteria Síntomas: plantas de Síntomas: plantas de Enfermedadque provoca Causado por una bacteriaEnfermedad que provoca llamada llamada apariencia enana, poco apariencia enana, poco mayores perdidas a nivelmayores perdidas a nivel Leifsonia xyli subsp. xyli Leifsonia xyli subsp. xyli vigorosa y de muy baja vigorosa y de muy baja mundial. mundial. conocida también como conocida también como producción. producción. Clavibacter xyli Clavibacter xyli Coloniza los haces Coloniza los haces vasculares de la planta vasculares de la planta impidiendo el normal impidiendo el normal funcionamiento. funcionamiento.
  • 4. Control del “Raquitismo de la Control del “Raquitismo de la caña soca”. caña soca”.Utilizar cultivares resistentesUtilizar cultivares resistentes En cultivares susceptibles En cultivares susceptibles Como CP 65-350 Como CP 65-350 como CP 65-357, se utiliza como CP 65-357, se utiliza lamentablemente, estos lamentablemente, estos tratamiento térmico de la tratamiento térmico de la son escasos. son escasos. caña semilla caña semilla
  • 5. El interior de la caña de azúcar El interior de la caña de azúcar se encuentra colonizada se encuentra colonizada microorganismos benéficos microorganismos benéficos denominados endófitos. denominados endófitos.Azospirillum brasilenseAzospirillum brasilense Gluconacetobacter diazotrophicus Gluconacetobacter diazotrophicus
  • 6. A. brasilense y G. diazotrophicus A. brasilense y G. diazotrophicus También denominadas Bacterias También denominadas Bacterias Son llamados diazotrofos Son llamados diazotrofos promotoras del desarrollo vegetal promotoras del desarrollo vegetal (diazo=nitrógeno trofo=nutrición)(diazo=nitrógeno trofo=nutrición) (PGPR) (PGPR) Permiten la Fijación Biológica Permiten la Fijación Biológica Producen fitohormonas como Producen fitohormonas como de Nitrógeno en la caña. de Nitrógeno en la caña. auxinas, citocininas y giberilinas auxinas, citocininas y giberilinas Incrementa el numero, longitud y Incrementa el numero, longitud y Por tener una enzima llamada Por tener una enzima llamada superficie total de las raíces, superficie total de las raíces, Nitrogenasa que reduce el Nitrogenasa que reduce el mejorando la captación de nutrientes mejorando la captación de nutrientes nitrógeno molecular a amoniaco nitrógeno molecular a amoniaco y el estado hídrico de la planta. y el estado hídrico de la planta.
  • 7. El tratamiento, utilizado El tratamiento, utilizadopara eliminar al patógeno Leifsonia xylipara eliminar al patógeno Leifsonia xyli También podría eliminar, a A. brasilenseTambién podría eliminar, a A. brasilense y G. diazotrophicus que interaccionan y G. diazotrophicus que interaccionan con la caña de forma benéfica con la caña de forma benéfica permitiendo la FBN permitiendo la FBN
  • 8. Objetivo General: Objetivo General: Restituir fijadores de nitrógenos que colonizan endofíticamenteRestituir fijadores de nitrógenos que colonizan endofíticamente la caña de azúcar, que fueron eliminados por tratamiento a 50°Cla caña de azúcar, que fueron eliminados por tratamiento a 50°Cdurante 10 minutos.. durante 10 minutos Objetivos Específicos: Objetivos Específicos: Inocular las raíces de cañas tratadas con calor, con cepas de A.Inocular las raíces de cañas tratadas con calor, con cepas de A. brasilense y G. diazotrophicus desarrollados en mediosbrasilense y G. diazotrophicus desarrollados en medios específicos.específicos.Verificar la recolonización de diazotrofos, la que garantizaría elVerificar la recolonización de diazotrofos, la que garantizaría elmejor desarrollo y nutrición de la caña.mejor desarrollo y nutrición de la caña. Disminuir con esta tecnología el tiempo normal deDisminuir con esta tecnología el tiempo normal de recolonización con microorganismo benéficos para el cultivo.recolonización con microorganismo benéficos para el cultivo.
