バイオイメージング研究のためのImageJによるデジタル画像解析入門(2011年6月版)

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  • 1. バイオイメージング研究のための ImageJ によるデジタル画像解析入門 2011-06-10東京大学 大学院新領域創成科学研究科 先端生命科学専攻 朽名 夏麿
  • 2. 生命現象のスケールと画像 塩基配列 200 nm 2000 km 生体分子 超微細構造 オルガネラ 細胞 組織 器官 個体 地球環境 個体群 10 nm 10 m 10 mm 1 km 105 km (10-8 m) (10-5 m) (10-2 m) 1m (103 m) (108 m)0.1 nm(10-10 m) スケール 画像 (バイオイメージング) 電顕 衛星画像 顕微鏡 イメージング技術の進歩 画像データベースの整備
  • 3. バイオイメージングの特徴とデジタル画像解析多次元 (時間,立体,波長…) 多様性(生物種,部位,観察法…) t, z, データサイズ・枚数 (n) 多目的性 (何に着目するか) 100 ms/枚 位置・局在 濃度・電位 運動 数・形・長さ 1024*1024 pixel/枚 12 bits/pixel → 4 GiB / 5 分 自動化・計算機支援に向く 研究者(人間)の柔軟性が不可欠 デジタル画像解析 人と機械の協働 ・ 多様な画像と目的をカバーできる適応性・汎用性 ・ 数値化による客観性,自動化による高速性
  • 4. 画像解析とは?* 画像を解析すること.画像から何かを解析すること.* 「視る」(「見る」「観る」「診る」「みる」) と 「測る」(「計る」「量る」). 「視る」をサポートするものでもあり,「測る」ことでもある.* 画像からデータを得る? 「画像 = データ」ではないのか? 画像の中からデータを取り出す? データマイニング? デジタル画像解析とは?* コンピュータを使う画像解析.* 現代では,撮影後のほぼ全ての工程に関与する.* 作業としては,画像をいじったり,測ったり,分けたり. 画像→画像: 加工,除去,補正,抑制,軽減,強調… 画像→数値: 測定,定量,計数… 画像→ラベル: 分類,判別,判定,認識,抽出,検出…
  • 5. シロイヌナズナ気孔 アクチン繊維 「画像→画像」の例 共焦点画像 高周波数成分の抽出 二値化像 細線化像 (繊維等の強調処理) (白黒画像) 「画像→数値」の例 気孔開閉の指標 アクチン繊維の配向の指標 短径 / 長径 長径 気孔に対する アクチン繊維の角度  短径  気孔 灰色: 気孔領域 この場合, この場合,黒色: アクチン繊維 短径 / 長径=0.47 アクチン繊維の角度=54.3°
  • 6. 「画像→ラベル」の例 GFP-AtORF DBを対象としたGFP局在部位の自動判定 細胞質 核 核小体 細胞壁 その他自動分類ソフトウェアの正解率 91.8% 83.6% 87.8% 96.7% 78.2%当研究室の院生・スタッフ 4名の平均正解率 86.0% 78.1% 90.0% 95.6% 81.4% 画像の出典 http://data.jic.bbsrc.ac.uk/cgi-bin/gfp/シロイヌナズナ培養細胞 Koroleva OA et al. (2005) Plant J 41: 162-174
  • 7. 撮像過程と解析過程 (一つの見方) ? 真実 撮像系 データ (数値や3次元モデル等) 光学系 解析対象 ボケや散乱撮像過程 画像処理: n 解析過程 カメラ 標本化,量子化,ノイズ 画像処理: 2 原画像 画像処理: 1 画像解析は,我々が唯一得ることのできる「原画像」から, 撮像系の影響や注目していない領域の影響を除いていき, 注目する表現形質や現象だけを取り出し, 「データ」として表現する過程.
