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Introdução<br /><ul><li>A contaminação de efluentes de esgotos tratados, leva muitas vezes productos de cuidado pessoal e ...
Muitas actuam a concentrações relativamente baixas;
Fármacos necessitam de tempo para atingir o efeito desejado e logo, são produzidos especificamente para resistir à degrada...
A taxa de adição ao meio excede a sua transformação ou degradação;
A sua exposição crónica tem vindo a ser associada ao desenvolvimento de bactérias resistentes a antibióticos.</li></li></u...
Anonymous DNA microarray poderá ser uma alternativa interessante para análises metatranscriptómicas comparativas pois não ...
Identificar respostas transcripcionais de biofilmes fluviais para doses ambientalmente relavantes de diferentes tipos de p...
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Hibridização e análise do Microarray<br />250-500mg  de Biofilme(amostracomposta)<br />Ácidosnucleicos<br />RNAse<br />DNA...
Sequenciação e qRT-PCR<br /><ul><li>Apósa análiseestatísticaas sondasqueobtiverammaioresvalorespara com o primeiro e segun...
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Os 96 valores positivos e negativos de maior valor para cada eixo foram seleccionados para sequenciação.</li></ul>Fig 1a.<...
Resultados<br />Análise do microarray para SouthSaskatchewanRiver (SSR)<br /><ul><li>Este rio foi escolhido por diferir do...
As posições relativas dos tratamentos não foram exactamente as mesmas que para WC, mas observou-se alguma similaridade </l...
Resultados<br />Sondas mais reactivas aos tratamentos dos biofilmes de WC<br /><ul><li>Sulfamethoxazole (SL)
sondas > parede celular e membrana externa (COG M)ou envolvidas na transducção de sinal (COG T) - resposta positiva.
Sondas > genes que codificam as DNA e RNA polimerases  - resposta negativa.
Gemfibrozil (GM)
3 sondas > Chitinophagapinensis – resposta negativa ao GM, que pode indicar que este microrganismo pode ser inibido pelo g...
3 sondas > transporte e metabolismo lipídico (COG I) e uma relacionada com regulação da síntese flagelar – resposta positi...
1 sonda >guanosinatetrafosfato (ppGpp) sintetase – resposta positiva.
Resposta mais positiva para a sonda ligada à proteína chaperonaDnaK (proteína de choque térmico 70).
Sondas potencialmente relacionadas com genes de resposta a stress - respostas positivas ou negativa.
Sondas > producção e conversão de energia (COG C), transporte de hidratos de carbono e metabolismo (COG G), e Haliangiumoc...
5 genes relacionados com producção e conversão de energia (COG C) – resposta positiva.
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Apresentação artigo mm final

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  1. 1. ESCOLA SUPERIOR DE BIOTECNOLOGIA - UNIVERSIDADE CATÓLICA PORTUGUESA<br />MESTRADO EM MICROBIOLOGIA APLICADA<br />MICROBIOLOGIA MOLECULAR<br />Metatranscriptomic Analysis of the Response of River Biofilms to Pharmaceutical Products, Using AnonymousDNA Microarrays<br />Applied and Environmental Microbiology – Agosto 2010<br />Ana Figueiredo<br />João Pereira<br />Leonardo Dantas<br />Porto, 04 de Janeiro de 2011.<br />
  2. 2. Introdução<br /><ul><li>A contaminação de efluentes de esgotos tratados, leva muitas vezes productos de cuidado pessoal e fármacos cada vez mais utilizados a serem disseminados no meio ambiente. </li></ul>Razões do interesse nestes productos:<br /><ul><li>Muitas drogas interagem com alvos biológicos partilhados entre humanos, outros animais e mesmo plantas e microrganismos;
  3. 3. Muitas actuam a concentrações relativamente baixas;
  4. 4. Fármacos necessitam de tempo para atingir o efeito desejado e logo, são produzidos especificamente para resistir à degradação dentro do corpo;
  5. 5. A taxa de adição ao meio excede a sua transformação ou degradação;
  6. 6. A sua exposição crónica tem vindo a ser associada ao desenvolvimento de bactérias resistentes a antibióticos.</li></li></ul><li>Introdução<br /><ul><li>Os biofilmes tanto pelo seu efeito basal nas redes de comida aquática e a sua importância em processos fundamentais como na biodegradação e em ciclos bioquímicos, são candidatos ideais para a monitorização de efeitos ecológicos de poluição por fármacos em ambientes aquáticos. </li></ul>Anonymous DNA microarrays<br /><ul><li>Frequentemente utilizados para estudos transcriptómicos de organismos cujo genoma ainda não foi sequenciado.