  • 9. MATERIALES Y MÉTODOS
  • 10. PROCEDIMIENTO REALIZADO • 6 caña semillas se trataron en agua a 50°C 10 minutos. • Un testigo para verificar laSe tomaron muestra de caña de Se cortaron de eficacia del tratamiento con dos cultivares CP 65-357 y cada cultivar 16 calor. CP 65-350 caña semilla • Un testigo de las bacterias que colonizaban la caña en el momento del corte, que no fue sometido a calentamiento. Cámara con una temperatura de Ensayo por duplicado 30°C, humedad de los dos cultivares, 60% y 3000 lux cada ensayo tiene 8 durante 15 días. Macetas con cañas semillas arena estéril
  • 11. Se reinocularon conDespués de 15 días Las raíces de cada plantín distintas de desarrollo Tratada a 50ºC combinaciones de microorganismo  CEPAS UTILIZADAS PARA LA REINOCULACIÓN Cepas patrones de : Cultivados en medio líquidos: • A. brasilense • NFb • G. diazotrophicus • LGI-P Incubaron 72 horas a 30°C • L. xyli • Caldo nutritivo
  • 12. •Recuento de microorganismos: diluciones- suspensiones 10-1 10 -2 10-10 10 ml 1 ml 100 ml 9 mlde cultivo 90 ml Sol. fisiológica Sol. fisiológica 100 µl Medios líquidos específicos Incubaron 30°C durante 24 horas hasta una DO de 0.370
  • 13.  REINOCULACIÓN CON BACTERIAS ENDOFITICAS. Inyectando 5 raíces al azar de Reinocularon cada plantín Jeringa hipodérmicaPlantines de 15 días de de 1 ml desarrollo De los 8 plantines de cada ensayo se reinocularon 6 : 1. 0.2 ml de cultivo de A. brasilense. 2. 0.2 ml de cultivo de G. diazotrophicus. 3. 0.2 ml de cultivo de L. xyli. Se incubaron a 30°C, 60% de humedad y 3000 4. 0.1 ml de A. brasilense + 0.1 ml de G. diazotrophicus. lux durante 20 días para la recolonización de las 5. 0.1 ml de A. brasilense + 0.1 ml L. xyli. bacterias. 6. 0.1 ml de G. diazotrophicus + 0.1 ml L. xyli. 7 y 8 son testigos no fueron reinoculados.
  • 14.  VERIFICACIÓN DE RECOLONIZACIÓN•Aislamiento endofítico: Selección de 3 veces en agua Los extremos6 raíces al azar destilada estéril de las raícesde cada plantín lavaron parafinaron 5 veces enEsterilizaron lavaron 1 ml de agua destilada estéril Alcohol 70° Hg2Cl2 30 segundos 2 minutos
  • 15. Las raíces esterilizadas Se cortaron los extremos parafinados sembraronMedio semi-sólido Caldo nutritivo NFb Medio semi-sólido (L. xyli) (A. brasilense) LGI-P (G. diazotrophicus) Incubaron en estufa 72 horas a 30°C
  • 16.  IDENTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS QUE RECOLONIZARON LAS RAÍCES DE LOS PLANTINES DE CAÑA DE AZÚCAR • Característica fenotípica: Morfología de colonias Incubo 72 h. a 30ºC Sembró Cultivos bacterianos en Medio sólido específicos para medio semi-sólido cada tipo bacteria Colonias rojo escarlata de Colonias amarillas de Colonias blancas de A. brasilense G. diazotrophicus L. xyli en medio deen medio de cultivo rojo congo. en medio LGI-P sólido. agar nutritivo.
  • 17. Morfología celular Examen microscopio con objetivos de 40X y 100X Sembró (usando aceite de inmersión)Cultivos en una colonia Medio liquidoMedio sólido Incubo 72 h. a 30°C•Característica bioquímica y fisiológicas Prueba de la oxidasa Papel de filtro + 50 una gota de sol. Acuosa µl de TEMED (1%)Cultivo liquido Oxidasa Oxidasa negativa positiva
  • 18. Prueba de la catalasaUna gota deH2O2 AL 3% esparcida 6 cultivos de cada bacteria crecido en caja de petri Cultivo de G. diazotrophicus Catalasa positiva Prueba de la gelatinasa Incubó 24 horas y se llevo 2 horas a heladeraBacterias crecidasen 8 ml de mediopreparado con: Repitió 5 veces A. Gelatinasa negativaExtracto de levadura (medio semi-sólido)Peptona B. Y C. Gelatinasa positiva (medio liquido)Gelatina (B.D.H.)