  • 8. デジタル画像解析をはじめる前に顕微鏡で撮影する際: 適切な撮像設定(レンズ,励起光強度,露光時間,ピンホール径等). 留意点: S/N(シグナル-ノイズ比),ダメージ,サチュレーション防止等適切な画像解析の環境 良いソフトウェア: ImageJ の利用を勧める. マシン: OSは問わない.速くてメモリが多いもの.64bit推奨. モニタ設定と部屋の照明を見やすいように設定
  • 9. インストールと基本画面
  • 10. ImageJ と KBI plugins のインストール http://hasezawa.ib.k.u-tokyo.ac.jp/zp/Kbi/ImageJTutForNaist
  • 11. ImageJ の基本画面 ← メニューバー ← ツールバー ← ステータスバー ← 画像タイトル 画像情報(サイズ等) ← 画像ウインドウ タバコBY-2 液胞膜 赤い三角形の付く アイコンは右クリック で機能切り替え可. ツールバー 赤い線: 頻用するもの. 青い線: selection (ROI).http://rsb.info.nih.gov/ij/docs/tools.html
  • 12. デジタル画像の基本: 画素と輝度
  • 13. 画素と画素数 ←画像情報: 159x153 pixels; 8-bit; 24K 画素数 159153 (3200%) : 拡大・縮小率 画素, pixel (picture element) dot とか point とも呼ばれる.画像ウインドウ左上に青い枠が表示されている場合,ウインドウに画像全域が収まっていない.現在表示されている部位が,画像全域のどこに相当するかを示している.
  • 14. 座標系と画素と輝度 ←画像情報: 159x153 pixels; 8-bit; 24K x (3, 0) 輝度30 (x,y) = (0, 0) (3, 2) 輝度 35 輝度 21 ImageJ では左上を原点(0, 0)とし,右に X 軸,下にY軸が伸びる.y 各画素には輝度 (強度,intensity.明度 brightness ,信号強度等 とも) が割り当てられている.
  • 15. 159 座標系と画素と輝度 153 x x (3, 0) 輝度30 (x,y) = (0, 0) (3, 2) 輝度 35 輝度 21y 159列 表示を縮小 Excel で開いた例 153行
  • 16. PowerPoint 等での強拡大に注意 PowerPoint で拡大 (補間有り)Photoshop や PowerPoint 等で補間をともなう"強拡大"をするとデジタル的な解像度や分解能と関係なく擬似的にズームしたようになるが,解像度や分解能が上がる訳ではない.データ解釈を誤らないよう注意.
  • 17. Brightness & Contrast による表示上の"明るさ"の調整 真っ白 真っ黒スライドバーを動かすことによる調整は,表示上の"明るさ"を変えているに過ぎない.→ 輝度は変化しない.8-bit 画像の場合はApply ボタンを押すことによって,その時の表示範囲が0~255にスケールされる.→ 輝度が変化する.
  • 18. デジタル画像解析に必須の作業見ること. 隅から隅まで,モニタに近付いたり離れたりしつつ,見る. 微妙な変化や異常に気付くよう注視したり,時にはリラックスして 眺めたりする. 表示上の"明るさ"をさまざまに設定し,必ず一度は「サチる」状態 までコントラストを上げる. ズーム機能によって,必ず「画素」の大きさが認識できる倍率まで 拡大する. 回転(Image - Transform -...),白黒反転(Image - Lookup Tables - Invert LUT),擬似色表示(Image - Lookup Tables - ...)も有効.描くこと. 模写,スケッチを行なう.これにより,深く見ることができる.要は「観察」.観察力がないと画像解析は失敗するし,画像解析を身につけると観察力は増す.見ている対象を好きになること,も良いかも知れない.
  • 19. 形の解析
  • 20. 輝度のタイプ 輝度のデータ型. ビット深度(bit depth), bits per pixel, 量子化ビット数等とも呼称. グレイスケール画像, 濃淡画像 ≠白黒画像 8-bit: 0~255 の整数(integer) 16-bit: 0~65535 の整数(integer) 32-bit: 浮動小数点数(float) 実数の近似値.±3.438 の範囲で 7桁位の精度. (3, 0) 輝度30 カラー画像 8-bit Color: 使わない. RGB Color: 赤緑青の3チャネルを(0, 0) (3, 2) 重ねることによるカラー表現.輝度 35 輝度 21 各チャネルのデータ型は8-bit, 16-bit, 32-bit のいずれかで, チャネル間では統一されている.