  7. 7. Anonymous DNA microarray poderá ser uma alternativa interessante para análises metatranscriptómicas comparativas pois não requer conhecimento prévio da genómica ambiental e permite um grande número de amostras sem que seja necessário o sequênciamento metatranscriptomico a cada amostra a analisar. </li></li></ul><li>Introdução<br />Objectivos do presente estudo:<br /><ul><li>Demonstrar a utilidade de anonymous microarrays em estudos do metatranscriptoma em larga escala.
  8. 8. Identificar respostas transcripcionais de biofilmes fluviais para doses ambientalmente relavantes de diferentes tipos de productos farmacêuticos.</li></li></ul><li>Amostragem<br />2) South Saskatchewan River (SSR)<br />Biofilmes deSSR:Testeao microarray. <br />•<br />•<br />Wascana Creek (WC)<br />Para a observaçãodaresposta do biofilme a cada um dos fármacos.<br />Misturas de Biofilmes deWCsujeitos a seistratamentosdiferentesforamusadospara aconstruçãodomicroarray (33 amostras).<br />Eritromicina(EL) 1µgL-1, <br />Clindamicina, Trimetroprim, Sulfametazina(SN) 0.5µgL-1,<br />Norfloxacina, Sulfametoxazol(SL) 0.5µgL-1,<br />Gemfibrozil(GM) 1µgL-1,<br />Nothing was added to the control reactors (CO).<br />
  9. 9. Construção da plataforma de microarrayanónimo<br />48 sub-arrays impressos<br />emlâminas de vidro<br />revestidas de Aminosilano<br />Total Genomic DNA<br />Sonication<br />Genomic Fragments<br />(400-600bp)<br />VersArray Colony Picker<br /> (Bio-Rad)<br /> 6,351 “bons” (66.2%)<br />917 “fracos” (9.6%)<br />End repair (End-It kit)<br />Taq DNA polymerase<br />+<br />dATP<br />Verificação em gel<br />Quantificação de DNA por UV<br />Amplificação <br />(primers para vector)<br />UA Ligation <br />into <br />pDrive vector<br />VersArray Chip Writer Pro Printer<br /> (Bio-Rad)<br />Extracção de DNA<br /> dos 9 600 clones<br />Transformação de células<br />XL1-Blue <br />
  10. 10. Hibridização e análise do Microarray<br />250-500mg de Biofilme(amostracomposta)<br />Ácidosnucleicos<br />RNAse<br />DNAse<br />mRNA<br />OmRNA foi enriquecido, amplificado para cDNA, e marcado com Cy3.<br />50µL de RNA<br />cDNA<br />50µL deDNA<br />Usam-se primers aleatórios e uma forma mutada do fragmento Klenow da DNA polimerase I, para a incorporação de nucleotidos fluorescentes, Cy5.<br />
  11. 11. Sequenciação e qRT-PCR<br /><ul><li>Apósa análiseestatísticaas sondasqueobtiverammaioresvalorespara com o primeiro e segundoeixoforamrecuperadas dos clonesusadospara a construção do microarrray esequenciadas.
  12. 12. Para algumas das sondasidentificadascomomaisreactivasaostratamentos,construiram-se primersqueforamusadosemreacções de qRT-PCR, para a verificação das tendênciasobservadas no microarray.</li></li></ul><li>Resultados<br />Padrões normalizados de hibridação foram usados com 2 propósitos:<br />Providenciar a impressão do metatranscriptoma de cada amostra<br />Identificar as sondas mais fortemente ligadas com os tratamentos experimentais.<br /><ul><li>fingerprint de alta definição da comunidade microbiana e para identificar genes que fossem expressos mais diferenciadamente entre tratamentos. </li></li></ul><li>Resultados<br />Análise do microarray para WascanaCreek (WC)<br /><ul><li>As associações das sondas, relativas aos tratamentos, foram determinadas positivamente ou negativamente (por vezes ambas) baseando-se na comparação da intensidade média para um dado tratamento, com os restantes.