  • 19. Fuente carbonadas variadas: glucosa, sacarosa y manitol realizada con 10 repeticiones. Incubo Se observo en 24 h. a 30°C el microscopio óptico Medios específicos + Fuente carbonadaReducción de nitrato Acido sulfanílico (reactivo A ) + Color rojoNN dimetil-1-naftalenamina (reactivo B) Nitrato reductasa negativa + Iones NO-3
  • 20. Comportamiento de A. brasilense, G. diazotrophicus y L. xyli frente a diferentes pruebas bioquímicas y fisiológicascaracterísticas A. brasilense G. diazotrophicus L. xyli Oxidasa - - - Catalasa + + + Hidrólisis de gelatina - + -Crecimiento en: Glucosa - + + Sacarosa - + + Manitol + D* + NO3 NO2 + - - (+) Reacción positiva; (-) Reacción negativa (D*) Reacción débil
  • 21. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
  • 22. Tabla 1: Bacterias endofíticas que colonizan la caña de azúcar CP 65-357 que fueron utilizados como testigos. Testigo sin Testigo con Total de tratamiento a 50ºC tratamiento a 50ºC Bacterias raíces positivo negativo positivo negativo analizadasA. brasilense 12 9 3 0 12 G. 12 6 6 0 12diazotrophicus L. xyli 12 5 7 0 12 *Positivo: presenta desarrollo bacteriano *Negativo: ausencia de desarrollo bacteriano *Total de raíces analizadas: total de los ensayos por duplicados
  • 23. A. brasilense G. diazotrophicus L. xyli 75% 80% 70% Porcentaje de colonización 60% 50% 50% 41,67% 40% 30% 20% 10% 0% 0% 0% 0% Sin tratamiento térmico Con tratamiento térmico Testigos CP 65-357Fig. 1: Porcentaje de colonización por bacterias endofíticas en: CP 65-357
  • 24. Tabla 2: Bacterias endofíticas que colonizan la caña de azúcar CP 65-350 que fueron utilizados como testigos. Testigo sin Testigo con Total de tratamiento a 50ºC tratamiento A 50ºc Bacterias raíces positivo negativo positivo negativo analizadasA. brasilense 12 10 2 0 12 G. 12 8 4 0 12diazotrophicus L. xyli 12 0 12 0 12 *Positivo: presenta desarrollo bacteriano *Negativo: ausencia de desarrollo bacteriano *Total de raíces analizadas: total de los ensayos por duplicados
  • 25. A. brasilense G. diazotrophicus L. xyli 90% 83% 80% 67% 70%Porcentaje de 60%colonización 50% 40% 30% 20% 10% 0% 0% 0% 0% 0% Sin tratamiento térmico Con tratamiento térmico Testigos CP 65-350Fig. 1: Porcentaje de colonización por bacterias endofíticas en: CP 65-350
  • 26. Tabla 3: Recolonización de bacterias diazotróficas endofíticas en plantines de caña de azúcar CP 65-357 Bacterias Total de raíces Recolonización inoculadas analizadas Positiva Negativa A. brasilense 12 12 0 G. diazotrophicus 12 11 1 A. brasilense 6 4 2 y 6 6 0 G. diazotrophicus *Total de raíces analizadas: total de los ensayos por duplicados
  • 27. Tabla 4: Recolonización de bacterias diazotróficas endofíticas en plantines de caña de azúcar CP 65-350 Bacterias Total de raíces Recolonización inoculadas analizadas Negativa A. brasilense 12 12 0 G. diazotrophicus 12 12 0 6 5 1 A. brasilense 6 6 0 *Total de raíces analizadas: total de los ensayos por duplicados y G. diazotrophicus
  • 28. A. brasilense G. diazotrophicus A. brasilense - G. diazotrophicus 100% 100% 100% 100% 100% 100% 92% 83,33% recolonización Porcentaje de 80% 66,67% 60% 40% 20% 0% CP 65-357 CP 65-350 Cultivares Fig. 3: Porcentaje de recolonización de bacterias diazotróficas en plantines de caña de azúcar cultivares CP 65-357 y CP 65 350