  • 21. 輝度のビット深度グレイスケール画像, 濃淡画像 ≠白黒画像8-bit: 0~255 の整数(integer)16-bit: 0~65535 の整数(integer)32-bit: 浮動小数点数(float) 実数の近似値.±3.438 の範囲で 7桁位の精度.原画像の bit 深度はカメラ(検出器)によって異なる.8~16 bits/pixel が多い.12 bits/pixel (212 , 0~4095) や 14 bits/pixel (214 , 0~16383)のカメラで得た画像は 16 bits/pixel の画像フォーマットとして扱う(大は小を兼ねる).輝度には必ずノイズが混じるので,bit 深度が大きい方が一概に高性能,というわけではない.カタログスペック的なコケオドシに過ぎない場合もある.
  • 22. 画像情報の確認 (スケール情報,画像タイプ) シロイヌナズナ気孔 葉緑体 解析前には画像情報を確認する. スケール情報は正しいか,画像タイプは適切か.http://podb.nibb.ac.jp/Organellome/bin/browseImage.php?ID=Image-yoshioka_bio.nagoya-u.ac.jp-20060726164901
  • 23. 画像情報の修正 (スケール情報,画像タイプ)
  • 24. 手作業でのROI設定を介した形状解析: 長さ Edit - Select All (Control-A) と Edit - Copy (Control-C) でコピー. Excel 等にペースト.線分や曲線をマウスで引き, t キーで ROI Manager に登録,を繰返す.ROI Manager の「Show All」をチェックしておくと作業しやすい.Measure ボタンで登録済の ROI 全部をまとめて測定.角度や長さ(画素単位)が得られる. Excel等でμmに変換し,統計処理.
  • 25. 手作業でのROI設定を介した形状解析: 面積 or測定対象領域をマウスで設定し, t キーでROI Manager に登録,を繰返す.Measure ボタンで測定.測定項目は Analyze - Set Measurements... から指定.
  • 26. 二値化による領域抽出 二値画像 (白黒画像) グレイスケール画像 (濃淡画像) or蛍光像の場合,「高い輝度の領域」が「測定対象領域」の場合が多い.閾値となる輝度を決め,二値画像(白黒画像)に変換することで,領域抽出(領域分割, segment)ができる.原始的だが安定した閾値決定の方法として,目視による例を示す.
  • 27. 目視による閾値調整
  • 28. 二値化と粒子解析 二値画像グレイスケール画像
  • 29. 大津の方法,判別分析法.自動的な2値化に多用される.
  • 30. 例: 文字画像,細胞の顕微鏡画像Otsu79 2値化 3値化
  • 31. 自動的な2値化アルゴリズムの実装 in KBI ImageJ plugins入力画像: 8-bit grayscale スタックも可.スタックの場合, スタック全体からひとつの閾値 を求めるか,スライスごとに閾値を 求めるか選択可能.呼び出し: Kbi_Filter2d →filter = thresholdOps →thrMode = 右のいずれか
  • 32. 最近の ImageJ は Thresholdコマンドの中に,いくつかの自動的な2値化アルゴリズムを実装している(以前は IterativeSelection のみで,現在も Defaultの名で残っている).結果がインタクティブに表示されるし,8-bit grayscale 以外も処理できるのでこちらの方が使いやすい.ただどちらか一方にしか無いアルゴリズムも存在する.
  • 33. nuclear mask generation(要は segmentation )DAPI iterative conditional Watershed segmentation algorithm De Vos WH et al. (2010) Cytometry 77A 64-75.
  • 34. TRF2-mCitrine(TRF2: telomere binding protein) De Vos WH et al. (2010) Cytometry 77A 64-75.