  13. 13. Os 96 valores positivos e negativos de maior valor para cada eixo foram seleccionados para sequenciação.</li></ul>Fig 1a.<br />
  14. 14. Resultados<br />Análise do microarray para SouthSaskatchewanRiver (SSR)<br /><ul><li>Este rio foi escolhido por diferir do WC em um parâmetro ambiental importante (por ex: disponibilidade de nutrientes ou trofismo).
  15. 15. As posições relativas dos tratamentos não foram exactamente as mesmas que para WC, mas observou-se alguma similaridade </li></ul>Fig1b.<br />
  16. 16. Resultados<br />Sondas mais reactivas aos tratamentos dos biofilmes de WC<br /><ul><li>Sulfamethoxazole (SL)
  17. 17. sondas > parede celular e membrana externa (COG M)ou envolvidas na transducção de sinal (COG T) - resposta positiva.
  18. 18. Sondas > genes que codificam as DNA e RNA polimerases - resposta negativa.
  19. 19. Gemfibrozil (GM)
  20. 20. 3 sondas > Chitinophagapinensis – resposta negativa ao GM, que pode indicar que este microrganismo pode ser inibido pelo gemfibrozil.
  21. 21. 3 sondas > transporte e metabolismo lipídico (COG I) e uma relacionada com regulação da síntese flagelar – resposta positiva.</li></li></ul><li>Resultados<br /><ul><li>Eritromicina (ER)
  22. 22. 1 sonda >guanosinatetrafosfato (ppGpp) sintetase – resposta positiva.
  23. 23. Resposta mais positiva para a sonda ligada à proteína chaperonaDnaK (proteína de choque térmico 70).
  24. 24. Sondas potencialmente relacionadas com genes de resposta a stress - respostas positivas ou negativa.
  25. 25. Sondas > producção e conversão de energia (COG C), transporte de hidratos de carbono e metabolismo (COG G), e Haliangiumochraeum – resposta negativa.</li></li></ul><li>Resultados<br /><ul><li>Sulfametazina (SN)
  26. 26. 5 genes relacionados com producção e conversão de energia (COG C) – resposta positiva.
  27. 27. 2 sondas relacionadas a Hyphomonasneptunium – resposta negativa.
  28. 28. Vários genes relacionados com replicação, recombinação, e reparação (COG L), tiveram respostas positivas ou negativas.</li></li></ul><li>Resultados<br />Sondas mais reactivas aos tratamentos dos biofilmes de SSR<br /><ul><li>11 das 192 sondas que obtiveram os maiores valores em cada lado dos dois primeiros eixos (relativamente a SSR), estiveram também entre as 384 sondas de maior valor para os biofilmes de WC.
  29. 29. Entre estas 11 sondas, 3 tiveram equivalências significantes na base de dados</li></li></ul><li>Resultados<br />Eritromicina<br />Sondas de melhor resposta nos biofilmes WC<br />Sulfametoxazol<br />Gemfibrosil<br />Sulfametazina<br />Parede celular e membrana externa<br />Transdução de sinal<br />Produção e conversão de energia<br />Produção e conversão de energia<br />Transporte e metabolismo de lipidos<br />
  30. 30. Resultados<br />Sondas de melhor resposta<br /> 11 das 192 sondas com os maiores valores em cada lado dos dois primeiros eixos dos biofilmes SSR também estavam entre as 384 sondas que tiveram os maiores valores para os biofilmes WC.<br />
  31. 31. Resultados<br />qRT-PCR<br />qRT-PCR<br />concordante com Microarray<br />qRT-PCR<br />discordante do Microarray<br />
  32. 32. Discussão<br />Hormese<br />ERITROMICINA<br /> Chaperona DnaK<br /> ppGpp sintetase<br />
  33. 33. Discussão<br />SULFONAMIDAS<br />Diminuição da expressão de genes relacionados à replicação e transcrição (DNA e RNA polimerases)<br />SULFAMETOXAZOL<br />Aumento da expressão de genes relacionados à parede celular e membrana externa<br />Formação de biofilme<br />SULFAMETAZINA<br />Aumento da expressão de genes relacionados à produção e conversão de energia.<br />
  34. 34. Discussão<br />GEMFIBROSIL<br />Aumento da expressão de diversos genes relacionados ao metabolismo lipídico, indicando que o GM possa afectar este processo em baixas concentrações.<br /> Regulador de síntese do flagelo<br /> Regulador de síntese do flagelo<br />DIMINUIÇÃO DOS NÍVEIS DE 16S rRNA<br />Todos os produtos farmacêuticos;<br />Diminuição da biomassa microbiana ou diminuição da atividade geral no biofilme.<br />
  35. 35. Discussão<br /><ul><li>Das centenas de sondas analisadas que demonstraram uma resposta mais forte aos tratamentos, 11 mostraram sobreposição entre os dois rios.