  • 29. Positivo Negativo 97,22% 91,67% de recolonización 100% Porcentaje total 80% 60% 40% 20% 8,33% 2,78% 0% CP 65-357 CP 65-350 CultivaresFig. 4: Porcentaje total de recolonización de bacterias fijadoras de nitrógeno en plantines de caña cultivares CP 65-357 y CP 65-350
  • 30. Tabla 4: Recolonización de bacterias patógenas y diazotróficas en plantines de caña de azúcar CP 65-357 Bacterias Total de raíces Recolonización inoculadas analizadas Positiva Negativa L. xyli 12 10 2 L. xyli 6 2 4 y 6 6 0 A. brasilense L. xyli 6 0 6 y 6 6 0 G. diazotrophicus*Total de raíces analizadas: total de los ensayos por duplicados
  • 31. Tabla 5: Recolonización de bacterias patógenas y diazotróficas en plantines de caña de azúcar CP 65-350 Bacterias Total de raíces Recolonización inoculadas analizadas Positiva Negativa L. xyli 12 0 12 L. xyli 6 0 6 y A. brasilense 6 4 2 L. xyli 6 0 6 yG. diazotrophicus 6 6 0*Total de raíces analizadas: total de los ensayos por duplicados
  • 32. L. xyli L. xyli - A. brasilense L. xyli - G. diazotrophicus 100% 100% 100% 100% 83,33% recolonización Porcentaje de 80% 66,67% 60% 40% 33,33% 20% 0% 0%0% 0% 0% CP 65-357 CP 65-350 CultivaresFig. 6: Porcentaje de recolonización especifica del patógeno y combinado a diazotrofos en cultivares CP 65-350 y CP 65-357
  • 33. CONCLUSIONES
  • 34.  El tratamiento a 50°C durante 10 minutos aplicados a los dos El tratamiento a 50°C durante 10 minutos aplicados a los dos cultivares de caña de azúcar CP 65-357 (susceptible) y CP 65-350cultivares de caña de azúcar CP 65-357 (susceptible) y CP 65-350 (resistente), fue efectivo ya que eliminó a L. xyli.(resistente), fue efectivo ya que eliminó a L. xyli.El tratamiento a 50ºC en los dos cultivares, también eliminó lasEl tratamiento a 50ºC en los dos cultivares, también eliminó lasbacterias benéficas A. brasilense y G. diazotrophicus.bacterias benéficas A. brasilense y G. diazotrophicus.La tecnología utilizada para la recolonización endofíticas de lasLa tecnología utilizada para la recolonización endofíticas de lasbacterias fijadoras de nitrógeno es efectiva ya que hay un 91.67%bacterias fijadoras de nitrógeno es efectiva ya que hay un 91.67%de recolonización CP 65-357 y un 97.22% en CP 65-350.de recolonización CP 65-357 y un 97.22% en CP 65-350. La recolonización del patógeno Leifsonia xyli en CP 65-357, esLa recolonización del patógeno Leifsonia xyli en CP 65-357, es de un 83.33% y en CP 65-350 es de 0%, lo que demuestra lade un 83.33% y en CP 65-350 es de 0%, lo que demuestra la susceptibilidad y resistencia respectivamente.susceptibilidad y resistencia respectivamente.
  • 35. La recolonización de las bacterias La recolonización de las bacterias fijadoras endofíticas, permite fijadoras endofíticas, permitedesarrollar cultivos de Caña de azúcardesarrollar cultivos de Caña de azúcar con menor incidencia en la con menor incidencia en la colonización de Leifsonia xyli y colonización de Leifsonia xyli y garantizan la fijación de nitrógeno garantizan la fijación de nitrógeno desde el inicio del cultivo. desde el inicio del cultivo.