  • 35. 入力画像 ノイズ抑制像gradient inverse weighted smoothing (GIWS) によるノイズ抑制※非線形なノイズ抑制フィルタであり,ボケを加えにくい.giwsIter: ノイズ抑制の度合い.0以上.大きければノイズをより抑えるが,細かな繊維の抽出ができなくなる.小さければ細かな繊維が抽出できるが,ノイズも繊維として抽出する恐れが高くなる.Wang DCC, Vagnucci AH, Li CC (1981) Gradient inverse weightedsmoothing scheme and the evaluation of its performance.Comp Graph Image Proc 15: 167-181.
  • 36. ノイズ抑制像 線分強調像MDNMS: multiple directional non-maximum suppression による線分強調.線分強調像における輝度は「線分らしさ」を示しており,入力画像の輝度ではない.mdnmsLen: 線分強調処理における直線部の長さを設定する.Sun C, Vallotton P (2009) Fast linear feature detection using multipledirectional non-maximum suppression. J Microsc 234:147-157.
  • 37. 線分強調像 高輝度領域線分強調像の中から,線分らしさの高い領域を抽出するステップ.線分強調像には繊維でなくノイズがたまたま繊維的に見える領域も強調されているので,本ステップによって線分らしさの低い領域の足切りを行なう.ただし,本ステップは1本の繊維が複数の線分へ分断されてしまう場合があるため,次ステップで対処する.pickup: 線分の基点を抽出する手法を選択する. aboveZero: 最も敏感に線分を抽出するがノイズも線分とみなす. bgRoi: プラグイン実行前に指定したROIを背景とみなして 基点抽出の感度を設定する. otsu~fuzzyYager: いずれも自動抽出のアルゴリズム. 予備的な試行では otsu と minErr が良好.
  • 38. 線分強調像 高輝度領域 線分領域高輝度領域を基点として,それに接続する線分強調像の非0領域を抽出するステップ.前ステップとあわせて,ヒステリシス特性のある二値化ともいえる.高輝度領域は前述のように繊維を分断する場合があるため,本ステップで,分断された線分をつなぎなおす.
  • 39. 線分領域 暫定的な線分細線化.各領域を太さ1画素の線分になるまで細くする.このステップで得られる線分には,繊維構造をあらわす線分の他にノイズ由来の線分もある程度は含まれているため,次ステップ以降で対応する.
  • 40. 暫定的な線分 接続 穴埋め切断をうけている線分を接続するステップと,小さな穴を埋めるステップ.
  • 41. 細線化(2度目).各領域を太さ1画素の線分になるまで細くする.直前の穴埋めステップによって線分でなくなっている領域があるため. 穴埋め 枝刈り.線分にはノイズに由来する "ヒゲ"がみられる場合があるので, それらを除去する. shaveLen: "ヒゲ"をノイズ由来と 細線化(2) 枝刈り みなして除去する際の基準長さ. 指定画素数以下の長さの"ヒゲ" は刈りとられる.
  • 42. 短い線分や孤立した点の除去.本ステップまでで線分抽出自体は完了する.delLen: 短い線分をノイズ由来とみなして除去する際の基準長さ. 指定した画素数以下の線分は消される. 枝刈り 最終的な線分
  • 43. Plugins → kbi → Kbi_Filter2d → filter=lineFilters → lineExtract 線分抽出により, 細胞骨格の 長さ,角度,密度, 本数,分岐の数, 分岐の角度,… の測定が可能に なる. 時系列画像の 各フレームについて 行なえば,これらの 時間変化を知る こともできる.
  • 44. 動きの解析
  • 45. スタック画像 時系列画像(動画像,動画,XYT) や,焦点面を変えて撮影した連続 画像(立体画像,XYZ)はともに スタック画像として操作できるが, ZとTの区別が無いことに注意. スタック画像を構成する2次元画像 をスライスとかフレームと呼ぶ. ステータスバーの z=2 はタバコ培養細胞微小管プラス端 「Z座標の値が2」を示す (0から数えている. 0-origin) . 画像情報欄の 3/10 は 表示中のスライスを変更 「全10枚中3枚目」を示す (1から数えている.1-origin).再生 (速度設定: Image - Stacks - Tools - Animation Options...)