  36. 36. Indicação que as pequenas moléculas testadas causam alterações reproductiveis nas comunidades de biofilmes para ambos os rios.
  37. 37. Sondas serão de, ou genes similares de organismos diferentes, ou de genes diferentes provindos de organismos idênticos.
  38. 38. As diferenças entre respostas, das restantes sondas, poderá ter sido causado não só pelo número relativamente pequeno de sondas, mas também pelo diferente estado nutricional dos biofilmes.</li></li></ul><li>Conclusões<br /><ul><li> A exposição de comunidadesbacterianascomplexas a fármacosinduzrespostas a níveldatranscriçãoproteicaqueconfirmamosestudosanteriores, em particular no quedizrespeito à eritromicina.
  39. 39. QuantoaoGemfibrozil e àsSulfonamidas as respostasobservadas, estãode acordo com o conhecimentogeral, poisnãoexistemmuitosestudos de transcriptómica com estesfármacos.
  40. 40. O microarray foiusado com sucessoembiofilmesformados sob condiçõesnutriocionaisdiferentesdaquelas a quelhederamorigem.
  41. 41. A partirdestepoderá ser construido um microarray maisreduzidocontendoapenas as sondasmaisrelevantes.
  42. 42. Poderá ser uma forte contribuiçãopara o desenvolvimento de um sistemacapaz de monitorizarosefeitos de diferentesfármacosnosecossistemasfluviais. </li></li></ul><li>Questões para debater…<br />Os antibióticos sulfametoxazol e sulfametazina possuem estrutura e mecanismo de acçãoquase idênticos; por que geraram expressão génica tão diferente?<br />Se os produtos farmacêuticos não estavam em altas concentrações, o que levou a grande diminuição da biomassa microbiana?<br />Qual a principal contribuiçãodesteestudoparaanálises de transcriptomasambientais?<br />A utilização de apenas um tipo de amostra diferente da utilizada para construção do microarray será suficiente para sua validação?<br />Quais as principaislimitações, inerentesaoprópriométodo, e quenãosãomencionadas?<br />
  43. 43. Muito obrigado<br />pelavossaatenção e debate!<br />
  44. 44. REFERÊNCIAS<br /><ul><li>YergeauE, Lawrence JR, Waiser MJ, Korber DR, Greer CW. Metatranscriptomic Analysis of the Response of River Biofilms to Pharmaceutical Products, Using AnonymousDNA Microarrays. AppliedandEnviromentalMicrobiology 2010; 76(16):5432–39.
  45. 45. Pariset L, Chillemi G, Bongiorni S, Spica VR, Valentini A. Microarraysandhigh-throughputtranscriptomicanalysis in specieswith incomplete availability of genomic sequences. New Biotechnology 2009; 25(5):272-79.
  46. 46. Linares JF, Gustafsson I, Baquero F, Martinez JL. Antibiotics as intermicrobialsignalingagentsinsteadofweapons. ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences 2006; 103(51): 19484-89.
  47. 47. Davies J, Spiegelman GB, Yim G. The world of subinhibitory antibiotic concentrations. Current Opinion in Microbiology 2006; 9:445–53.
  48. 48. Fajardo A, Martínez JL. Antibiotics as signals that trigger specific bacterial responses. Current Opinion in Microbiology 2008; 11:161–67.
  49. 49. Lawrence JR, SwerhoneGDW, Neu TR. A simple rotating annular reactor for replicated biofilm studies. J. Microbiol. Methods 2000; 42:215– 24.
  50. 50. Sonenshein AL. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis. Nature Reviews Microbiology 2007; 5:917-27 .</li>
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