  • 46. バンドパスフィルタPlugins - kbi - KbiFilter_2d - bandPassOps... (1, 5)
  • 47. 動き解析のための輝度投影Brightness & Contrast, Image - Type - 8-bit Image - Stacks - Z Project - Max Intensity 最大輝度投影 Plugins - kbi - Kbi_StkFilter - maxHsvProject 輝度投影(疑似色) time
  • 48. 動き解析のための粒子追跡 輝度投影 1スライス目 10スライス目 (疑似色)平均速度:(pixel/slice) T: スライス数
  • 49. 動き解析のためのカイモグラフ最大輝度投影 1スライス目 10スライス目 Plugins - kbi - Kbi_DynProf - kymoStatic 位置 p t 平均速度: (pixel/slice)時間
  • 50. オプティカルフロー
  • 51. 動き解析のためのオプティカルフロー法 Plugins - kbi - Kbi_Flow シロイヌナズナ胚軸表皮 小胞体CSU, EM-CCD, 50 ms * 100 frame Plugins - kbi - Kbi_DynProf - kymoStatic 位置時間
  • 52. 例:オプティカルフローによる小胞体運動の解析
  • 53. 各種ミオシン変異体における小胞体流動 xik-2 mya1-1GFP-h xik-2 xik-1 xik-2 mya1-1 xik-2 mya2-2 mya2-2 scale bar: 10 m Ueda H et al. (2010) PNAS 107: 6984-6899
  • 54. 局在・輝度・輝度分布の解析
  • 55. マルチチャネル像からの局在解析(重ね合わせ) Image - Color - Split Channels, シロイヌナズナ根端 ペルオキシソーム Analyze - Set Scale..., ROI設定, Crop Image - Color - Merge Channels...http://podb.nibb.ac.jp/Organellome/bin/browseImage.php?ID=Image-mano-20060517202055
  • 56. 局在解析のための輝度プロファイル(チャネル毎) Edit - Selection - Restore Selection (E キー), Analyze - Plot Profile (k キー) Ch1(GFP-PTS1) Ch2(PTS2-RFP)
  • 57. 輝度プロファイルは輝度の空間分布を示す GFP-PTS1山の高さは輝度(蛍光)の強さ,山の幅は輝度の広がりを示すが,実際の大きさと関係ないことがある(分解能より小さい場合等)ので要注意.半値全幅(半値幅, FWHM, full width at half maximum) か,正規分布等をフィッティングして,その分散,等で定量する.
  • 58. 局在解析のための輝度プロファイル(マルチチャネル)Edit - Options - Profile Plot Options... (Y軸範囲設定等), Analyze - Plot Profile,Image - Lookup Tables - Red | Green, Image - Lookup Tables - Invert,Image - Type - RGB Color, Process - Image Calculator - Add / 32-bit: falseImage - Color - Merge Channels..., Plugins - Macros - Run... "マクロ"Analyze - Plot Profile, List ボタンから Excel 等へ...
  • 59. 局在解析のための輝度プロファイルの例 (アクチン繊維と液胞膜) Higaki et al. (2006) Plant Cell Physiol 47: 839-852
  • 60. 輝度・構造解析のための輝度プロファイルの例(液胞膜) Uemura et al. (2002) Genes to Cells 7: 743-753.
  • 61. 局在解析のためのチャネル間の輝度の散布図 散布図 GFP-PTS1 0.98 PTS2-RFP LON1-GFP (ミトコンドリア) 0.36 相関係数: Chl + MitoTrackerタバコ培養細胞ミトコンドリア+葉緑体http://podb.nibb.ac.jp/Organellome/bin/browseImage.php?ID=Image-saka_rib.okayama-u.ac.jp-20061221151215
  • 62. ImageJ の主なメニュー項目の紹介
  • 63. File メニュー: ファイルの読み込み・書き込み等 New: 新規作成. System Clipboard で他アプリから画像の 読み込みができる. Open...: 画像ファイル等を開く. Import: 各種フォーマットの 画像ファイル等を開く. Close: 画像ウインドウを閉じる. Save: 画像ウインドウの内容をファイルに 保存する. ※ Save しない限り,ファイルは書き 変わらない. Quit: ImageJ を終了する.
  • 64. Edit メニュー: 画像の切り貼り,描画 Undo: 直前の作業の取消し. 1ステップ限定かつ 一部のみ対応. Cut, Copy, Paste: 画像の切り貼り. 対象は画像全域かROI . Copy to System: 他アプリへのコピー. Clear, Fill, Draw: 単色描画.実際の色は Color Pickerで色は設定. Selection: ROI の制御. (Selection = ROI) Add To Manager: 複数のROI を管理.
  • 65. Image メニュー: 種別,色,スタック,変形,複製等,色々 Type: 輝度タイプの変換. 8-bit, 16-bit, 32-bit, RGB color... Adjust: 表示上の明るさの調整や二値化等. Color: グレイスケール画像とカラー画像の 変換等. Stacks: 時系列画像(動画像),立体画像の 処理.輝度投影,スライス一覧(montage) の作成等. Crop: ROI 部分の切り出し. Duplicate: 画像ウインドウの複製. Rename: 画像ウインドウのタイトル変更. Scale: 画像解像度の変更.つまり画像サイズ の拡大・縮小. ※表示の拡大・縮小と混同しないよう注意.
  • 66. Process メニュー: 基礎的な画像処理(フィルタ等) Find Edges: 輪郭強調. Binary: 2値画像(白黒画像)処理. Math: 加減乗除等による 各画素の輝度変更. Filters: ノイズ抑制等のフィルタ. Image Calculator: 画像と画像の間 の演算. 加減乗除等.
  • 67. Analyze メニュー: 測定やグラフ関係 Measure: ROI 部分の諸パラメタの測定. Analyze Particles...: 粒子解析. Set Measurements...: Measure で測定する パラメタの選択. Set Scale...: 1画素が何 m かを設定する. Histogram: 輝度ヒストグラムの表示. Plot Profile: 輝度プロファイルの表示. 他のメニュー Plugins: プラグイン,マクロ,ショートカット キー設定等. Window: 画像ウインドウ,ログウインドウ等 の一覧や並び換え. Help:ブラウザにウェブ上のマニュアルを 表示する等.
  • 68. まとめ
  • 69. なぜ画像解析をするのか?* 撮影した画像をどのように扱うか,という問題. 典型的な何枚かを原稿に貼り付け,legend を書いて終わり? 定量性,そして客観性. 同じ画像から,解析次第で様々な情報が引き出せる.* 何のために可視化したり撮影するのか,という問題. 可視化,撮像,解析までトータルに考えて実験計画を立てる. 研究者のツールとしての画像解析,という段階へ.
  • 70. もう少し詳しく学ぶには省略したがバイオイメージングで重要な事項 * blur (ボケ) と PSF(点像分布関数, point-spread function). 蛍光ビーズによるPSF測定.blur の影響と対策. * ノイズ,とくにGaussノイズとショットノイズ. 撮像法との関係と,ノイズ抑制の手法. * 背景 (background) 輝度の高さと分布の扱い.参考になる本 田村秀行 (2002) コンピュータ画像処理 オーム社,ISBN-13: 978-4274132643 Burger W & Burge MJ (2007) Digital Image Processing: An Algorithmic Introduction using Java Springer, ISBN-13: 978-1846283796 ※ ImageJ 本.バイオ指向.プラグインの作例が豊富.参考になるサイト 英語なら ImageJ 公式サイトを起点に充実.翻訳??
  • 71. 謝辞* Plant Organelles Database2 で公開されている画像を例として一部で 用いました. Mano S et al. (2008) Nucleic Acids Res 36: D929-D937. http://podb.nibb.ac.jp/Organellome/* 小胞体流動の画像提供と KbiFlow 開発への協力を 下記グループからいただきました. 京都大 理学研究科 西村いくこ先生,嶋田知生先生,田村謙太郎先生,上田晴子先生